心血管疾病的基因治療

丁秋蓉，陳彥好

（中國科學院上海生命科學研究院營養科學研究所，上海200031）

心血管疾病的基因治療

丁秋蓉，陳彥好

（中國科學院上海生命科學研究院營養科學研究所，上海200031）

基因治療在先天遺傳性以及后天獲得性心血管疾病治療中均具有廣闊的發展前景.對心血管疾病致病機理的深入認識和疾病基因組學研究的發展，進一步促進了臨床前基因治療的研究進展.但基因治療過程中存在的機體細胞免疫反應、外源基因表達水平不足、在體基因轉導效率低下等因素都成為基因治療臨床應用轉化的瓶頸.近年來，基因導入載體和基因組編輯技術的發展為上述問題的改善和解決提供了新的思路.目前成族規律間隔短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/Cas9基因組編輯技術已經成功應用于動物模型的在體基因編輯，達到了顯著改善血脂指標的療效.進一步研究體內組織特異和高效的基因導入方式，提高基因編輯的靶向效率和特異性，并建立全面有效的安全評估實驗體系，將推動基因治療向臨床應用的轉化.針對心血管疾病基因治療中基因導入載體的研究以及CRISPR/Cas9基因組編輯技術的應用展開討論.

心血管疾病；基因治療；基因導入載體；CRISPR/Cas9基因組編輯技術

心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）的發生嚴重危害著人類健康，每年有超過1 730萬人死于CVD，占全球死亡總數的31%；并且患病人數呈持續上升趨勢，預計到2030年，全球每年死于CVD的人數將會超過2 360萬［1］.雖然藥物［2］和介入性治療能有效緩解和改善CVD癥狀，但目前仍然迫切需要研發新的治療方法來全面防治心血管疾病的發生.近年來，對CVD發生的致病基因及其分子機制的深入解析［3］，使得通過基因治療手段來調控特定基因表達水平和改善基因分子功能，從而達到防治CVD的策略成為一種可能.目前針對CVD的基因治療方案的研究已取得很多進展，多項研究已經處于臨床試驗階段［4］.基因材料的選擇、體內特定的導入方式、目的細胞類型、靶向基因等是影響基因治療效果的主要方面［5-7］.由于篇幅限制，本工作將針對不同基因載體在CVD基因治療中的研究進行綜述.此外，隨著基因組編輯技術的飛速發展，通過基因組編輯技術直接在體內修復致病突變或者敲除特定基因進行CVD防治的潛在新基因方法也得到廣泛關注，本工作也將就此展開討論.

1　基因治療載體

不同基因治療載體如表1所示，表中AAV表示腺相關病毒（adeno-associated virus）.

表1　不同基因治療載體Table 1 Different gene delivery systems

1.1非病毒載體

非病毒載體導入由于避免了病毒載體潛在的安全隱患而具有獨特的優勢.但由于非病毒載體體內導入效率低下，因而基因治療效果并不十分明顯［8-9］.目前已有多種研究策略用于提高非病毒載體的導入效率：例如相對單獨的DNA導入、脂質體-DNA復合體的形成可以增加DNA穩定性，防止DNA被機體循環迅速清除［10］；而以多聚L-賴氨酸和聚乙烯亞胺等聚合物為基礎的多聚DNA復合體也能夠保護DNA不被核酸酶消化，促進細胞對DNA的攝取［8］.此外，超聲波靶向微泡（ultrasound-targeted microbubbles，UTM）技術作為一種可行的質粒運載技術，具有低毒性和低免疫原性的特點，引起了更多學者的興趣［11］.尤其是在嚙齒類動物模型中，進行冠狀動脈結扎后，利用脂質微泡運輸血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和干細胞因子（stem cell factor，SCF）可以顯著提高心室和心肌灌輸的能力［12］.相似地，在心梗大鼠模型中反復利用UTM運載SCF和干細胞衍生因子1a基因可以實現血管密度的增加、心肌功能的提高和梗死面積的減小［13］.由于UTM沒有明顯的毒性，因此可以很好地適用于將微小RNA（microRNAs，miRNAs）運載入心肌細胞.在體外試驗中，用UTM把miR-133運載到心肌細胞中可以實現心肌肥大的逆轉［14］.非病毒載體所面臨的問題是相對較低的效率和較短的基因表達期，如何將這些研究成果運用到大型動物模型中并最終運用到臨床是目前科學家們面臨的一大挑戰.

1.2病毒載體

病毒載體由遺傳物質和環繞遺傳物質的蛋白質衣殼或脂質囊膜組成.病毒載體通過識別并結合細胞表面的特異性受體進入細胞，最終將治療基因運載到靶細胞中［15］.衣殼和囊膜蛋白可以直接將治療基因轉運到細胞核并保護治療基因不受溶酶體的降解［16］.總體來說，病毒載體的效率比非病毒載體要高，具有長期表達治療基因的潛力.并且，工程化的病毒載體已經剔除了核酸骨架上原有的病毒基因，除了早期的腺病毒載體仍然保留了一些殘余的病毒基因外，其他病毒載體都完全不存在病毒基因，有效避免了病毒基因表達帶來的安全隱患.但是，病毒載體的臨床應用也面臨諸多挑戰［17］，其中之一是機體對病毒載體和基因修飾后細胞發生的免疫反應［18］，這種免疫反應會引起載體二次給藥后的基因轉移受到阻礙，基因體內表達時間縮短，甚至導致基因修飾的細胞被免疫清除.

目前主要的病毒載體包括以下3種.

1.2.1腺病毒載體

腺病毒（adenoviral，Ad）載體是無囊膜包被的、非整合性的雙鏈DNA載體.Ad載體主要通過與柯薩奇-腺病毒受體（Coxsackie-adenovirus receptor，CAR）結合，由網格蛋白介導的內吞作用進入細胞，并隨后將雙鏈DNA運送到細胞核.Ad載體可以在大多數分裂和非分裂的細胞中高效轉導外源基因，包括心肌細胞、骨骼肌細胞和平滑肌細胞等［19-21］.Ad載體感染心臟細胞后轉導基因的表達能力很強，但是表達的持續時間較短（1～2周）［22-23］，限制了Ad載體在CVD中的應用.然而在缺血性心臟病［24］、外周動脈閉塞性疾病和肢體缺血［25］等疾病中，利用Ad載體能夠短期促進血管生成，起到很好的治療作用.Ad載體的一個主要缺點是會引發機體的炎癥反應，繼而影響Ad載體在臨床試驗中的導入效率和安全性［26-27］.尤其在早期的Ad載體中，由于依然殘留Ad病毒基因，從而在體內觸發T細胞介導的免疫反應，使得基因修飾后的細胞被機體大量清除.最新一代的Ad載體通過清除載體中所有殘留的Ad基因，降低了T細胞介導的免疫反應［28］，但仍然會迅速激活先天免疫系統，造成顯著的劑量限制性毒性［29］.雖然通過導管介導的心肌內局部載體運輸可以大大降低這種風險［30］，但是與免疫系統激活相關的潛在風險依然存在［31］，因此在人體中最終運用Ad載體進行基因治療還需要進一步仔細評估.

1.2.2腺相關病毒（AAV）載體

AAV載體是一種單鏈DNA載體，具有良好的安全性，被認為是目前最具臨床應用前景的病毒載體.AAV載體能夠在包括心臟組織的在內的多種組織中持續表達轉導基因［32-33］.與Ad載體相比，AAV載體引起的機體炎癥反應較弱，而這一優勢讓AAV載體在心臟疾病的基因治療方面引起人們的廣泛關注.目前已經發現了超過100種不同血清型的AAV載體［34］.不同血清型的AAV由于獨特的衣殼蛋白結構而表現出了獨特的組織感染特異性［3］，如AAV1，AAV6，AAV8和AAV9被認為是具有較高心臟特異性的血清型［35］，主要用來感染心肌細胞，但是它們感染其他心臟細胞的能力（如心臟中成纖維細胞）還沒有被系統評估.目前已經證明至少在小鼠中，AAV9是感染心臟細胞最有效的血清型［33，36-37］.近期的研究利用小鼠模型報道了在單劑量靜脈注射后，AAV9比AAV1增加了超過200倍的心肌轉導效率［37］，這證明了AAV9在心臟中轉導基因的優越性.

1.2.3慢病毒載體

典型的慢病毒（lentivirus，LV）載體起源于Ⅰ型人類免疫缺陷病毒［38］.LV載體是囊膜單鏈RNA載體，可以將自身基因組逆轉錄成互補DNA，并穩定整合到分裂和非分裂細胞的染色體上，因此LV載體非常適用于長期表達治療基因［39］.LV載體已經被成功運用于治療單基因造血障礙癥，并且獲得了長期穩定的治療效果［40-41］.但由于LV載體體內感染心肌細胞的效率相對較低，因而限制了其在CVD治療中的應用.這可能受到物種、年齡或導入方式等多種因素影響［42］.因為LV載體可以將外源基因整合到靶細胞基因組上，存在觸發插入癌變的內在風險，所以其安全性一直備受關注［43］，但是這種風險也許可以通過優化載體的設計和靶細胞的類型來降低.

2　基于CRISPR/Cas9基因組編輯技術的基因治療方案

2.1CRISPR/Cas9簡介

成簇規律間隔短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/Cas系統作為近年來發展迅速的新一代基因組編輯工具，由于其易于載體構建、靶向位點選擇靈活、基因組編輯效率高，已成為潛在的用于基因治療的新方案［44-46］. CRISRP/Cas系統中的Cas9和單鏈向導RNA（single guide RNAs，sgRNAs）復合體可以特異識別特定目標基因組序列，進行切割后形成DNA雙鏈斷裂（DNA double-stranded break，DSB）.細胞繼而通過非同源末端接合（non-homologous end-joining，NHEJ）或同源模板修復（homology-directed repair，HDR）對斷裂DNA進行修復.利用這一生物學過程，研究人員可以：①通過在基因編碼區引入移碼突變對致病突變基因進行靶向敲除；②通過外源模板（單鏈或雙鏈DNA）對致病基因突變進行定點修復；③通過同時靶向多個位點引入染色體結構變異，包括染色體區域缺失（deletion）、插入（insertion）、重復（duplication）、易位（translocation）和倒位（inversion）等，對染色體結構變異引起的遺傳疾病進行針對性修復［47］.相對于傳統的化合物、單抗、RNAi以及基于基因過表達的基因治療方案，基于基因組編輯技術的基因治療方案由于可以從根本上修改基因組遺傳信息，因此可能達到通過一次治療徹底治愈疾病的療效.

2.2體內導入載體

腺病毒載體能夠在體內細胞中高效轉導外源治療基因，可以作為運載CRISPR/Cas9的備選載體.但如前所述，腺病毒存在較高的免疫原性，以及潛在基因組整合風險，是否能安全用于臨床仍有待評估.相比之下，AAV載體由于其低免疫原性、低整合風險，以及基于特有血清型的較高組織特異性，在臨床應用中具有較高的安全性，是CRISPR/Cas9系統體內導入的潛在載體.但是AAV載體能包裝的外源DNA較小（約4.8 kb），而目前常用的Cas9核酸內切酶為來源于釀膿鏈球菌的SpCas9（Streptococcus pyogenes Cas9），大小約為4.2 kb，加上啟動子、polyA終止序列，以及sgRNAs表達框，已遠遠超過了AAV載體的裝載上限.解決該問題主要有兩種策略：一種是將SpCas9進行功能域拆分，分別包裝入2個AAV病毒，同時感染細胞后行使靶向切割功能；另一種是尋找新的分子量較小的Cas9核酸內切酶.Ran等［48］從金黃色葡萄球菌中篩選出分子量約為3.2 kb的相對較小的SaCas9（Staphylococcus aureus Cas9），能成功包裝入AAV載體（見圖1），從而進行有效的在體細胞編輯.圖1中的ITR為末端反向重復序列（inverted terminal repeat）；LP1為肝臟特異啟動子（liver specific promoter 1）；NLS為核定位序列（nuclear localization sequence）；pA為多聚腺苷酸（poly A）.此類載體目前已被成功用于肝臟和肌肉組織的在體基因編輯［48-51］.此外，研究人員也在嘗試利用脂質納米載體（lipid nano particle）的非病毒載體方式進行Cas9信使RNA（messenger RNAs，mRNAs）的在體導入，協同AAV載體介導的sgRNAs和同源修復模板導入，可以針對小鼠肝臟細胞的致病突變進行一定比率的在體修復［52］.

圖1　AVV-SaCas9用于潛在的基因治療Fig.1 AVV-SaCas9 for potential gene therapeutics

2.3靶向基因

基于基因組編輯技術的基因治療方案期望從根本上改善基因組遺傳信息，從而達到治療效果.該技術對基因組遺傳信息的改變是永久性的，因而靶向基因的選擇尤為重要，基因信息的改變可能導致的副作用也需要進行充分評估.

本工作認為可作為基因組編輯治療CVD的靶向基因或者基因組位點大致可以分為兩大類.一類是誘發心血管疾病的遺傳突變基因位點，這類突變大多會導致先天性心臟病的發生，利用CRISPR/Cas9技術進行在體基因突變修復是一種潛在的基因治療方案.如長QT綜合征（long QT syndrome，LQTS）是一種常染色體顯性遺傳先天性心臟病，多個基因的雜合突變均可能導致LQTS，其中一些基因突變位點和分子機制已經相對清晰，如編碼鉀離子電壓門控通道的成孔亞基α蛋白的hERG基因突變.hERG基因主要在心肌、平滑肌等細胞類型中表達和行使功能，其突變會引發致命性的室性心律失常［53］，利用CRISPR技術在體靶向修復心肌細胞中的hERG基因突變，可能成為治療此類LQTS的一種有效策略.遺憾的是，由于目前利用CRISPR基因組編輯技術誘發同源重組進行點突變修復的效率仍然相對低下，且CRISRP技術在體導入心肌細胞的方式和效率也有待進一步摸索，因而此類研究仍處于初期探索階段，尚未見相關報道.

另一類潛在的基因靶點同樣來自人類遺傳學研究，和上述致病基因突變位點不同的是，此類突變對心血管系統具有明顯的保護作用.如PCSK9基因無義突變攜帶者血液中低密度膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平與正常人相比顯著降低（一個等位基因的突變對應血液LDL-C含量降低30%～40%）［54-55］；APOC3基因無義突變攜帶者血液中甘油三酯（triglyceride，TG）含量與正常人相比顯著降低（一個等位基因突變對應血液TG含量降低約40%）［56］；兩種突變同時攜帶者的心臟病發病率比正常人降低80%以上，并且臨床其他各項生理指標正常，提示抑制PCSK9和APOC3基因表達可以作為防治心血管疾病的潛在治療方案.由于這兩種基因主要在肝臟細胞中表達，一種設想是通過基因組編輯技術直接在體靶向肝臟細胞中的APOC3或者PCSK9基因，引入無義突變，繼而從根本上抑制蛋白合成，達到長期穩定的治療效果.作為驗證性實驗，已有研究通過腺病毒［7］或者AAV［48］在體導入CRISPR直接靶向小鼠肝臟的PCSK9基因，發現一次導入便能引起血液中分泌的PCSK9蛋白和血液膽固醇含量明顯下降，提示該治療方案的可行性.

2.4脫靶效應

由于基于基因組編輯技術的基因治療方案可以從根本上改變基因組信息，非預期基因的永久性突變可能帶來嚴重的副作用，因而對該方案可能存在的脫靶效應的全面評估顯得尤為重要.關于CRISPR/Cas9技術可能存在的脫靶效應，研究人員進行了充分的研究和評估，結果表明影響脫靶效應高低的因素主要包括靶向DNA序列、Cas9在細胞內的表達時間和強度、靶向細胞類型等.目前已經研發出多種方法來降低CRISPR脫靶率，最常見的是對Cas9蛋白的改造，如將FokⅠ內切酶融合到無催化活性的dCas9蛋白上，以增加DNA識別特異性［57］.同時，也可以通過優化sgRNAs序列設計、構建特異性表達啟動子、利用非病毒載體降低表達時間等方式來進一步降低CRISPR的脫靶率.

值得一提的是，脫靶率的檢測結果受檢測方法敏感性和全面性的影響，現有的認識還不足以對具體的CRISRP靶向可能存在的脫靶效應作出準確預測，因而對CRISRP用于臨床基因治療可能存在的脫靶效應，需要有針對性地在所采用的具體靶向體系設置（如特定靶向DNA序列、靶向細胞、靶向導入方式等）中進行全面檢測.由于臨床前實驗往往不能在人體中進行，基于人源小鼠的在體實驗可以作為一個實驗體系檢測CRISRP體內靶向人類細胞的特異性和靶向效率，如大于70%的肝臟組織為人類肝臟細胞重建而成的肝臟人源小鼠可以被用于檢測CRISPR在體靶向人肝臟組織中PCSK9基因的效率和可能存在的脫靶效應［58］，繼而對其向臨床的轉化作出更直接的評估.此外，全面的無偏向性的脫靶位點檢測體系的建立也至關重要.如GUIDE-seq（genome-wide，unbiased identification of DSBs enabled by sequencing）體系可以通過捕獲插入DSBs的雙鏈寡核苷酸在全基因組范圍內檢測CRISPR導入后誘發的DSBs，以此評估CRISPR的脫靶效應［59］.

3　展望

隨著心血管疾病病理分子生物學、人類遺傳學、合成生物學等多學科的快速發展，研究人員有望鑒定出新的有效靶向基因，研發出更安全的基因載體用于心血管疾病的基因治療.同時，基因組編輯技術提供了一種新的潛在的基因治療方案，可有針對性地提高該技術序列靶向效率和特異性，尋找體內組織和細胞特異、高效的導入方式，以及建立全面有效的安全評估實驗體系，這將實際推動基因治療向臨床應用的轉化.

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Gene therapy for cardiovascular disease

DING Qiurong，CHEN Yanhao
（Institute for Nutritional Sciences，Shanghai Institutes for Biological Sciences，Chinese Academy of Sciences，Shanghai 200031，China）

Gene therapy shows great promise in the treatment of both inherited and acquired cardiovascular diseases.Identification of key molecule players in pathophysiology of cardiovascular disease and development of human disease genomic research lead to encouraging preclinical gene therapy studies in animal models.However，the presence of cellular immune responses，insufficient gene expression level and overall limited in vivo gene transduction efficiencies have hampered the translational progress to clinical use of gene therapy.In recent years，improvements in gene delivery system and discovery of advanced genome editing technologies open new therapeutic perspectives，with clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISRP）/Cas9 genome editing technology already being successfully used in animal models to treat hypercholesterolemia.Further improvement in gene delivery efficiency，increase in targeting specificity of genome editing tools，and establishment of experimental systems for a thorough analysis of potential safety problems would help eventually bring gene therapy for heart disease to reality.In this review，recent advances in the use of different delivery vectors and CRISPR/Cas9 genome editingtechnology in gene therapy research to treat cardiovascular diseases are discussed.

cardiovascular disease；gene therapy；gene delivery vector；CRISPR/Cas9 genome editing technology

Q 789

A

1007-2861（2016）03-0270-10

10.3969/j.issn.1007-2861.2016.03.013

2016-04-19

上海市浦江人才計劃資助項目（15PJ1409200）

丁秋蓉（1981—），女，教授，博士生導師，博士，研究方向為干細胞與轉化醫學. E-mail：qrding@sibs.ac.cn