循環血miR-21-3p作為膿毒癥心肌病的標記物

劉慧，王惠，史倞，孔祥清

（南京醫科大學第一附屬醫院心臟科，南京210029）

循環血miR-21-3p作為膿毒癥心肌病的標記物

劉慧，王惠，史倞，孔祥清

（南京醫科大學第一附屬醫院心臟科，南京210029）

已有研究發現微小RNA（microRNAs，miRNAs）可由細胞分泌并釋放進入循環系統，在血清、血漿、尿液和其他體液中穩定存在，并可作為非損傷性生物標記物對多種疾病進行早期診斷、鑒別分期、預后判斷和療效監測等.與健康對照者相比，miR-21-3p在22例膿毒癥心衰患者血漿中顯著升高.通過繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，并分析其與臨床參數的相關性發現，miR-21-3p在鑒別膿毒癥心衰和健康人群時，曲線下面積（area under the curve，AUC）為0.949.相關性分析結果顯示，血漿miR-21-3p水平與B型腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）（r=0.968，P＜0.001）、心肌肌鈣蛋白T（cardiac troponin T，cTNT）（r=0.257，P=0.002）水平呈正相關.因此，外周血中的miR-21-3p有作為膿毒癥心肌病的生物標記物的潛力.

膿毒癥心肌??；miR-21-3p；循環miRNA

敗血癥休克是臨床上最常見的急危重癥，由于至今仍缺乏療效高、副作用小的治療方法，因此導致其死亡率較高［1］.細菌感染是膿毒癥休克最常見的病因，細菌中的內毒素、外毒素以及細菌外壁成分——脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可以刺激相應靶細胞如單核細胞、多形核中性粒白細胞或內皮細胞等，進而啟動炎癥進程，產生一系列促炎細胞因子（proinflammtory cytokine）［2］.盡管經過10年醫療的不斷進步，膿毒癥卻仍因病情進展迅速、臨床救治困難，而成為危重病人死亡的重要原因［3］.在膿毒癥早期心血管功能即可發生變化，且與患者預后密切相關，膿毒癥并發心血管功能障礙被普遍稱為膿毒性心肌?。╯epsis-induced cardiomyopathy，SIC）［4-5］.一旦出現心血管并發癥，心功能障礙又會加劇膿毒癥病情，導致死亡率顯著上升，因此膿毒癥心功能不全是重癥監護室重點監控疾病［6-7］.膿毒癥臨床治療措施中很難通過評估膿毒癥對心臟、血管、微循環的影響來判斷預后.

本課題組前期研究發現，miR-21-3p的表達水平在LPS誘導的膿毒癥心肌病中升高，并會加重小鼠的心肌功能障礙，因此本研究旨在探索miR-21-3p是否具有膿毒癥心肌病相關生物標記物的診斷潛力，并進一步驗證其與臨床參數的相關性.

1　材料與方法

1.1標本的收集

所有血液樣本來自南京醫科大學第一附屬醫院，包括膿毒癥心衰患者22例，健康對照者18例.血液樣本的使用已取得患者同意.膿毒癥患者在收治入院的24 h內抽取血液樣本，2 mL外周血經乙二胺四乙酸（ethylenediaminetraacetic acid，EDTA）抗凝后立即在室溫條件下于1 500 g離心力離心15 min，輕輕吸取上清即血漿，移入RNA-Free的EP管中，并于-80°C保存.

1.2血漿RNA的提取

利用Ambion試劑盒提取血漿中的RNA，具體實驗步驟參照試劑盒說明書進行.RNA的純度和濃度采用Nanodrop ND2000分光光度計（Thermo Fisher Scientific）進行檢測.

1.3qRT-PCR的檢測

血漿中miRNA的逆轉錄和后續的定量檢測采用Bio-Rad公司的miRNA qRT-PCR Detection Kit.miRNA引物購自廣州市銳博生物科技有限公司，SYBR Green染料購自美國Bio-Rad公司，在Eppendorf公司Mastercyclerrealplex Real-Time PCR 7900儀器上進行熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測.10μL反應體系如下：Power SYBR Green 5μL，正向引物（10μmol/L）0.5μL，反向引物（10μmol/L）0.5μL（具體序列見表1），cDNA模板0.5μL，去離子水3.5μL.熒光定量PCR具體步驟如下：①95°C 3 min；②95°C 15 s，60°C 30 s，72°C 30 s，本步驟重復40個循環；③反應結束后溶解曲線先加熱到95°C，后降至60°C，在20 min內再緩慢升溫至95°C，持續15 s，記錄熒光信號的變化.熒光定量PCR均重復3次.

1.4統計學分析

兩組血漿中miRNA表達水平差異、與臨床資料的相關性及診斷價值的評估采用Graph-Pad Prism 5軟件進行統計分析，并進行受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線的繪制和曲線下面積（area under the curve，AUC）的計算，以評估目的miRNA的診斷價值，最后通過計算Youden指數（Youden's index）來選擇最佳界值（cutoff value）.

2　結果與分析

2.1目的miRNAs檢測

本課題組前期研究數據顯示，miR-21-3p的表達水平在LPS誘導的膿毒癥心肌病中升高，并會加重小鼠的心肌功能障礙，因此對22例膿毒癥心衰患者和18例健康對照者血漿中miR-21-3p的表達水平進行檢測.qRT-PCR結果顯示：miR-21-3p的表達水平在膿毒癥心衰患者中顯著升高，P＜0.001（見圖1）.

圖1　miR-21-3p在膿毒癥心衰患者和健康對照者血漿中的表達水平對比Fig.1 Plasma levels of miR-21-3p in septic patients with cardiac dysfunction compared with healthy controls

2.2ROC曲線分析

為了進一步評估miR-21-3p作為診斷膿毒癥心肌病標記物的價值，本研究利用GraphPad Prism 5軟件繪制了ROC曲線，同時計算其AUC，并選擇最大Youden指數作為膿毒癥心肌病標記物的界值.結果顯示，目的miRNAs在區別膿毒癥心肌病患者和健康人群時有一定的診斷價值.為了驗證目的miRNAs在所有樣本中鑒別膿毒癥心肌病患者的水平，對所有樣本進行ROC曲線的繪制，結果發現miR-21-3p曲線下面積為0.949，靈敏度、特異度、AUC均較高，表現出較高的診斷價值（見圖2，P＜0.05）.

圖2　ROC曲線Fig.2 ROC curves

2.3miRNAs血漿表達水平與患者臨床資料相關性分析

與表1臨床資料結合作進一步分析，按臨床參數分組對miR-21-3p表達水平進行驗證，表1中，WBC代表白細胞（white blood cell），CRP代表C反應蛋白（C-reactive protein），PCT代表降鈣素原（procalcitonin），NT-proBNP代表N末端B型腦鈉肽前體（N-terminal of the prohormone brain natriuretic peptide），cTNT代表心肌肌鈣蛋白T（cardiac troponin T）.Spearman秩相關性分析結果如表2所示，可見miR-21-3p表達水平與血漿中的BNP（r=0.968，P＜0.001）、cTNT（r=0.257，P=0.002）表達水平呈正相關.但miR-21-3p的表達水平與WBC，CRP及PCT無關.

表1　膿毒癥心功能不全患者與健康對照臨床資料Table 1 Clinical characteristics of sepsis patients with cardiac dysfunction and health control

表2　血漿中miR-21-3p與患者臨床資料之間的相關性Table 2 Correlation analyses between plasma miR-21-3p and clinical data

3　討論

本研究結果表明，循環miR-21-3p能夠作為診斷膿毒癥心肌功能障礙的生物標記物，有較好的特異度、靈敏度，也具有較好的診斷價值.隨著本研究的深入，發現如下現象：①miR-21-3p表達水平在膿毒癥心衰患者血漿中顯著升高；②繪制ROC曲線人群鑒別時，通過相關性分析發現血漿miR-21-3p表達水平靈敏度、特異度、AUC較高，表現出較高的診斷價值，提示這種miRNA在膿毒癥導致的心功能轉變過程中可能發揮重要作用.

近期研究發現，循環中的miRNA有著作為膿毒癥早期診斷標記物的潛力.已有報道指出，在膿毒癥患者外周血中miR-146a和miR-223的表達水平明顯下降，可將膿毒癥與其他非感染性引起的全身炎癥反應綜合癥區分開［8-9］.miR-150與細菌感染和炎癥反應密切相關，Roderburg等［10］在膿毒癥病人的血清中檢測到miR-150表達水平降低，并提示不良預后.為了進一步研究循環miRNA作為膿毒癥生物標記物的潛在價值，研究者在小鼠盲腸結扎穿刺模型中進行miRNA篩查，發現miR-16，miR-17，miR-20a，miR-20b，miR-26a，miR-26b，miR-106a，miR-106b，miR-195和miR-451表達水平升高.提取exosome后發現，miR-16，miR-17，miR-20a，miR-20b，miR-26a和miR-26b表達水平在exosome中顯著升高，提示循環miRNAs可能存在于體液的exosome中，并穩定存在［11-12］.相似地，Tacke等［13］在動物模型中篩選并發現了miR-133a，miR-150，miR-155，miR-193b表達水平的變化，并在膿毒癥和非膿毒癥患者血液中進行驗證，發現miR-133a表達水平的升高與細菌感染炎癥相關.除了miR-133a，近期研究還證實了miR-574-5p作為膿毒癥生物標記物有一定的診斷價值［14］.

目前，對于miR-21-3p在膿毒癥心肌病中的作用知之甚少.近期研究發現miR-21-3p的表達水平在LPS誘導心肌功能障礙中升高，并通過影響心肌收縮、自噬影響心臟功能［15］.這種miRNA在敗血病的發展過程中，由心臟組織釋放進入血液循環，穩定地存在并表達，為在外周血中檢測循環miRNA從而篩查膿毒癥心肌病提供了可能.

本研究發現并證實了miR-21-3p具有作為膿毒癥心肌病生物標記物的潛力，具有較高的靈敏度、特異性.本研究納入22例SIC患者血漿樣本，并且所得數據顯示出了較好的診斷價值趨勢，但還有待更大樣本量的實驗來進一步證實.本研究探索了無創性診斷膿毒癥心肌病的標記物領域，為后續更大范圍和規模的研究提供了重要的參考.

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Circulating miR-21-3p as biomarkers for sepsis-induced cardiomyopathy

LIU Hui，WANG Hui，SHI Jing，KONG Xiangqing
（Department of Cardiology，First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China）

Recently，microRNAs（miRNAs）are found to be abundantly present in body fluids including plasma and serum，and called circulating miRNAs.Increasing evidences suggest that circulating miRNAs may be useful as stable blood-based biomarkers in sepsis. Serum miR-21-3p is significantly increased in septic patients compared with healthy controls.Receiver operating characteristic（ROC）curve analyses suggest that these plasma miR-21-3p may be useful biomarkers for discriminating patients with sepsis-induced cardiomyopathy（SIC）from healthy controls.miR-21-3p yields the ROC area under the curve（AUC）of 0.949.Further analyses indicate that the expression level of miR-21-3p is correlated with the brain natriuretic peptide（BNP）（r=0.968，P＜0.001）and cardiac troponin T（cTNT）level（r=0.257，P=0.002）.Serum miR-21-3p may serve as new biomarkers for sepsis with high specificity and sensitivity.

sepsis-induced cardiomyopathy（SIC）；miR-21-3p；circulating miRNAs

R631

A

1007-2861（2016）03-0366-05

10.3969/j.issn.1007-2861.2016.03.019

2016-04-22

國家自然科學基金資助項目（81570247）

孔祥清（1966—），男，教授，主任醫師，博士生導師，博士，研究方向為先天性心臟病介入治療.

E-mail：xiangqingkong nj@163.com