高效液相色譜法測(cè)定澳洲堅(jiān)果青皮中的4種酚類物質(zhì)

劉秋月 葉麗君 黃文燁 黃雪松

摘 要 為開發(fā)利用澳洲堅(jiān)果青皮，采用高效液相色譜法（HPLC）研究其對(duì)羥基苯甲醇、3，4-二羥基苯甲酸、對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)羥基苯甲醛的測(cè)定方法和含量。結(jié)果表明，澳洲堅(jiān)果青皮中，4種多酚的最佳測(cè)定條件為：以1% 乙酸水溶液和甲醇為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0 min，87% A；5 min，85% A；25～30 min，60% A），檢測(cè)波長260 nm，流速0.8 mL/min。并測(cè)得青皮中對(duì)羥基苯甲醇、3， 4-二羥基苯甲酸、對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)羥基苯甲醛的含量分別為（1.3±0.12）、（0.19±0.001）、（0.046±0.003）、（0.15±0.00 9）mg/g。該方法簡單、高效、實(shí)用。

關(guān)鍵詞 澳洲堅(jiān)果 ；對(duì)羥基苯甲醇 ；3，4-二羥基苯甲酸 ；對(duì)羥基苯甲醛 ；對(duì)羥基苯甲酸 ；青皮

中圖分類號(hào) S664.9 ；TQ245.6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.07.021

澳洲堅(jiān)果（Macadamia ternifolia F. Muell）又名昆士蘭果、昆士蘭栗、澳洲胡桃、夏威夷果等[1]，因其果仁風(fēng)味獨(dú)特、營養(yǎng)豐富而被譽(yù)為“干果皇后”。隨著我國農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，我國澳洲堅(jiān)果近年來獲得空前發(fā)展，種植面積已近4萬hm2[2]，年產(chǎn)干果近萬噸，除果仁直接食用、少量果殼（種皮）制作木炭外[3-5]，其綠色的果皮（俗稱青皮，占整果鮮重的45%～60%）僅有極少量用作漚肥或飼料，絕大部分被丟棄，亟需開發(fā)利用。

研究表明，澳洲堅(jiān)果果仁中含有酚類酸、維生素E、甾醇等抗氧化活性成分[6-9]；蘆燕玲等[10]用萃取和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分離鑒定出澳洲堅(jiān)果殼中含有酸類；張明楷等[11]對(duì)6種澳洲堅(jiān)果青皮中的單寧含量進(jìn)行了測(cè)定。根據(jù)植物化學(xué)成分分析，澳洲堅(jiān)果皮中應(yīng)含有大量多酚類物質(zhì)，需要首先研究其化學(xué)成分，以便有針對(duì)性地開發(fā)利用。施蕊等[12]報(bào)道澳洲堅(jiān)果青皮中含有熊果苷、豆腐果苷等化學(xué)成分，但這不足以解釋其具有殺菌、抗氧化等多種生物活性。本研究課題組從澳洲堅(jiān)果青皮中分離得到晶體狀態(tài)的3，4-二羥基苯甲酸、對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)羥基苯甲醛和對(duì)羥基苯甲醇4種酚類化合物（鑒定結(jié)果將另文發(fā)表），這4種酚類物質(zhì)都有一定抗氧化或殺菌的作用，即它們可以部分地解釋澳洲堅(jiān)果青皮具有防腐殺菌和抗氧化[13]等功能與活性。

本研究旨在建立一種快速、準(zhǔn)確測(cè)定澳洲堅(jiān)果青皮中4種酚類物質(zhì)的HPLC分析方法，以為該資源的進(jìn)一步開發(fā)、利用、產(chǎn)品的質(zhì)量控制等提供可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

澳洲堅(jiān)果果實(shí)，由廣西南亞熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所王文林老師課題組饋贈(zèng)。

1.1.2 主要儀器及試劑

本研究使用的主要儀器：Shimadzu LC-20AT高效液相色譜儀及配套SPD-M20A光電二極管陣列檢測(cè)器（DAD）（日本島津公司）；3，4-二羥基苯甲酸、對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)羥基苯甲醇、對(duì)羥基苯甲醛標(biāo)準(zhǔn)品（AR級(jí)，阿拉丁試劑有限公司）；冰乙酸（AR級(jí)，天津化學(xué)試劑一廠）；甲醇（HPLC級(jí)，歐普森試劑有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

取自然干燥的澳洲堅(jiān)果青皮磨成粉末，用70%的乙醇提取3次，合并提取液，50℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，乙醇定容至50 mL，過0.45 μm濾膜，待測(cè)。

1.2.2 色譜條件的優(yōu)化

通過掃描得到流動(dòng)相和各單體酚類物質(zhì)在紫外光區(qū)的最大吸收波長，選擇能同時(shí)測(cè)定以上4種酚類物質(zhì)、又能避開溶劑吸收的適宜波長。流動(dòng)相、流速、洗脫方式等都會(huì)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)能否單獨(dú)出峰不受其它雜質(zhì)干擾造成影響，進(jìn)而影響樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)比，無法進(jìn)行定性測(cè)定。通過調(diào)整流動(dòng)相體系、梯度洗脫比例和流速、改變進(jìn)樣量等獲得快速分離測(cè)定目標(biāo)物質(zhì)的最優(yōu)條件。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取標(biāo)準(zhǔn)品3，4-二羥基苯甲酸、對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)羥基苯甲醛，對(duì)羥基苯甲醇100 mg，分別用甲醇定容至10 mL，得到每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的單標(biāo)儲(chǔ)備液。

分別移取50、100、150、200、250 μL 3，4-二羥基苯甲酸、對(duì)羥基苯甲醛的標(biāo)準(zhǔn)溶液，20、30、40、50、60 μL對(duì)羥基苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和4、6、8、10、12 μL對(duì)羥基苯甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇定容至50 mL，得到不同梯度的酚類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度重復(fù)進(jìn)樣6次，以各單體酚的平均峰面積（y）與標(biāo)準(zhǔn)溶液中物質(zhì)的濃度（x）做校準(zhǔn)曲線，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

1.2.4 檢測(cè)限和定量限

將一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋，進(jìn)樣，當(dāng)信噪比等于3時(shí)，所對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液中所含組分的量為最低檢測(cè)限；當(dāng)信噪比等于10時(shí)，所對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液中所含組分的量為定量限。

1.2.5 加標(biāo)回收測(cè)定

已知酚類物質(zhì)含量的青皮提取液中，定量添加各酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，平行制備6份，并精確吸取10 μL進(jìn)樣，計(jì)算各酚類物質(zhì)的加標(biāo)回收率。

1.2.6 重復(fù)性和儀器精密度測(cè)定

按上述方法重復(fù)制備6份樣品進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），檢測(cè)方法的重復(fù)性。 同一樣品分3 d進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每天精確進(jìn)樣10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，分別計(jì)算日內(nèi)和日間峰面積RSD值，比較日內(nèi)和日間儀器的精密度。

1.2.7 樣品穩(wěn)定性測(cè)定

取同一樣品室溫下放置，并于樣品制備后的0、2、4、8、12、16、24、36、48 h進(jìn)樣，每次進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 檢測(cè)波長的選擇

對(duì)4種酚類標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行全波長掃描，得到其在紫外光區(qū)的吸收?qǐng)D譜（圖1），由此得到各單體酚類物質(zhì)的最大吸收波長（表1），為了能同時(shí)測(cè)定這幾種物質(zhì)又能減少溶劑的影響，最終確定檢測(cè)波長為260 nm。

2.1.2 流動(dòng)相的選擇

分別嘗試用1%乙酸水溶液-乙腈和1%乙酸水溶液-甲醇作流動(dòng)相，當(dāng)流動(dòng)相含有乙腈時(shí)，即使含量較少，出峰時(shí)間也比較早，且4種酚類物質(zhì)峰分離效果不佳；當(dāng)流動(dòng)相含有甲醇，且含量較低時(shí)，峰形則大大改善（圖2），故改用甲醇和1%乙酸水溶液作為流動(dòng)相。

2.1.3 流速的選擇

實(shí)驗(yàn)采用0.5、0.8、1.0 mL/min 3個(gè)流速，見圖3。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，流速為0.5 mL/min時(shí)，分離效果好，但耗時(shí)較長；流速為1 mL/min時(shí)，用時(shí)短，但前2個(gè)峰出峰時(shí)間十分接近且最后的對(duì)羥基苯甲醛有肩峰，分離效果不佳；流速為0.8 mL/min時(shí)，可以在30 min內(nèi)把4種酚類物質(zhì)較好地分開。

2.1.4 色譜條件的最終確定

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)，確定了澳洲堅(jiān)果青皮4種酚類物質(zhì)的HPLC測(cè)定條件，進(jìn)樣量為10 μL，柱溫箱為40℃，且為了縮短檢測(cè)時(shí)間，采用濃度梯度洗脫，逐漸加大甲醇含量，以達(dá)到良好的分離效果，其梯度洗脫程序見表2。在此條件下得到了4中多酚混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜圖和樣品溶液的液相色譜圖（圖4）。

從圖4-B可以看出，對(duì)羥基苯甲醇、3，4-二羥基苯甲酸、對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)羥基苯甲醛4種物質(zhì)均可以在相應(yīng)的標(biāo)樣圖4-A上予以確認(rèn)（即據(jù)保留時(shí)間相同的原則予以定性鑒定）；另外，我們還比較了它們的紫外可見光譜也是一致的，這與原有鑒定結(jié)果一致（資料未發(fā)表）。因此，用該方法定性測(cè)定澳洲堅(jiān)果青皮中的上述4種酚類物質(zhì)是可行的。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測(cè)限

按上述色譜條件測(cè)得4條標(biāo)準(zhǔn)曲線，r值均高于0.99，所以得到的線性方程能滿足實(shí)驗(yàn)條件，其線性方程、檢測(cè)限等見表3。

2.3 加標(biāo)回收率

加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果見表4，結(jié)果顯示，4種酚類物質(zhì)的回收率在99%～102%。

2.4 重復(fù)性

按上述方法對(duì)樣品6次進(jìn)樣，計(jì)算對(duì)羥基苯甲醇、3，4-二羥基苯甲酸、對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)羥基苯甲醛的峰面積RSD值分別為0.6%、0.1%、1.5%、0.4%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 精密度

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算第一天對(duì)羥基苯甲醇、3，4-二羥基苯甲酸、對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)羥基苯甲醛的峰面積RSD分別為：1.7%、0.7%、2.4%、0.3%；第二天各種組分的峰面積RSD分別為：2.2%、1.2%、2.0%、0.3%；第三天各種組分的峰面積RSD分別為：1.9%、0.3%、1.8%、0.3%。均小于3%，表明日內(nèi)儀器精密度良好；日間比較各組分的峰面積RSD為：1.8%、1.0%、2%、0.4%，表明儀器的日間精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性

不同時(shí)間進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算對(duì)羥基苯甲醇、3，4-二羥基苯甲酸、對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)羥基苯甲醛的峰面積RSD值分別為1.9%、1.0%、3.3%、1.0%，表明供試樣品在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 樣品的測(cè)定

按上述方法制備樣品并進(jìn)行色譜分析，測(cè)定3次取平均值，測(cè)得干燥的澳洲堅(jiān)果青皮中對(duì)羥基苯甲醇、3，4-二羥基苯甲酸、對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)羥基苯甲醛的含量分別為（1.3±0.12）、（0.19±0.001）、（0.046±0.003）、（0.15±0.009）mg/g。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

酚類化合物的研究對(duì)澳洲堅(jiān)果青皮的開發(fā)利用、尤其是開發(fā)具有防腐殺菌、抗氧化功能保健食品、漱口水等具有重要意義，目前澳洲堅(jiān)果青皮中的酚類物質(zhì)還未見報(bào)道，本研究所鑒定的4種酚類物質(zhì)在其它物質(zhì)中也未見同時(shí)報(bào)道。

在樣品前處理簡單、雜質(zhì)較多的情況下同時(shí)分離并檢測(cè)此4種酚類物質(zhì)具有一定的難度。本研究采用保留時(shí)間和二極管陣列光譜圖相結(jié)合的方法進(jìn)行定性、進(jìn)而進(jìn)行定量測(cè)定，建立了一種新的、同時(shí)測(cè)定上述4種酚類物質(zhì)的高效液相色譜分析方法。

3.2 結(jié)論

研究結(jié)果表明，以1%乙酸水溶液-甲醇作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0 min，87% A；5 min，85% A；25～30 min，60% A），30 min內(nèi)各組分的色譜峰分離效果較好、色譜峰峰形好。實(shí)驗(yàn)以對(duì)羥基苯甲醇、3，4-二羥基苯甲酸、對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)羥基苯甲醛標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為y=4 024.22x-48 847（r=0.999 6）、y=54 654.4x-105 270（r=0.998 9）、y=54 654.4x-105 270（r=0.999 3）、y=66 922.4x-89 492.6（r=0.999 5）；且前述4種酚類的最低檢測(cè)線在0.04～0.9 μg/mL，加標(biāo)回收率在99%～102%，樣品中含量分別為（1.3±0.12）、（0.19±0.001）、（0.046±0.003）、（0.15±0.009）mg/g。該方法前處理簡單，樣品穩(wěn)定，重復(fù)性好，操作簡單快速，準(zhǔn)確性高。

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