佐劑關節炎大鼠血管新生COX—2、PI3K、AKT與細胞因子相關性研究

范為民　李艷　俞志超　葉玲梅

【摘要】 目的：觀察佐劑關節炎大鼠環氧化酶-2（COX-2）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶（AKT）的表達，以及其與白細胞介素-6（IL-6）、大鼠白細胞介素-10（IL-10）、血管內皮生長因子（VEGF）細胞因子的關系。方法：將20只大鼠適應性喂養1周后，隨機分為正常對照組（NC組）、模型對照組（MC組），每組10只。MC組每只大鼠右后足趾皮內注射弗氏完全佐劑0.1 ml，復制佐劑關節炎大鼠模型，NC組每只大鼠右后足趾皮內注射蒸餾水0.1 ml，兩組均給藥18 d。結果：與NC組比較，MC組足腫脹率、關節炎指數均明顯升高，差異均有統計學意義（P<0.01）；MC組的IL-6、VEGF指標也均明顯升高，而IL-10指標明顯下降升高，差異均有統計學意義（P<0.01）；MC組的COX-2、PI3K、AKT指標均明顯升高，差異均有統計學意義（P<0.01）；MC組大鼠COX-2與IL-6、VEGF呈正相關，與IL-10呈負相關；PI3K與IL-6、VEGF呈正相關，與IL-10呈負相關；AKT與IL-6、VEGF呈正相關。結論：COX-2、PI3K、AKT與IL-6、IL-10、VEGF細胞因子密切相關。

【關鍵詞】 類風濕關節炎； 環氧化酶-2； 磷脂酰肌醇3-激酶； 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶； 血管新生

中圖分類號 R331.32 文獻標識碼 B 文章編號 1674-6805（2016）6-0146-02

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2016.6.081

類風濕關節炎（RA）是一種以滑膜增生、關節破壞為主要特征的自身免疫系統疾病。滑膜炎主要病理表現為炎性細胞浸潤和血管增生。近些年，研究證實PI3K/AKT通路參與RA滑膜血管增生病變[1]。本研究采用酶聯免疫吸附法（ELISA）技術，檢測佐劑關節炎大鼠血管新生相關的COX-2、PI3K、AKT的變化，研究其與類風濕關節炎IL-6、IL-10、VEGF等因子之間的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠20只，體重（200±20）g，由上海杰思捷實驗動物有限公司提供，許可證號碼：SCXK（滬）2013-0006。

1.2 藥品及試劑

弗氏完全佐劑（美國Sigma公司生產），蒸餾水（弋磯山醫院中心實驗室提供），IL-6試劑盒、IL-10試劑盒、VEGF試劑盒、COX-2試劑盒、PI3K試劑盒、AKT試劑盒（武漢華美生物工程有限公司提供）。

1.3 實驗儀器

離心機（安徽嘉文儀器有限責任公司），電熱恒溫箱（上海三發科學儀器有限公司），洗板機（雷杜生命科學股份有限公司），漩渦混合器（其林貝爾儀器制造有限公司），酶標儀（雷杜生命科學股份有限公司）。

1.4 造模方法

將20只大鼠適應性喂養1周后，隨機分為正常對照組（NC組），模型對照組（MC組），每組10只。MC組每只大鼠右后足趾皮內注射弗氏完全佐劑0.1 ml，復制佐劑關節炎大鼠模型，NC組每只大鼠右后足趾皮內注射蒸餾水0.1 ml，兩組均給藥18 d。

1.5 指標檢測

1.5.1 大鼠足腫脹率檢測 于致炎前、致炎后應用排水法分別測定每只大鼠右后足容積，并計算出大鼠足腫脹率[腫脹率（%）=（致炎后足容積-致炎前足容積）/致炎前足容積×100%]。

1.5.2 大鼠關節炎指數檢測 于致炎前、致炎后計算大鼠關節炎指數：采用5級評分法，四肢關節炎指數之和代表每只大鼠的關節炎指數，積分越高，關節癥狀越嚴重，最高分值為16分。評分標準：0分，關節正常無紅腫；1分，趾關節紅腫；2分，趾關節和足趾腫脹；3分，踝關節以下的足爪腫脹；4分，包括踝關節在內的全部足爪腫脹、關節嚴重變形[2]。

1.5.3 大鼠IL-6、IL-10、VEGF、COX-2、PI3K、AKT指標檢測 于實驗結束后，大鼠腹主動脈取血，嚴格按照試劑盒要求，采用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測大鼠IL-6、IL-10、VEGF、COX-2、PI3K、AKT指標水平。

1.6 統計學處理

采用SPSS 17.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，比較采用t檢驗；非正態分布數據采用秩和檢驗；相關性分析采用多元回歸相關分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組大鼠足腫脹率和關節炎指數比較

給藥前，兩組大鼠足腫脹率、關節炎指數比較，差異均無統計學意義（P>0.05）；給藥后，MC組足腫脹率、關節炎指數均明顯高于NC組，差異均有統計學意義（P<0.01），詳見表1。

2.2 兩組大鼠IL-6、IL-10、VEGF比較

給藥后，MC組的IL-6、VEGF指標均明顯高于NC組，差異均有統計學意義（P<0.01）；而IL-10指標明顯低于NC組，差異有統計學意義（P<0.01），詳見表2。

2.3 兩組大鼠COX-2、PI3K、AKT比較

給藥后，與NC組比較，MC組的COX-2、PI3K、AKT指標均明顯升高，差異均有統計學意義（P<0.01），詳見表3。

2.4 MC組大鼠COX-2、PI3K、AKT與IL-6、IL-10、VEGF相關性分析

MC組大鼠COX-2與IL-6、VEGF呈正相關，與IL-10呈負相關；PI3K與IL-6、VEGF呈正相關，與IL-10呈負相關；AKT與IL-6、VEGF呈正相關，詳見表4。

3 討論

RA滑膜血管新生是滑膜炎癥的主要病理特點和病理結果之一，是造成關節破壞的重要原因，防治血管新生成為RA治療的主要靶點[3]。

IL-6主要由單核或巨噬細胞產生的單核因子，起促炎作用。IL-10主要由T細胞產生的淋巴因子，起抑炎作用。正常情況下，二者的動態平衡是維持機體正常免疫功能的必要條件。但是當IL-6產生過高，或IL-10產生相對過低，機體正常免疫功能相對平衡就被打破，機體就會出現異常，從而導致RA等免疫性疾病的發生。VEGF是一種糖基化分泌性多肽因子，作用于滑膜血管內皮，刺激血管內皮細胞分裂、增殖，增加RA微血管通透性，導致RA血管新生形成和滑膜炎癥、滑膜血管翳程度的加重[4]。因此，IL-6和IL-10動態不平衡及VEGF過度表達對滑膜血管新生及RA病情加重有重要影響。COX-2是環氧化酶（COX）的亞型，COX-2的選擇性抑制劑可以減輕關節炎的新生血管形成[5]。PI3K、AKT是血管生成的重要調節因子[6-7]，眾多研究結果表明，PI3K/AKT信號通路與RA的滑膜細胞增殖、血管新生有重要關系[8-11]。

本研究結果顯示，MC組足腫脹率、關節炎指數均明顯高于NC組，差異均有統計學意義（P<0.01）；MC組的IL-6、VEGF指標明顯升高，而IL-10指標明顯下降升高，差異均有統計學意義（P<0.01）；MC組的COX-2、PI3K、AKT指標明顯升高，差異均有統計學意義（P<0.01）；MC組大鼠COX-2與IL-6、VEGF呈正相關，與IL-10呈負相關；PI3K與IL-6、VEGF呈正相關，與IL-10呈負相關；AKT與IL-6、VEGF呈正相關。研究結果證實，血管新生相關的COX-2、PI3K、AKT與IL-6、IL-10、VEGF細胞因子有密切相關。

參考文獻

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[2] Stenmark K R，Fagan K A，Frid M G.Hypoxia-induced pulmonary vascular remodeling： cellular and molecular mechanisms[J].Circ Res，2006，99（7）：675-691.

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[9]張曉軍.基于PTEN/PI3K/AKT信號通路探討新風膠囊改善佐劑關節炎大鼠滑膜血管新生的機制[D].武漢：湖北中醫藥大學，2014.

[10]阮麗萍，劉健，葛瑤，等.骨關節炎大鼠軟骨PI3K/Akt-mTOR及Beclin-1自噬通路的表達及相關性分析[J].華中科技大學學報：醫學版，2015，44（4）：429-433.

[11]鄭振中.CD151基因轉移對PI3K/Akt/eNOS信號轉導和血管新生影響的研究[D].武漢：華中科技大學，2007.

（收稿日期：2015-10-09）