苦酸通調(diào)方對自發(fā)性糖尿病大鼠腹部脂肪組織中NF-κB和IKKβ mRNA表達的影響*

米　佳，樸春麗，陳　曦，朱浩宇

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，吉林 長春 130021； 2.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，吉林 長春 130021)

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·實驗研究·

苦酸通調(diào)方對自發(fā)性糖尿病大鼠腹部脂肪組織中NF-κB和IKKβ mRNA表達的影響*

米佳1，樸春麗1，陳曦1，朱浩宇2

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，吉林 長春 130021； 2.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，吉林 長春 130021)

目的：觀察苦酸通調(diào)方對自發(fā)性糖尿病大鼠腹部脂肪組織中NF-κB及IKKβ mRNA表達的影響。方法：將高脂飼料喂養(yǎng)的30只雄性SPF級ZDF大鼠隨機分為模型對照組、苦酸通調(diào)組、吡格列酮組3組，普通飼料喂養(yǎng)的雄性SPF級ZL大鼠為正常對照組，每組10只。苦酸通調(diào)組根據(jù)大鼠體質(zhì)量以3.29 g /(kg·d)混懸液灌胃，吡格列酮組以1.07 μg/(g·d)灌胃，正常對照組和模型對照組給予等體積蒸餾水灌胃，1 d 1次,連續(xù)12周。采用RT-PCR法檢測各組大鼠腹部脂肪組織中NF-κB、IKKβmRNA的表達水平。結(jié)果：模型對照組、吡格列酮組、苦酸通調(diào)組大鼠腹腔脂肪組織中NF-κB、IKKβ mRNA的表達高于正常對照組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型對照組對比，苦酸通調(diào)組和吡格列酮組NF-κB、IKKβ mRNA的表達均降低，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)。與吡格列酮組對比，苦酸通調(diào)NF-κB、IKKβ mRNA的表達均降低，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：苦酸通調(diào)方在一定程度上能抑制糖尿病大鼠腹部脂肪組織中NF-κB、IKKβ mRNA表達，這可能是苦酸通調(diào)方抑制炎癥信號通路的傳導(dǎo)而發(fā)揮其改善胰島素抵抗治療糖尿病的機制之一。

苦酸通調(diào)方；NF-κB；IKKβ；動物；ZDF大鼠

糖尿病是一種由多種原因引起的糖、脂肪、蛋白質(zhì)代謝紊亂綜合征[1]。近年來，我國糖尿病人數(shù)日益增多，而成人糖尿病人數(shù)已超過9200萬，并且糖尿病前期患者約有1.48億[2]。根據(jù)預(yù)測，到2025年糖尿病患病率將達到5.4%[3]。隨著生活方式的改變、生活水平的提高，糖尿病以其較高的發(fā)病率成為嚴(yán)重影響人類健康的疾病之一。胰島素抵抗及胰島功能受損是2型糖尿病的兩個基本環(huán)節(jié)[4]。因此，深入研究能夠改善胰島素抵抗和胰島功能受損的藥物，對于防治糖尿病及其并發(fā)癥具有重要意義。苦酸通調(diào)方以四氣五味藥性理論設(shè)立，以苦味藥為主，與酸味藥相配合，由《溫病條辨》所記載的連梅湯加大黃、干姜而成。本研究旨在結(jié)合中醫(yī)古今文獻，在前期研究[5]的基礎(chǔ)上，進一步探討苦酸通調(diào)方對自發(fā)性糖尿病大鼠腹腔脂肪組織中NF-κB、IKKβ mRNA的影響，探討本方治療2型糖尿病的作用機制，為糖尿病的中醫(yī)治療提供新的思路和方法。

1　材料與方法

1.1動物

清潔級9周齡雄性ZDF (Zucker diabetic fatty rat)大鼠42只(體質(zhì)量244～291 g)和同周齡雄性ZL(Zucker lean)大鼠10只(體質(zhì)量183～220 g)，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證：SCXK(京)2012-0001。ZDF大鼠在普通飼料喂養(yǎng)1周后予高脂飼料Purina #5008(粗脂肪6.5%、粗蛋白23.5%)喂養(yǎng)，ZL大鼠予普通飼料#1022(粗蛋白≥18.0%、粗脂肪≥4.0%、粗纖維≤5.0%、水分≤8.0%)喂養(yǎng)，飼料購于北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號：SCXK(京)2009-0008。實驗前均予普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，所有動物自由獲取食物和水。

1.2藥品

苦酸通調(diào)方由黃連、烏梅、大黃、干姜4味中藥組成，由長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院顆粒藥房提供；吡格列酮，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品，批號：國藥準(zhǔn)字H20040631。

1.3模型的建立

將42只ZDF大鼠和10只ZL大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠2只。明暗周期為12/12 h，自由攝食、飲水。各組予普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,ZL組繼續(xù)給予普通飼料喂養(yǎng)，ZDF組給予高脂飼料喂養(yǎng)。至12周時，共成糖尿病模型ZDF大鼠30只。

判斷造模成功標(biāo)準(zhǔn)：大鼠定期行糖耐量實驗，禁食不禁水15 h，剪尾取血微量血糖儀測空腹血糖后，予300 g/L葡萄糖溶液按2 g/kg灌胃[6]。糖負荷后分別在0.5,1,1.5和2 h剪尾取血，用血糖儀測量血糖。當(dāng)血糖峰值高于16.7 mmol/L和糖負荷后2 h 高于11.1mmol/L時，可診斷為糖尿病。如具備上述任意1條時，為糖耐量減低。取診斷為糖尿病或者糖耐量減低的大鼠為實驗對象。

1.4動物分組與給藥

將造模成功的30只ZDF大鼠隨機分為模型對照組、苦酸通調(diào)組和吡格列酮組3組，每組10只；10只ZL大鼠為正常對照組。苦酸通調(diào)組根據(jù)大鼠體質(zhì)量以3.29 g /(kg·d)混懸液灌胃，吡格列酮組以1.07 μg/(g·d)灌胃，正常對照組和模型對照組給予等體積蒸餾水灌胃，1 d 1次,連續(xù)12周。用藥治療期間正常對照組大鼠飼以普通飼料，其他組飼以高脂飼料，自由進食、飲水，每周稱量體質(zhì)量以調(diào)整灌胃劑量。

1.5檢測指標(biāo)

采用RT-PCR法檢測各組大鼠腹部脂肪組織中NF-κB、IKKβ mRNA的表達水平。于治療第12周末灌胃結(jié)束后，禁食、不禁水12 h，乙醚麻醉大鼠，打開腹腔，快速提取腹腔脂肪組織，分裝后迅速放入液氨罐，移至-80 ℃冰箱里凍存待用。

1.5.1大鼠腹腔脂肪組織總RNA的提取

采用Trizol法。①分別取超低溫凍結(jié)的正常對照組、模型對照組、苦酸通調(diào)組、吡格列酮組的脂肪組織約100 mg，放于勻漿器后加1mL的Trizol 試劑，研磨至組織完全破碎后，室溫放置5 min，使樣品充分裂解。②將勻漿分別轉(zhuǎn)入1.5 mL的EP管中，加入200 μL氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫放置5 min后，4 ℃離心機設(shè)置12 000 r/min，離心10 min。③從離心機中取出EP管，吸取上層清液，緩慢轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL的EP管中。④緩慢向上清液中加入0.5 mL的異丙醇混勻，室溫放置10 min。⑤在12 000 r/min、4 ℃離心機中離心10 min后，棄去上清液，沿EP管管壁緩慢加入750 mL/L的乙醇1 mL，將離心管震蕩搖勻，在冰上靜置10 min后放入7 500 r/min、4 ℃離心機中離心5 min，棄上清液。上述過程重復(fù)2次。⑥室溫干燥10 min，加入10 μL的DEPC水混合均勻，將RNA完全溶解。

1.5.2RNA純度的測定

用紫外分光光度計測定260 nm、280 nm的紫外吸收值，重復(fù)3次。如各組結(jié)果A260/A280在1.8～2.0之間，說明提取的RNA純度較高。

1.5.3RNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

取0.2 mL EP管，分別順次加入表1內(nèi)試劑，完成RT反應(yīng)液的配置。將上述試劑混勻靜置10 min，上PCR儀反應(yīng)(45 ℃水浴40 min，95 ℃水浴5 min，5 ℃水浴5 min)，滅活逆轉(zhuǎn)錄酶后，存放于-20 ℃冰箱中備用。

表1　RT反應(yīng)液的配置

1.5.4RT-PCR反應(yīng)

引物序列 參見表2。 GAPDH反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進行35個循環(huán)，72 ℃充分延伸5 min，4 ℃保存。NF-KB反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進行38個循環(huán)，72 ℃充分延伸5 min，4 ℃保存。IKKβ反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進行40個循環(huán)，72 ℃充分延伸 5 min，4 ℃保存。

表2　引物序列名稱

1.5.5PCR產(chǎn)物的檢測和分析

將終產(chǎn)物在質(zhì)量分?jǐn)?shù)10 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳20～30 min，紫外燈下拍照，利用凝膠成像系統(tǒng)對每個樣品PCR產(chǎn)物擴增的特異性片段進行灰度掃描，并以GAPDH密度作為參考定量標(biāo)準(zhǔn)，進行相關(guān)基因相對表達量的計算。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法

2　結(jié)　果

模型對照組、吡格列酮組、苦酸通調(diào)組大鼠腹腔脂肪組織中NF-κB、IKKβ mRNA的表達高于正常對照組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型對照組對比，苦酸通調(diào)組和吡格列酮組NF-κB、IKKβ mRNA的表達均降低，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。與吡格列酮組對比，苦酸通調(diào)NF-κB、IKKβ mRNA的表達均降低，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明：苦酸通調(diào)方和吡格列酮均有降低糖尿病大鼠腹腔脂肪組織NF-κB、IKKβ基因表達的作用，且苦酸通調(diào)方優(yōu)于吡格列酮。見表3、圖1。

分 組NF-κBIKKβ正常對照組0.53±0.010.66±0.05模型對照組0.92±0.01**0.90±0.04**吡格列酮組0.91±0.01**#0.86±0.03**#苦酸通調(diào)組0.80±0.02**##△0.72±0.02**##△

注:與正常對照組對比，**P<0.01；與模型對照組對比，#P<0.05，##P<0.01；與吡格列酮組對比，△P<0.05。

A.正常對照組；B.模型對照組；

3　討　論

糖尿病屬中醫(yī)學(xué)“消渴”范疇。古人對消渴的病機一直遵循“陰虛燥熱”的傳統(tǒng)觀點，認為陰虛為本、燥熱為標(biāo);但隨著生活方式的改變、生存壓力的增加，醫(yī)家對消渴的病因病機有了新的認識：飲食不節(jié)使脾胃功能受損，運化失常，氣機壅滯，郁而生熱；情志不遂，氣機郁滯，郁而化火。可見，消渴的產(chǎn)生與郁、熱關(guān)系較為密切。隨著病程的進展，日久熱耗氣傷陰，氣陰兩傷，久則陰陽兩虛。課題組所在的團隊經(jīng)十余年的臨床和動物實驗研究[5，7]證實，六郁和絡(luò)滯并存是導(dǎo)致肥胖2型糖尿病的核心病機。六郁是指以肥甘滋膩之品滯脾礙胃(食郁)為先導(dǎo)而形成的氣郁、血郁、熱郁、痰郁、濕郁的病理狀態(tài)；膏、濁、痰、脂、瘀、毒化生，郁滯絡(luò)脈。絡(luò)滯是由六郁交互作用而形成絡(luò)脈郁滯的病理狀態(tài)。苦酸通調(diào)法是對苦酸制甜、辛開苦降、活血通絡(luò)、解毒通絡(luò)單一治法學(xué)說的高度概括，主要針對肥胖2型糖尿病的核心病機“六郁和絡(luò)滯”。苦酸通調(diào)方按照君臣佐使的組方原則進行藥物配伍，以六郁和絡(luò)滯的病機理論為基礎(chǔ)，治療以清熱瀉火、養(yǎng)陰生津、解毒通絡(luò)為原則，以苦酸通調(diào)為治療大法。既往臨床研究發(fā)現(xiàn)[8]，苦酸通調(diào)方對肥胖2型糖尿病胰島素抵抗患者有較好的改善作用。核因子κB(NF-κB)是細胞中的重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，存在于多種細胞中，通過刺激腫瘤壞死因子等的活化，誘導(dǎo)多種基因的表達，參與炎癥反應(yīng)[9]。王曉晨等[10]指出，NF-κB通過復(fù)雜的分子調(diào)節(jié)參與機體的炎癥反應(yīng)，并產(chǎn)生一定的生理變化，通常以p50-p655異二聚體的形式與其抑制性蛋白結(jié)合。NF-κB信號通路中有IKKβ、IKBα、NF-κB3個關(guān)鍵因子[11]。有研究報道，IKKβ是胰島素抵抗發(fā)生的關(guān)鍵[12]。在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，IKKβ抑制劑可阻斷NF-κB的激活。

本研究結(jié)果顯示：模型對照組大鼠腹部脂肪組織中NF-κB、IKKβ mRNA表達量較正常對照組增高，苦酸通調(diào)方可在一定程度上能抑制糖尿病大鼠此兩指標(biāo)的表達。這可能是苦酸通調(diào)方抑制炎癥信號通路的傳導(dǎo)而發(fā)揮其改善胰島素抵抗治療糖尿病的機制之一。

[1]陳艷芬,王春怡,李衛(wèi)民,等.黃芪葛根湯對糖尿病心肌病大鼠氧化應(yīng)激和NF-KB表達的影響[J].中成藥，2012,34(8):1428-1432.

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(編輯陶珠)

1001-6910(2016)02-0063-04

R587.1

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2016.02.31

吉林省自然科學(xué)基金項目(201115169)

2015-06-30；修回：2015-11-30