毛囊細胞移植治療禿發疾病的實驗基礎研究

陳明娟，王原路，侯 剛

·基礎研究·

毛囊細胞移植治療禿發疾病的實驗基礎研究

陳明娟1，王原路1，侯 剛2

（1.廣州市第一人民醫院整形外科廣東 廣州510180；2.中山大學附屬嶺南醫院骨科廣東 廣州510515）

目的：探索細胞移植誘導毛發再生模式，為毛囊細胞移植奠定實驗基礎。方法：利用酶消化法分離培養綠色熒光蛋白轉基因鼠的表皮細胞和真皮細胞，分別進行體外培養擴增至第三代后注射移植入裸鼠皮下，觀察其毛囊誘導能力。結果：表皮細胞移植無法誘導毛囊發育；真皮細胞移植僅誘導形成毛囊樣結構；混合細胞移植能夠誘導毛囊及毛干發育。結論：混合細胞培養可作為毛囊細胞體外培養模型，為毛囊細胞移植提供良好供體。

真皮細胞；細胞培養；毛囊；誘導；細胞移植

全球脫發治療新進展研討會曾公布調查結果顯示：世界上大約有50%成年男性受到脫發困擾，脫發現象遍及世界各個地區各個民族。然而目前的治療方法無法從根本上解決脫發這一難題，因此細胞移植誘導毛囊再生成為近年來研究的重點。已證實的同毛囊再生具有密切關系的細胞包括毛乳頭細胞（Dermal papilla cells，DPCs）和毛囊干細胞（hair follicle stem cells，HFSCs），并能夠進行體外擴增，為細胞移植提供大量的種子細胞。但是通過何種培養方式，能夠獲得大量具有毛囊誘導能力的種子細胞成為毛囊再生的首要問題。因此，本研究我們將探索細胞培養模式對毛囊發育的影響，最終確立一種科學的培養模型進行體外培養，從而為毛囊的正常發育提供穩定的環境，為毛囊組織工程重建和毛發移植的臨床應用奠定實驗和理論基礎。

1　材料和方法

1.1實驗動物與試劑：4～6周齡裸鼠，綠色熒光蛋白（GFP）轉基因小鼠各一只，由南方醫科大學實驗動物中心提供。I型膠原酶、中性蛋白酶、胰酶（GIBCO公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS）（SIGMA公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；DMEM 高糖培養基，青、鏈霉素（杭州吉諾公司）；成纖維細胞生長因子FGF-2（SIGMA公司）；CD34、CD44、CD133（bs-0395R，BIOS公司）。

1.2種子細胞的分離與培養：取生后第1天的GFP轉基因鼠1只，取其背部皮膚約0.5cm×0.5cm組織塊，用0.1%中性蛋白酶4℃消化過夜。PBS（含1%青、鏈霉素）漂洗3次，用顯微鑷將表皮和真皮分離。分別剪碎，表皮用0.25%胰酶37℃消化10min，真皮以0.2%膠原酶37℃孵育約30min，直至所有組織被消化。加入DMEM高糖培養基（含10%胎牛血清）終止消化。200目篩網過濾，去除組織碎片和細胞團塊，收集單細胞混懸液于離心管離心（1 000r/min）5min，重復離心2次，棄上清液，加入DMEM高糖培養基（含10%胎牛血清）。分別取表皮細胞懸液、真皮細胞懸液各1.5ml接種至25ml培養瓶中，加入2ml培養基，50g/L FGF-2，置于孵箱中，24h換液。待細胞貼壁后每3d換液1次，按1:2比例傳至第三代。分別收集表皮細胞懸液、真皮細胞懸液以及表皮、真皮按1:2比例混合細胞懸液。

1.3流式細胞檢測分析：將臺盼藍染色＞95%活力的表皮、真皮混合細胞以106/孔種于12孔板，0.25%胰蛋白酶收集細胞。重懸于含有1:50稀釋的FITC-CD34和FITC-CD44抗體或1:20稀釋的FITC-CD133抗體（以1:50稀釋的mouse IgG/ FITC作為對照），37℃，30min。流式細胞儀激發波長Ex=488nm； 發射波長Em=530nm。檢測陽性率。

1.4細胞體內移植：裸鼠用戊巴比妥鈉麻醉，用1ml注射器將第三代細胞懸液分別注射移植至裸鼠背部皮下，注射后定期（2、4、8周）大體觀察毛發發育情況。于第8周取移植部位組織，用4%多聚甲醛固定，常規石蠟切片，HE染色，熒光顯微鏡下觀察。

2　結果

2.1細胞形態學觀察：表皮細胞無法貼壁培養，真皮細胞及混合細胞接種后24h內貼壁。熒光顯微鏡下觀察最初為小圓形，細胞大小不均勻（圖1）。24h后逐漸伸展為梭形，4d 后形態呈成纖維細胞樣，核呈橢圓形較大（圖2）。原代培養的細胞7d 即達70%～80% 融合。細胞隨著傳代次數的增加，細胞體積逐漸增大。

圖1　熒光顯微鏡下觀察真皮細胞懸液（×10）

圖2　真皮細胞接種24h后熒光顯微鏡下觀察（×100）

2.2流式細胞檢測結果顯示：細胞流式分析陽性細胞百分比CD34（52.6%）；CD44（40.67%）；CD133（48.1%）；IgG（70.7%） （圖3）。

圖3　陽性細胞百分比　CD34（52.6%）； CD44（40.67%）； CD133（48.1%）；lgG（70.7%）

2.3細胞移植后觀察：移植后2周，單純表皮細胞受區未見明顯變化，真皮細胞及混合細胞受區可見組織增厚，逐漸呈現輕微的隆起。移植后8周，取受區部位的皮膚行組織切片并染色，光鏡下可見真皮細胞及混合細胞受區有大量呈同心圓排列的毛囊結構，其中心為嗜伊紅染色的角化物質，向外依次為內根鞘、外根鞘、真皮鞘（圖4）。混合細胞受區熒光顯微鏡下毛發發育清晰可見（圖5），體視顯微鏡下可觀察的到大量的毛囊、毛干形成（圖6）。表皮細胞受區組織未見毛囊結構。

圖4　顯微鏡下觀察真皮細胞移植后2周受區的毛囊結構（HE×60）

圖5　熒光顯微鏡下觀察混合細胞移植后2周毛發發育情況（×5）

圖6　皮下移植兩周后有毛發纖維形成（×5）

3　討論

對于哺乳動物來說，毛囊是一個特殊的器官，它由真皮和表皮成分組成。一個毛囊包括同心圓的上皮鞘（毛干，內根鞘，外根鞘），被同毛囊底部真皮乳頭相連的真皮鞘圍繞［1］。在外根鞘中間膨大部位稱為膨出部有表皮干細胞的聚集。這些干細胞同毛囊底部的真皮乳頭相互作用發育為不同類型的毛囊細胞［2］。毛發的發生最早始于胚胎期［3］。上皮細胞和間充質細胞之間的相互作用使表皮細胞增厚并形成基板，從而表皮下間充質細胞聚集成真皮濃集，最終發育為真皮乳頭，即毛乳頭［4］。DPCs和表皮細胞作為毛囊的兩種主要成分通過相互的交流最終發育形成毛囊［5］。毛囊中的三種細胞成分，即外根鞘細胞、DPCs和真皮鞘細胞。其中真皮鞘細胞和DPCs 是主要的真皮源性細胞［6］，而外根鞘細胞則為表皮源性細胞［7］。

研究表明，CD34、CD133、CD44都是正常組織幼稚細胞的標志物。CD34分子是高度糖基化的I型跨膜糖蛋白，選擇性地表達于人類及其他哺乳動物造血干/祖細胞表面，并隨細胞的成熟逐漸減弱至消失，它是鼠毛囊干細胞中較好的表面標志。CDl33是在人類造血干/祖細胞上發現的一種跨膜糖蛋白，最初被認定為是造血干細胞的特異性標志，但后來發現CDl33蛋白在神經干細胞、表皮干細胞、內皮祖細胞等多種干/祖細胞中都有表達。Yuriko等研究證實，CD133同毛囊細胞誘導能力有關，可作為一種新的細胞表面標記來檢測和分離具有毛囊誘導能力的真皮乳頭細胞（DPCs）。CD44是種細胞粘附分子，已知其為分布極為廣泛的細胞表面跨膜糖蛋白，主要參與異質性粘附，代表了細胞的聚集性生長能力。因此，本實驗以CD34、CD44、CD133為標記來鑒定所獲得的種子細胞的干細胞特性及其毛囊誘導能力。

本實驗取材于新生GFP轉基因鼠的皮膚組織，經過酶的消化最終得到表皮細胞和真皮細胞，其中包括大量的毛囊細胞及其前體。真皮細胞類似成纖維細胞樣形態，且能夠貼壁生長，符合真皮乳頭細胞的特性。此外，我們將分離出的真皮細胞經流式細胞檢測分析細胞表達CD34、CD44、CD133，其中CD34代表了所得細胞的干細胞特性，CD133說明細胞具有毛囊誘導能力，CD44則代表該細胞具有聚集性生長能力。檢測結果表明所獲得的細胞具有較強的毛囊誘導能力，可作為毛囊種子細胞進行體外培養擴增。成纖維細胞生長因子-2（FGF2）能夠有力促進成纖維細胞有絲分裂， 最新的實驗表明，毛乳頭細胞在含有成纖維生長因子-2（FGF2）的培養基中，其誘導能力可以長期維持，而且當分散的毛乳頭細胞聚集成球后其喪失的誘導能力可以恢復［8-10］，因此在體外培養擴增時加入FGF-2有利于細胞誘導毛囊再生能力的維持。本實驗利用第三代細胞制備表皮細胞懸液、真皮細胞懸液以及1:2混合細胞懸液進行裸鼠皮下移植，2周便可觀察到毛囊的形成，這充分顯示通過培養的細胞具有毛發誘導能力，但混合細胞移植能夠發育為毛干，提示我們表皮細胞和真皮細胞之間存在著某種特定的信號調節通路，兩者相互作用才能發育為完整的毛發組織［11］。筆者之所以采用GFP轉基因鼠，是因為其在熒光顯微鏡下更容易觀察形成毛囊的細胞來源，發育形成的毛囊、毛干均呈綠色熒光表達則可以證明是由注射的細胞所形成。

本實驗雖然證實體外培養擴增的毛囊細胞能夠誘導毛發再生，但其誘導特性能夠維持多久仍需要進一步的實驗證明。盡管目前針對毛囊細胞的研究進展迅速，但對于毛囊的再生仍有許多問題亟待進一步的闡明，探索毛囊細胞間的聯合培養模式及移植方式，為細胞療法來解決禿發這一難題提供了實驗依據。

［1］Tezuka K，Toyoshima KE，Tsuji T.Hair Follicle Regeneration by Transplantation of a Bioengineered Hair Follicle Germ［J］.Methods Mol Biol，2016，1453:71-84.

［2］Ito Y，Hamazaki TS，Ohnuma K，et al.Isolation of murine hair-inducing cells using the cell surface marker prominin-1/CD133［J］.J Invest Dermatol，2007，127（5）:1052-1060.

［3］Inamatsu M，Tochio T，Makabe A，et al.Embryonic dermal condensation and adult dermal papilla induce hair follicles in adult glabrous epidermis through different mechanisms［J］.Dev Growth Differ，2006，48（2）:73-86.

［4］Botchkarev VA，Paus R.Molecular biology of hair morphogenesis:development and cycling［J］.J Exp Zool B Mol Dev Evol，2003，298（1）:164-180.

［5］Schmidt-Ullrich R，Paus R.Molecular principles of hair follicle induction and morphogenesis［J］.Bioessays，2005，27（3）:247-261.

［6］Hashimoto T，Kazama T，Ito M，et al.Histologic study of the regeneration process of human hair follicles grafted onto SCID mice after bulb amputation［J］.J Investig Dermatol Symp Proc，2001，6（1）:38-42.

［7］Sennett R，Rendl M.Mesenchymal-epithelial interactions during hair follicle morphogenesis and cycling［J］.Semin Cell Dev Biol，2012，23（8）:917-927.

［8］Osada A，Iwabuchi T，Kishimoto J，et al.Long-term culture of mouse vibrissal dermal papilla cells and de novo hair follicle induction.［J］. Tissue Eng，2007，13（5）:975-982.

［9］Hwang KA，Hwang YL，Lee MH，et al.Adenosine stimulates growth of dermal papilla and lengthens the anagen phase by increasing the cysteine level via fibroblast growth factors 2 and 7 in an organ culture of mouse vibrissae hair follicles［J］.Int J Mol Med，2012，29（2）:195-201.

［10］Osada A，Iwabuchi T，Kishimoto J，et al.Long-term culture of mouse vibrissal dermal papilla cells and de novo hair follicle induction［J］. Tissue Eng，2007，13（5）:975-982.

［11］Plikus MV，Chuong CM.Macroenvironmental regulation of hair cycling and collective regenerative behavior［J］.Cold Spring Harb Perspect Med，2014，4（1）:a15198.

Experimental research of hair follicle cell transplantation for treatment of bald disease

CHEN Ming-juan1， WANG Yuan-lu1， HOU Gang2
（Department of Plastic Sugery， Guangzhou First People＇s Hospital，Guangzhou 510180，Guangdong，China）

ObjectiveExploring the mode of cell transplantation to inducing hair regeneration， for the experimental basis for the hair follicle cells transplantation.MethodsCultivate epidermal cells and dermal cells of green fluorescent protein transgenic mice by enzyme digestion method， then amplify in vitro respectively to the third generation. After that， transplant the cells in nude mice by subcutaneously injecting， observe the hair follicle induction ability.ResultsEpidermal cells transplantation could not induce hair follicle development； Dermal cells transplantation only induce formation of hair follicle structure. Mixed cells transplantation can induce the hair follicle and hair shaft.ConclusionMixed cells culture can be used as hair follicle cells in vitro culture model， that providing a good donor for hair follicle cells transplantation.

dermal cell ；cell culture； hair follicle；inducibility；cells transplantation

R322

A

1008-6455（2016）09-0071-03

2016-06-27

2016-09-05

編輯/張惠娟

毛囊細胞移植治療禿發疾病的實驗基礎研究（2012B031800011）

王原路（1963-），男，主任醫師，碩士研究生；主要研究方向為面部整形美容外科；E-mail:115415129@qq.com