干旱脅迫下雜草稻和栽培稻根系基因表達差異研究

丁國華　孫健　楊光　張鳳鳴　白良明　孫世臣　姜樹坤　王彤彤　鄭洪亮夏天舒　沈希宏　馬殿榮　陳溫福

(1 黑龍江省農業科學院博士后科研工作站/黑龍江省農業科學院 耕作栽培研究所/中國科學院 北方粳稻分子育種聯合研究中心， 哈爾濱 155086；2 沈陽農業大學 水稻研究所， 沈陽110866； 3 遼寧省經濟作物研究所， 遼寧 遼陽 111000； 4中國水稻研究所， 杭州 310006；#共同第一作者；*通訊聯系人， E-mail: madianrong@163.com； wfchen5512@126.com)

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干旱脅迫下雜草稻和栽培稻根系基因表達差異研究

丁國華1，2，#孫健2，#楊光3張鳳鳴1白良明1孫世臣1姜樹坤1王彤彤1鄭洪亮1夏天舒1沈希宏4馬殿榮2，*陳溫福2，*

(1黑龍江省農業科學院博士后科研工作站/黑龍江省農業科學院 耕作栽培研究所/中國科學院 北方粳稻分子育種聯合研究中心， 哈爾濱 155086；2沈陽農業大學 水稻研究所， 沈陽110866；3遼寧省經濟作物研究所， 遼寧 遼陽 111000；4中國水稻研究所， 杭州 310006；#共同第一作者；*通訊聯系人， E-mail: madianrong@163.com； wfchen5512@126.com)

DING Guohua, SUN Jian, YANG Guang, et al. Global genome expression analysis of root genes under drought stress in weedy rice and up-land rice. Chin J Rice Sci, 2016, 30(5): 458-468.

利用Affymetrix水稻表達譜芯片(GeneChip Rice Genome Array)研究抗旱雜草稻HEB07-2與巴西陸稻(IAPAR9)在PEG模擬干旱脅迫下根系基因表達變化。結果表明,雜草稻HEB07-2轉錄組對干旱信號的響應程度與方向均與巴西陸稻存在很大差異，HEB07-2以正向調控為主，而巴西陸稻以負調控為主。干旱脅迫下雜草稻HEB07-2與巴西陸稻分別有6878個和2923個基因表達，其中HEB07-2受干旱脅迫誘導上調的基因有4693個，下調的基因有2185個；而巴西陸稻則分別有983個和1940個。在差異基因表達的倍數上也是HEB07-2高于巴西陸稻。進一步的GO分析表明，在干旱脅迫下，HEB07-2和IAPAR9根系基因響應途徑的差異表現為HEB07-2在鉀離子轉運(GO：0006813)、次生物質代謝(GO：0019748)、細胞生長(GO：0016049)、葡萄糖代謝(GO：0006006)、跨膜離子轉運器活性(GO：0015075)、亞鐵血紅素結合體(GO：0020037)、氧化還原酶活性(GO：0016491)等方面基因顯著上調，這與生理數據和表型數據一致。

雜草稻； 根系； 表達譜芯片； 耐旱

水稻(Oryzasativa)是重要的糧食作物，全世界一半以上的人口都將稻米作為主食[1]。我國是水稻生產大國，稻谷總產量世界第一，水稻生產耗水量大，占農業用水的60%左右，水資源已經成為限制水稻發展的一個潛在因素[2]。因此，培育抗旱節水的水稻新品種是本領域亟待解決的問題之一，而植物的耐旱性是典型的數量性狀，由眾多基因控制，十分復雜。關于作物耐旱的QTL研究較多[3-6]，但到目前為止沒有克隆一個與作物耐旱性相關的QTL，而基于耐旱性QTL進行的分子輔助育種效果并不能令人滿意。

基因芯片使研究人員能夠快速、高通量地了解植物在特定環 境條件下的基因表達水平及變化[7-11]。Thomas等[9]利用芯片技術進行研究，發現耐旱性不同的水稻品種干旱脅迫下基因表達模式不同，長期干旱脅迫下干旱敏感品種表達發生變化的基因數量較多。李永春等[10]用Affymetrix基因芯片研究小麥在模擬干旱脅迫(20% PEG-6000溶液)下根系基因表達譜，結果表明干旱脅迫后下調表達的基因4573個(5043個探針組)，上調表達的基因3743個(4074個探針組)。Zhang 等[11]利用表達譜芯片研究了干旱脅迫下巴豆苗期根系和葉片中基因表達狀況，干旱脅迫下有關生物合成、轉運、細胞蛋白修飾、脫落酸合成、脫落酸信號轉導、棉籽糖合成、海藻糖合成相關基因顯著上調。

雜草稻是亞洲栽培稻的一級基因源，具有較強的抗逆性，是改良栽培稻的優良基因庫[12-13]。利用基因芯片技術檢測雜草稻與栽培稻全基因組基因在干旱脅迫下的表達變化情況，并進一步分析數據，對比雜草稻與栽培稻全基因組在特定條件下對外界環境的響應狀況，從轉錄和表達的層面揭示雜草稻和栽培稻在干旱脅迫下的基因組差異，進一步發掘雜草稻可能存在的特殊抗旱機理，對于拓寬水稻耐旱遺傳基礎，培育節水抗旱水稻新品種具有重要意義。以往關于抗旱表達譜的研究往往基于抗旱樣本與干旱敏感樣本的相互比較。本研究將極抗旱種質資源雜草稻HEB07-2與抗旱的陸稻樣本進行表達譜差異分析，試圖從一個新的高度進一步理解稻屬植物抗旱的機制。

1　材料與方法

1.1植物材料與試驗設計

供試材料為北方雜草稻HEB07-2和巴西陸稻。選取飽滿的種子，經10%次氯酸鈉消毒后，于30℃下恒溫催芽3 d，之后選取長勢一致的種子播于96孔PVP板中，并置于培養容器(長24 cm×寬24 cm×高10 cm)中。在RXZ-500C人工氣候箱中進行幼苗培養。培養前2周放入水中培養，于第3周時置于木村B半營養液中，于第4周開始時放入木村B全營養液中，將生長4周的幼苗置于20%PEG-6000中模擬干旱脅迫，處理24 h，以不進行干旱脅迫營養液培養的幼苗為對照(CK)。人工氣候箱白天溫度設定為29℃，夜間設定為24℃，14 h光照/12 h黑暗，光強為22 000 lx。脅迫結束后馬上取樣，取幼苗所有根，用鋁箔紙包好，放入液氮中迅速冷凍，然后于-80℃超低溫冰箱中保存，用于提取總RNA和測定相關生理指標。試驗設置3次重復，取樣時每個品種取一盤，每20株為一次重復。

本研究采用Affymetrix水稻表達譜芯片(GeneChip Rice Genome Array)分析干旱脅迫24 h后HEB07-2與巴西陸稻表達譜差異。芯片覆蓋了約51 279個轉錄本，代表兩個水稻亞種，48 564個粳稻亞種轉錄本和1260個秈稻亞種轉錄本。序列信息來源于GenBank mRNAs，TIGR基因預測和國際水稻基因組序列計劃。分析干旱脅迫24 h后雜草稻HEB07-2與巴西陸稻根系轉錄豐度的差異，通過計算雜交信號的比值和統計分析，獲得差異表達基因的信息，研究在功能或表達調控上具有相關性的基因。

1.2項目測定

1.2.1 葉片總RNA的提取

按Trizol試劑盒(康為公司，中國)說明書提取總RNA。用紫外分光光度計測定所抽RNA樣品的A260、A280值，根據測定的濃度，每個RNA樣品稀釋成相同濃度，取1 μg RNA用0.8%變性瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2生理指標測定

1.2.3實時熒光定量PCR分析

將HEB07-2和IAPAR9各樣品RNA反轉錄為cDNA，以反轉錄產物為模板，以水稻Actin為內參基因，采用QIAGEN公司的SYBR Green RT-PCR 試劑盒及ABI7500熒光定量PCR儀進行檢測。隨機選擇在HEB07-2和IAPAR9基因芯片檢測表現為差異表達的4個基因(LOC_Os03g37840，LOC_Os04g52390，LOC_Os08g32840，LOC_Os02g02400)，用Primer Premier 5.0軟件設計引物，進行實時熒光定量PCR分析，以驗證基因芯片的分析結果。

表1實時熒光定量PCR分析所用的引物

Table 1. Primers used for real-time quantitative PCR.

基因Gene正向引物Forwardprimer(5'-3')反向引物Reverseprimer(5'-3')LOC_Os03g37840CGAAATAAGAAGGACGGATGGTGATGGGAGCAAGACAAAGGTALOC_Os04g52390TCAAGAACCAAAGTCAGATAGGAAGAAAGCACAATAAAGGTGACAACTAGLOC_Os08g32840CTCAACTACACCTACCGAAACGCTCCAACTTGTGCAGGAACTCATLOC_Os02g02400GAGGCAGAAGGCGACGATAGAGGTAGTTGACCCAGATGGCActinGGAACTGGTATGGTCAAGGCAGTCTCATGGATACCCGCAG

1.3數據處理

1.3.1芯片數據分析

本研究應用MAS 5.0軟件(Affymetrix MicroArray Suite 5.0 software)分析掃描芯片上的每一基因的信號強度，之后利用GCOS(Affymetrix GeneChip Operating Software 4.0)建立每個樣品生物學重復內擴增樣品的信號數據庫，進行信號的背景校正與數據的標準化分析。進而比較雜草稻與巴西陸稻干旱脅迫下兩種背景的基因表達譜的變化。進一步采用Gene Spring 7.1進行標準化芯片數據的統計分析。根據標準化后的均值來計算每個探針的表達變化。用t檢驗(one-way)篩選差異顯著基因，篩選標準為差異兩倍的探針位點，方差分析的顯著性差異為0.005。

1.3.2生理數據分析

試驗數據用SPSS 19.0進行統計分析。試驗數據均為平均值±標準差(n=3)。每個供試材料不同處理間進行方差分析(ANOVA)，采用Duncan法(P<0.05，0.01)以0 h數據為對照。利用GraphPad Prism 6作圖。

1.3.3實時熒光定量PCR數據分析

各樣品每個基因重復3次，按相對定量法進行定量計算，目的基因相對定量計算公式為Rel.Exp=2-△△Ct，其中△△Ct=△Ct未知樣品-△CtCalibrator，△Ct未知樣品=Ct內參基因-Ct目的基因，△CtCalibrator=Ct參比樣內參基因-Ct參比樣目的基因。

2　結果與分析

2.1HEB07-2和巴西陸稻差異基因倍數變化及表達模式

雜草稻HEB07-2與巴西陸稻分別有6878個和2923個基因表達，根據RICE芯片的詮釋可知，在干旱脅迫下HEB07-2表達的基因中5410個基因有明確功能注釋，1468個基因無確定功能，占21.3%；巴西陸稻干旱脅迫下表達的基因中，2076個基因有確定功能，847個基因無明確功能注釋，占表達基因總數的29.0%；2個供試材料差異表達基因有6579個，其中4799個基因功能已知，1780個表達基因無明確注釋，占總數的27.1%。

HEB07-2和巴西陸稻表達重疊的基因有1329個。其中HEB07-2受干旱脅迫誘導上調的基因有4693個，下調的基因有2185個。而巴西陸稻受干旱脅迫誘導上調基因遠小于HEB07-2，有983個，受干旱脅迫下調的基因與HEB07-2相當，有1940個。上調的最大倍數在44.2到58.4倍之間，平均變化2.9～3.4倍；下調最大倍數在20.6～167.5倍，平均下調2.9～5.3倍。干旱脅迫下HEB07-2和巴西陸稻相比有差異表達的基因數量為6579個，無差異的基因有48 246個，其中有2546個基因下調，4033個基因上調。

2.2干旱脅迫下HEB07-2根系差異表達基因GO分析

對差異表達基因進行GO (GENE ONTOLOGY)分析，按照GO分類法則，對差異基因進行功能分類。干旱脅迫處理下，HEB07-2與對照比發生變化的基因，經過GO分析后按分子功能、生物過程和細胞組成進行詮釋(詳見在線輔助性表S1，http://www.ricesci.cn/)，涉及分子功能基因有2841個，這些基因涉及陽離子結合、離子結合、金屬離子結合、DNA結合、鐵離子結合、鈣離子結合、四吡咯結合亞鐵血紅素結合、碳水化合物結合、維生素結合、糖結合、磷酸吡哆醛結合、維生素B6結合、糖脂類結合，分別占14.5%、14.5%、13.3%、7.2%、3.6%、2.8%、2.4%、2.4%、1.0%、0.9%、0.8%、0.8%、0.8%、0.12%；此外，還有蛋白激酶活性、蛋白組氨酸/絲氨酸激酶活性、轉錄調節因子活性、電子載體活性、轉錄因子活性、氧化還原酶活性、幾丁質酶活性、脂氧合酶活性、半胱氨酸活性、谷氨酸脫羧酶活性、糖脂轉運器活性，各占5.5%、4.8%、4.2%、3.6%、3.1%、1.0%、0.3%、0.2%、0.2%、0.1%、0.1%。

圖1HEB07-2和IAPAR9響應干旱脅迫基因比較的韋恩圖

Fig. 1. Ven figure of HEB07-2 and IAPAR9 regulated genes under drought.

圖2HEB07-2和IAPAR9干旱脅迫誘導和抑制的基因

Fig. 2. Gene numbers of HEB07-2 and IAPAR9 induced and repressed by drought.

按生物過程分有1286個基因表達發生了變化，這些基因的功能包括代謝過程(RNA代謝調節過程、脂質合成過程、氨基酸衍生物代謝等)、轉錄(轉錄調控等)、蛋白氨基酸磷酸化、氧化還原、轉運(金屬離子轉運、無機離子轉運等)、光合捕光、細胞運動及定位、響應(水響應等)，分別占總數的12.2%、14.1%、5.5%、5.0%、1.7%、0.2%、0.7%、0.5%。

按細胞組成分有1283個基因表達發生了變化，主要是細胞器(膜結合細胞器、非膜結合細胞器)、細胞、蛋白復合體(泛素連接酶復合體)、細胞外區域(胞外區域和質外體)，分別占24.1%、13.1%、0.5%、2.3%。

2.3干旱脅迫下巴西陸稻根系差異基因GO分析

干旱脅迫下，巴西陸稻根系與對照比基因組發生表達變化，經GO分析后，涉及分子功能的基因共有1059個，包括離子結合(陽離子結合、金屬離子結合等)、DNA結合、轉錄因子活性、激酶活性、轉運載體活性、氧化還原酶活性，所占比例分別為46.1%、12.2%、10.4%、6.0%、3.0%、1.2%。干旱脅迫期間和生物過程相關的基因共有505個基因表達發生變化，這些基因涉及轉錄調節、代謝過程、離子轉運、響應反應，所占比例分別為18.9%、8.9%、8.7%、1.2%。按細胞組成分，發生表達的基因有512個，基因功能涉及細胞組成(細胞膜、細胞壁)、細胞器(膜結合細胞器，非膜結合細胞器)、細胞外區域，所占比例分別為13.6%、23.2%、1.3%(詳見在線輔助性表S2，http://www.ricesci.cn/)。

表 2HEB07-2和IAPAR9差異表達基因數及倍數變化

Table 2. Up- and down-regulated fold of genes in HEB07-2 and IAPAR9.

材料Material下調表達基因Down-regulatedgene下調個數No.ofdown-regulatedgene最大Max平均Average上調表達基因Up-regulatedgene上調個數No.ofup-regulatedgenes最大Max平均Average未變個數Nochange樣品19/樣品1Sample19/Sample1218584.64.3469358.43.447947樣品20/樣品2Sample20/Sample2194020.62.998344.22.951902

樣品1為HEB07-2正常條件下樣品，樣品19為HEB07-2干旱處理后樣品；樣品2為巴西陸稻正常條件下樣品，樣品20為巴西陸稻干旱處理后樣品。

Sample 1 is from HEB07-2 under normal condition, sample 19 is collected from HEB07-2 under drought, Sample 2 is from IAPAR9 under normal condition, sample 20 is collected from IAPAR9 under drought treatment.

圖3干旱脅迫下HEB07-2和IAPAR9差異表達倍數分布

Fig. 3. Change folds of HEB07-2 and IAPAR9 under drought condition.

2.4干旱脅迫下HEB07-2和巴西陸稻根系差異表達基因GO分析

干旱脅迫下，對HEB07-2與巴西陸稻根系差異表達基因進行GO分析后可知(詳見在線輔助性表S3，http://www.ricesci.cn/)，共有4799個已知功能基因表達，其中涉及分子功能的基因共有2248個，包括離子結合 、DNA連接、血紅素結合、葉綠體結合、轉錄調控子活性、電子載體活性及酶活性，分別占46.7%、7.4%、5.9%、2.0%、12.0%、3.9%、1.1%。

生物過程方面已知功能的差異基因有974個，涉及轉錄、氧化還原、防御反應、光合作用、蛋白質泛素化、胞外分泌、代謝過程、植物型細胞壁組織、蛋白質發色團、細胞運動及定位，分別占18.1%、5.3%、2.2%、2.5%、0.6%、0.4%、3.7%、0.3%、0.2%、0.8%。

涉及細胞組成有功能的差異基因有1577，功能涉及細胞器(囊泡、質體、葉綠體等)、細胞組成(細胞膜、細胞壁)、胞外區域、光合系統(光系統Ⅰ、光系統Ⅱ)、泛素連接酶復合體、細胞皮層及鞭毛，所占比例分別為23.7%、24.2%、2.4%、2.8%、0.5%、1.8%。

2.5干旱脅迫下HEB07-2和巴西陸稻根系響應基因的染色體定位

為了分析干旱脅迫下HEB07-2和巴西陸稻根系響應基因在水稻染色體上的分布，我們比較了供試材料在干旱脅迫下總響應基因及誘導、抑制基因在各染色體上的分布個數(圖4)。結果表明，HEB07-2總響應基因在各染色體上分布個數從多到少排序依次為第1、3、2、5、6、4、7、8、11、12、10和9染色體。其中，第1、3、2、5、4染色體上受干旱脅迫抑制基因多于受脅迫誘導基因，而這幾條染色體也是總響應基因最多的幾條染色體；其余染色體上受干旱脅迫誘導基因數量大于受干旱脅迫抑制基因的數量，這幾條染色體上總響應基因數量小于其他染色體。而巴西陸稻在干旱脅迫下染色體上總響應基因數量在各染色體上分布個數從多到少排序依次是第1、3、2、5、6、4、7、11、8、9、12、10染色體。除第6、11染色體外，巴西陸稻其他染色體上均是受干旱抑制的基因數量多于誘導基因數量。在未知功能基因中HEB07-2受干旱脅迫誘導的基因遠遠大于受干旱脅迫抑制的基因數量，而巴西陸稻則是受抑制的基因數量遠大于受誘導的數量(圖5)。

2.6干旱脅迫下HEB07-2和巴西陸稻表型和根系生理變化

由圖6-A～B可知，干旱脅迫下IAPAR9根系超氧陰子產生速率和丙二醛含量顯著提高，與對照比達到極顯著水平，而HEB07-2上升幅度小，說明根系受傷害程度輕。干旱脅迫下HEB07-2根系可溶性糖含量顯著增高，與對照差異極顯著。

由圖6-D～F可知干旱脅迫下HEB07-2根系超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性顯著增高，而IAPAR9只有過氧化物酶活性顯著增大。

圖6-G～I顯示干旱脅迫下HEB07-2根系抗壞血酸過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶、脫氧抗壞血酸還原酶活性均顯著增高，且抗壞血酸過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶增高幅度都大于IAPAR9。

A, HEB07-2; B, IAPAR9.

圖4HEB07-2和IAPAR9干旱脅迫下響應基因染色體分布

Fig. 4. Distribution of regulated genes on rice chromosome under drought stress.

圖5HEB07-2和IAPAR9響應干旱脅迫的未知基因數

Fig. 5. Unknow genes of HEB07-2 and IAPAR9 under drought stress.

2.7實時熒光定量PCR分析

為驗證芯片數據準確與否，隨機選取HEB07-2和IAPAR9中表達發生變化的4個基因設計引物，進行實時熒光定量PCR分析。其中，2個基因與抗氧化物酶相關，為LOC_Os08g32840、LOC_Os02g02400；2個基因與鉀離子轉運相關，為LOC_Os03g37840、LOC_Os04g52390。結果如圖8-A～B所示，在HEB07-2的實時熒光定量分析結果中，LOC_Os03g37840和LOC_Os04g52390略低于芯片分析的結果，LOC_Os08g32840和LOC_Os02g02400結果高于芯片分析的結果；在IAPAR9中，LOC_Os08g32840、LOC_Os02g02400的實時熒光定量分析結果略高于芯片分析的結果，LOC_Os03g37840、LOC_Os04g52390結果低于芯片分析的結果。從幾個基因的表達趨勢來看，實時熒光定量分析結果與基因芯片分析結果基因的表達趨勢基本一致。證明芯片分析結果是可靠的。

3　討論

近年來研究人員利用表達譜技術、轉基因技術等在鑒定植物耐旱基因方面做了大量工作[10,11, 14-18]。侯欣等[17]利用基因芯片篩選到了一個候選基因OsSKIP，轉入該基因的水稻幼苗在缺水條件下生存能力明顯增強。熊立仲等[18]在水稻中鑒定了一個控制水稻葉片蠟質積累的基因DWA1，缺失該基因的dwa1突變體對干旱十分敏感。在本研究中，雜草稻以基因表達量上調這種主動的調控形式來避害，而巴西陸稻的負調控水平高于正向的調控則表明其避害的方式與雜草稻可能存在本質的區別。從脅迫后的兩種類型水稻生理指標與生長指標角度分析，雜草稻HEB07-2對于干旱脅迫有更強的耐受程度，其響應程度體現出了生物學效應與遺傳學效應，是一類可以應用于抗旱遺傳改良的優異種質資源。干旱脅迫下兩種抗旱類型水稻重疊的轉錄本的比例較小，表明稻屬植物應對干旱脅迫的機制十分復雜。值得一提的是，從遺傳背景角度分析，雜草稻HEB07-2具有古老粳稻的基因組遺傳組成，而巴西陸稻屬于具有較高秈稻血緣的外來粳稻品種。因此，這種遺傳背景的差異同樣可以在表達譜中體現出來。

圖6干旱脅迫下HEB07-2和IAPAR9根系生理指標變化

Fig. 6. The physiological index change in HEB07-2 and IAPAR9 under drought condition.

干旱脅迫下HEB07-2生物過程相關基因中表達數量最多的幾類基因涉及轉錄調控(215個)、轉錄(116個)、依據DNA轉錄調節(122個)、RNA代謝(122個)、金屬離子轉運(40個)。當外界環境發生變化時，由轉錄因子控制的基因會對環境做出應答。Ali Moumeni等[19]研究表明在干旱脅迫中有2336個基因表達發生變化，其中1461個基因來自于轉錄因子基因家族，占變化基因總數的62.5%。本研究發現干旱脅迫下雜草稻差異表達基因中，轉錄家族基因也占很大比例，這有利于提高植物的耐旱性[20]。本研究中，離子轉運基因表達數量也較多，其中鉀離子轉運相關基因上調表達幅度較大，LOC_Os03g37840上調表達8.3倍、LOC_Os04g52390上調表達3.8倍，鉀是植物體內活細胞進行新陳代謝的重要陽離子，一切生理生化反應差不多都有鉀參加，是植物需要最多的陽離子，它能夠促進根系吸水，提高植物水分利用效率，并能夠活化多種酶，促進蛋白質的合成，從而提高氮素的利用率，所以干旱脅迫下鉀離子轉運活性相關基因上調表達，有利于植物體內鉀離子的積累，提高水分利用效率，促進功能蛋白合成，提高肥料利用效率，從而幫助植物渡過逆境脅迫[21-24]。除此以外，涉及細胞過程相關基因上調表達的還有幾丁質代謝相關基因、次生代謝過程相關基因、細胞氨基酸衍生物合成相關基因。這些基因的表達與HEB07-2和巴西陸稻相應的抗旱生理指標可以很好地印證。因此，這些生物過程相關基因對于雜草稻抗旱具有重要的貢獻。

圖7干旱脅迫下HEB07-2和IAPAR9表型變化

Fig. 7. Phenotype of HEB07-2 and IAPAR9 under drought condition.

A, HEB07-2; B, IAPAR9; 1, LOC_Os03g37840; 2, LOC_Os04g52390; 3, LOC_Os08g32840; 4, LOC_Os02g02400.

圖8HEB07-2和IAPAR9實時熒光定量PCR結果與芯片數據的比較

Fig. 8. Comparison of microarray data with real-time PCR results in HEB07-2 and IAPAR9.

干旱脅迫下雜草稻HEB07-2涉及最多的細胞組成差異表達基因為膜系統組成相關基因(184個)、內在膜蛋白(187個)、細胞質囊泡(193個)以及細胞質膜結合囊泡(193個)等。本研究發現，雜草稻之所以能很好地抵御干旱脅迫，保持膜系統的完整性是其中最重要的原因之一。這與基因組表達譜高度吻合，這種吻合性也同樣體現在細胞壁的合成上。研究表明幾丁質是植物細胞壁重要組成部分，干旱脅迫可以通過影響幾丁質代謝進而影響植物細胞壁的合成，而在幾丁質代謝相關基因的表達上雜草稻HEB07-2同樣體現出很高的正向調控水平。因此，這些細胞組成相關基因對于雜草稻出眾的抗旱能力有著很好的解釋。

干旱脅迫期間，HEB07-2有關分子功能差異基因，主要有離子結合(466個)、金屬離子結合(428個)、蛋白激酶活性(178個)、蛋白質絲氨酸/組氨酸激酶活性(154個)、轉錄調控因子活性(136個)、電子載體活性等。其中，金屬離子結合、電子載體活性與氧化還原酶合成有關，這些基因的表達有利于提高擬南芥耐旱和耐高溫的能力[25]，以及水稻對長期干旱脅迫的適應[26]。本研究表明，質膜較高的抗氧化能力是雜草稻耐旱的重要原因，這一過程中相關的酶活性提高是關鍵所在，干旱脅迫促使HEB07-2超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、谷胱甘肽還原酶(GR)、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)的活性上升，維持活性氧代謝平衡，提高抗旱能力，同樣在表達譜中與氧化還原相關基因的表達水平處于非常突出的地位。

巴西陸稻在干旱脅迫下涉及生物過程的基因主要包括轉錄調控(126個)、依賴DNA的轉錄控制(74個)、RNA代謝調控過程(74個)、轉錄(53個)、離子轉運(34個)。其下調表達基因主要有鉀離子轉運、谷氨酸家族氨基酸代謝過程、細胞氨基酸合成過程。干旱脅迫下鉀離子通道蛋白基因表達受抑，說明干旱脅迫在一定程度上影響了巴西陸稻細胞內鉀離子轉運，加劇了細胞的滲透脅迫，導致干旱損傷。同時干旱脅迫導致細胞氨基酸合成減少，進而影響蛋白質的功能，這也是干旱損傷的表現。生物過程中上調表達的主要與抵抗細菌的基因相關，屬于OsPR4家族，受干旱脅迫等非生物脅迫誘導，過表達OsPR4家族基因有利于植物提高耐旱性[27]。巴西陸稻細胞組成相關基因發生表達變化的主要涉及內在膜蛋白(81個)、膜完整性(79個)、細胞質膜結合囊泡(78個)等。其中上調表達涉及的基因有胞外區域調節基因，下調表達的基因主要有細胞壁。有研究表明輕度干旱脅迫下根系仍能維持生長[28]，在本研究中涉及細胞壁合成的幾個基因中，CSLC-1(LOC_Os01g56130)、XG_FTase(LOC_Os06g10980)上調表達，而CSLE-6(LOC_Os09g30130)、XG_FTase(LOC_Os02g52640)、CSLA-9(LOC_Os06g42020)、CSLC2(LOC_Os09g25900)均下調表達。眾多研究表明CslA亞家族編碼(1,4)-β-D-甘露聚糖合成酶，而CslC-1家族編碼(1,4)-β-D-葡聚糖合成，其是木葡聚糖的骨架組成部分[29-31]。較低的細胞水勢使玉米根系木葡聚糖活性上升，是為維持根系在脅迫條件下的生長。本研究結果表明，干旱脅迫下巴西陸稻根系與細胞壁合成相關基因既有上調表達又有下調表達，但以下調表達為主，說明干旱已經影響了其細胞壁的合成，是遭受干旱脅迫傷害的一種表現。巴西陸稻涉及分子功能的基因發生表達變化的主要有離子結合(203個)、DNA結合(123個)、轉錄調節因子活性(80個)、轉錄因子活性(59個)、特異序列DNA結合(41個)等。大多以下調表達為主，涉及碳水化合物激酶活性、鉀離子跨膜轉運體活性、金屬離子跨膜轉運體活性、氧化還原酶活性等。這些都說明與雜草稻相比巴西陸稻易受干旱脅迫的危害。

HEB07-2與巴西陸稻干旱脅迫下響應途徑的差異表現為HEB07-2在鉀離子轉運、次生物質代謝、細胞生長、葡萄糖代謝、跨膜離子轉運器活性、亞鐵血紅素結合體、氧化還原酶活性等方面基因顯著上調。研究結果表明控制SOD(LOC_Os07g46990)、POD(LOC_Os01g18970)、CAT(LOC_Os02g02400)、APX(LOC_Os07g49400)、MDHAR(LOC_Os08g32840)、GR(LOC_Os02g56850)酶活性的基因與巴西陸稻比分別上調表達1.9倍、6.43倍、5.20倍、2.39倍、6.07倍、1.14倍，這與生理研究結果一致，即干旱脅迫下雜草稻抗氧化酶活性更高，能夠及時清除ROS，保持細胞內ROS代謝平衡，減輕干旱脅迫對細胞產生的傷害，表明HEB07-2與巴西陸稻比在生理生化代謝方面更適應干旱脅迫。前人研究表明干旱脅迫下耐旱品種抗氧化酶系基因表達顯著上調[19]，與本研究結果一致。維持植物根系在干旱脅迫下的生長十分重要，這需要協調細胞內眾多過程[32]。本研究結果表明HEB07-2和巴西陸稻比關于細胞生長(cell growth)的差異表達基因有29個，平均上調4.1倍，這說明在干旱脅迫下HEB07-2根系受到脅迫較輕，有更強的生長勢，耐旱性強于巴西陸稻，這與Bartels研究[28]結果一致。此外，HEB07-2與鉀離子轉運相關基因表達活性也顯著高于巴西陸稻，這有利于提高HEB07-2的水分利用率及滲透調節能力，進而提高耐旱能力。

本研究通過對干旱脅迫后北方雜草稻HEB07-2與巴西陸稻表達譜的比較研究，對不同稻屬植物的抗旱分子機制有了進一步的認識。另外，本研究雖然對差異表達基因進行了GO分析，但仍然缺乏系統解析不同基因家族對于雜草稻在更高抗旱水平上的表達調控的特點，這有待于進一步研究。

水稻抗旱的分子機制被普遍認為是所有非生物脅迫中最復雜的，雖然前人有過許多正向遺傳學研究的嘗試，也取得了一定的進展，然而并沒有克隆到主效的抗旱相關基因。關于水稻耐旱反向遺傳學的研究也有一定的進展，但鑒定到的抗旱位點很難確定遺傳效應，在不同的遺傳背景或不同的生物學重復中很難重復。鑒于抗旱稻屬植物分子遺傳機制的復雜性，在今后的研究中將正向遺傳學與反向遺傳學相互結合，即對可以定位到數量性狀基因座中具有大的遺傳貢獻的表達差異位點進行著重分析，有望大大簡化抗旱分子遺傳機制的復雜程度，定位、克隆到可以在育種中應用的具有遺傳效應的主效基因。

在線輔助信息：有3個在線輔助性表S1、S2和S3放在中國水稻科學網站上，網址為http://www.ricesci.cn/。

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Global Genome Expression Analysis of Root Genes under Drought Stress in Weedy Rice and Up-land Rice

DING Guo-hua1,2,#, SUN Jian2,#, YANG Guang3, ZHANG Feng-ming1, BAI Liang-ming1, SUN Shi-chen1, JIANG Shu-kun1, WANG Tong-tong1, ZHENG Hong-liang1, XIA Tian-shu1, SHEN Xi-hong4, MA Dian-rong2, *, CHEN Wen-fu2,*

(1Postdoctoral Scientific Research Station of HAAS/Cultivation and Farming Research Institute of HASS/ Northern Japonica Rice Molecular Breeding Joint Research Center, Harbin 150086, China；2Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China；3Institute of Economic Crop of Liaoning, Liaoyang 111000, China；4China National Rice Research Institute，Hangzhou 310006，China；#These authors contributed equally to this work；*Corresponding author, E-mail： madianrong@163.com， wfchen5512@126.com)

The expression changes of root genes in drought-resistance weedy rice HEB07-2 (Oryzasativaf.spontanea) and up-land rice IAPAR9 (Oryzasativa) were analyzed under polyethylene glycol(PEG)-simulated with drought stress condition with Affymetrix GeneChip rice genome array. The results indicated that the extent and direction of transcriptome response of HEB07-2 and IAPAR9 to drought differed greatly. For HEB07-2, among 6878 expressed genes, 4693 were up-regulated and 2185 were down-regulated under drought condition. For IAPAR9, among 2923 expressed genes,983 were up-regulated and 1940 were down-regulated. Analysis of differentially expressed genes in HEB07-2 and IAPAR9 showed that the weedy rice HEB07-2 had a higher changing fold than the up-land rice IAPAR9. Gene ontology analysis revealed that genes of HEB07-2 in potassium ion transporting(GO： 0006813), secondary metabolite(GO： 0019748), cell growth(GO： 0016049), glucose metabolism(GO：0006006), transmembrane ion transporter activity(GO：0015075), ferroheme coalition(GO：0020037), oxidordeuctase activity(GO：0016491)were significantly up-regulated in comparing with IAPAR9. These were consistent with the physiological and phenotypic data.

weedy rice; root; gene expression profiling; drought resistance

2015-12-09； 修改稿收到日期: 2016-01-23。

黑龍江省農業科學院博士后工作站；哈爾濱市科技局項目(2014RFQYJ125)；黑龍江省農業科學院創新工程項目(2014QN006)；黑龍江省農業科學院博士人員科研啟動金項目(201507-16)；國家水稻產業技術體系項目(CARS-01-43); 北方寒地粳稻資源研究與新品種選育項目(2014BAD01B03-02)。

Q786; Q945.78

A

1001-7216(2016)05-0458-11

丁國華， 孫健， 楊光, 等. 干旱脅迫下雜草稻和栽培稻根系基因表達差異研究. 中國水稻科學， 2016， 30(5)： 458-468.