水稻粒寬基因GS5的功能標記開發和單倍型鑒定

裔傳燈　王德榮　蔣偉　李瑋　成曉俊　王穎　周勇　梁國華　顧銘洪

(揚州大學 江蘇省作物遺傳生理國家重點實驗室培育點/糧食作物現代產業技術協同創新中心/教育部植物功能基因組學重點實驗室， 江蘇 揚州225009；*通訊聯系人， E-mail: cdyi@yzu.edu.cn)

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水稻粒寬基因GS5的功能標記開發和單倍型鑒定

裔傳燈*王德榮蔣偉李瑋成曉俊王穎周勇梁國華顧銘洪

(揚州大學 江蘇省作物遺傳生理國家重點實驗室培育點/糧食作物現代產業技術協同創新中心/教育部植物功能基因組學重點實驗室， 江蘇 揚州225009；*通訊聯系人， E-mail: cdyi@yzu.edu.cn)

YI Chuandeng, WANG Derong, JIANG Wei, et al. Development of functional markers and identification of haplotypes for rice grain width geneGS5. Chin J Rice Sci, 2016, 30(5): 487-492.

水稻粒寬是影響籽粒粒形的重要因素之一，也是一個與水稻產量和稻米品質密切相關的重要性狀。在基因GS5序列分析的基礎上，對該基因第2外顯子的ACC/CTA和第9外顯子A/C的兩個變異位點分別開發了功能標記，并將其用于294份水稻微核心種質和2007-2013年江蘇省審定的65份粳稻品種的基因型鑒定。研究結果表明，這兩個變異位點的等位變異在水稻籽粒的粒長、粒寬和長寬比性狀上存在顯著或極顯著的差異；其在水稻微核心種質中組成的4種單倍型在水稻秈亞種的粒寬、粒厚和長寬比性狀上存在極顯著的差異，在粳亞種的粒寬和長寬比性狀上存在極顯著的差異；而江蘇省審定的粳稻品種中僅發現Hap1和Hap2兩種單倍型，其分別有64個和1個代表性品種。這些研究結果為水稻產量和稻米品質育種中充分利用GS5的優異等位基因或單倍型奠定了基礎。

水稻； 粒形； 基因GS5； 功能標記； 單倍型

水稻粒形性狀包括粒長、粒寬、粒厚和長寬比[1]。它對稻米品質有著重要的影響[2]，尤其是稻米的外觀品質(堊白粒率、堊白度)和碾磨加工品質(糙米率、精米率和整精米率)，如GW8[3]和GW7[4]。同時，通過影響千粒重、水稻粒形性狀對水稻單產水平也有著重要的作用[5]。如GW8[3]、GS3[6]、qGL3[7]、qSW5/GW5[8, 9]、GS5[10]和TGW6[11]。因此，水稻粒形性狀遺傳調控機理的研究對水稻產量育種和稻米品質育種都有著重要的指導意義。

GS5是決定水稻粒形的重要基因之一。Li等[10]研究發現GS5是編碼類絲氨酸羧肽酶的蛋白質，其對粒寬、籽粒灌漿速率和粒重有著正調控作用。相對于水稻品種H94的gs5而言，水稻品種珍汕97的GS5正向調節細胞周期上游的基因促進有絲分裂和增加細胞數量，從而增加粒寬，加快籽粒灌漿，結果導致粒重和單株產量得以提高；同時轉基因證實來自水稻品種珍汕97的GS5啟動子表達水平比較高，并與籽粒增大有著高度的相關性。Xu等[12]進一步研究表明轉錄起始點上游-1109 bp和-1032 bp的兩處單堿基變異對啟動子的差異表達有重要的影響。目前，該基因其他的變異位點對水稻粒形性狀有何效應還不清楚。為了全面認識GS5不同等位變異的效應，本研究對該基因未知功能的錯義突變開發了相應的功能標記，結合水稻微核心種質和近年來江蘇審定的粳稻的基因型檢測，分析了這些變異位點和組合(單倍型)對水稻粒形性狀的影響，以期為水稻產量和稻米品質育種提供理論依據和快捷的選擇手段。

1　材料與方法

1.1供試材料

供試水稻材料包括來自國內外不同稻作區的水稻微核心種質294份[13]以及2007-2013年江蘇省審定的粳稻品種65份[14]，它們分別引自中國農業大學和江蘇省農業科學院。鑒于上述研究材料感光性存在明顯的差異，為了確保正常抽穗，將所有供試水稻品種于2014年11月種植在海南陵水(短日照條件)，2015年1月移栽大田，田間管理同常規水稻品種。待水稻籽粒蠟熟后收種，充分曬干后進行水稻籽粒相關性狀的測量。

1.2水稻籽粒粒形相關性狀的測定

水稻種子收獲風干后，挑選飽滿成熟種子，用游標卡尺(精確到0.01 mm)測量粒長、粒寬和粒厚，5次重復，計算平均值。用電子天平測定1000粒成熟烘干種子的質量，3次重復，計算千粒重的平均值。

1.3基因GS5 序列變異的分析和功能標記的設計

根據水稻粒形基因GS5的研究結果[10]，從NCBI網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載基因到GS5的相關DNA序列，即來源于秈稻品種珍汕97的cDNA序列(JN256056)和基因組DNA序列(JN256058)，來源于秈稻品種H94的cDNA序列(JN256055)和基因組DNA序列(JN256057)。以上述序列作為種子序列，在NCBI網站水稻基因組數據庫中檢索到1條高度同源的基因組DNA序列(NC_008398.2)；在水稻基因組注釋計劃(Rice Genome Annotation Project)網站cDNA數據庫中檢索到2條高度同源的cDNA序列(AK106800和CT833291)。借助BioEdit軟件對上述序列進行比對分析。

利用Primer Premier 5.0 軟件，本研究對GS5第2和第9外顯子的兩個錯義突變分別設計了酶切擴增多態性序列(cleaved amplified polymorphic sequence, CAPS)標記和衍生酶切擴增多態性序列(derived cleaved amplified polymorphic sequence, dCAPS) 標記。引物的合成和序列的測定在上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.4DNA提取

收集供試材料分蘗盛期新鮮幼嫩的葉片，采用SDS法提取水稻基因組DNA。

1.5PCR擴增、酶切和電泳

PCR反應體系含50 ng/μL基因組DNA 2.0 μL，2 μmol/L引物F和R各2.5 μL，10×緩沖液2.0 μL，25 mmol/L MgCl22.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.6 μL，5 U/μLTaqDNA聚合酶(TaKaRa Code: R001C) 0.2 μL，滅菌雙蒸補足至20 μL。PCR在德國艾本德Mastercycler pro梯度PCR儀上進行，反應條件如下： 94℃下預變性5 min； 94℃下30 s；55～60℃下30 s；72℃下1 min，共35個循環； 72℃下再延伸10 min。反應產物在3.0%瓊脂糖凝膠上進行水平電泳分離。

利用開發的PCR引物擴增GS5的目標片段，進一步用于酶切反應。酶切反應體系為10 μL，分別包含PCR產物5 μL，10×緩沖液 1 μL，DNA限制性內切酶(10 U/μL) 0.25 μL，ddH2O 3.75 μL。混勻后置于37℃恒溫水浴鍋酶切3～4 h，酶切產物在3.0%瓊脂糖凝膠上進行電泳，EB染色，經紫外凝膠成像系統成像。

1.6數據分析

本研究中所有數據的分析和處理利用Excel和SPSS軟件進行。

表1基于GS5第2和第9外顯子DNA序列變異設計的PCR引物

Table 1. PCR primers based on the GS5 DNA sequence variations of exon 2 and exon 9.

標記名稱Marker變異位點所在區域aRegionofsequencevariationa基因型Genotype引物序列Primersequence標記類型MarkertypeGS5-1Exon2(817bp)ACC/CTAF:GCAAGACAAGGAGCAGCACTACAPS-DdeⅠR:AGAAGCCGACCCCAACAGGS5-2Exon9(3796bp)A/CF:CAGTTCTCGGTACTGCGTCGAdCAPS-SalⅠR:CACAAACCTCCCAGCAACC

a以GS5的基因組序列JN256058作為參照。

aGenomic DNA sequence(JN256058) of geneGS5 as a reference.

表2GS5不同變異位點的籽粒粒形性狀及其t測驗

Table 2. Grain-related traits and their t-tests of different alleles in geneGS5.

性狀TraitGS5-1基因型Genotype樣本數Samplenumber平均數±標準誤Mean±SEt值tvalueGS5-2基因型Genotype樣本數Samplenumber平均數±標準誤Mean±SEt值tvalue粒長Grainlength/mmACC1708.03±0.082.98**A2108.09±0.072.33*CTA1248.34±0.07C838.33±0.08粒寬Grainwidth/mmACC1703.05±0.032.21*A2103.04±0.032.01*CTA1242.97±0.02C832.96±0.03粒厚Grainthickness/mmACC1702.13±0.011.03A2102.13±0.011.68CTA1242.11±0.01C832.10±0.01長寬比RatiooflengthtowidthACC1702.70±0.052.29*A2102.72±0.042.04*CTA1242.84±0.04C832.85±0.05千粒重1000-grainweight/gACC17024.71±0.310.26A21024.74±0.280.04CTA12424.82±0.30C8324.75±0.33

*和**分別表示在0.05水平和0.01水平上差異顯著。

*and**mean significant difference at the 0.05 and 0.01 levels, respectively.

2　結果與分析

2.1基因序列分析和分子標記設計

DNA序列分析表明GS5共有10個外顯子和9個內含子。序列比對發現該基因的基因組DNA有37處序列變異，其中25個變異發生在啟動子區，已有研究證實啟動子區域的序列變異對該基因的轉錄水平有著重要的影響[10, 12]。除此之外，9個變異發生在內含子區域，3個變異發生在外顯子區域。內含子在基因轉錄為成熟RNA時會被剪切掉，但是這些外顯子區的變異對籽粒性狀有何作用還不清楚。以寬粒珍汕97的GS5基因組序列JN256058作為參照，第1外顯子28 bp處、第2外顯子817 bp處和第9外顯子3796 bp處分別有6 bp(GCGGCG)的插入、三堿基(ACC/CTA)變異和單堿基(A/C)變異。這3處變異都引起氨基酸序列的變化，其中前兩個變異高度相關。因此，本研究對基因GS5的第2和第9外顯子的兩個錯義突變位點分別開發了CAPS標記GS5-1和dCAPS標記GS5-2(表1)。

對于GS5第2外顯子817 bp處的ACC/CTA變異而言，利用標記GS5-1在水稻品種中擴增出長度為225 bp的PCR產物(圖1-A的泳道1和2)，經過限制性內切酶DdeⅠ酶切后，能夠被切成196 bp條帶的水稻品種為珍汕97，其基因型為CTA(圖1-A的泳道4)；PCR產物仍為225 bp的水稻品種為日本晴，其基因型為ACC(圖1-A的泳道3)。

對于GS5第9外顯子3796 bp處的A/C單堿基變異而言，我們利用標記GS5-2在水稻品種中擴增出長度為188 bp的PCR產物(圖1-B的泳道1和2)，經過限制性內切酶SalⅠ酶切后，能夠被切成169 bp條帶的水稻品種為珍汕97，其基因型為C(圖1-B的泳道4)；PCR產物仍為188 bp的水稻品種為日本晴，其基因型為A(圖1-B的泳道3)。

表3GS5不同單倍型籽粒粒形性狀的方差分析

Table 3． Analysis of variances (ANOVA) of different haplotypes in gene GS5.

籽粒性狀與變異來源Graintraitandsourceofvariation秈亞種indica自由度df平方和MeansquareF值Fvalue粳亞種japonica自由度df平方和MeansquareF值Fvalue粒長Grainlength 單倍型間Amonghaplotypes30.9291.27232.4823.493* 單倍型內Withinhaplotypes1540.7301320.711粒寬Grainwidth 單倍型間Amonghaplotypes30.5686.131**30.3773.940** 單倍型內Withinhaplotypes1540.0931320.096粒厚Grainthickness 單倍型間Amonghaplotypes30.1297.354**30.0381.305 單倍型內Withinhaplotypes1540.0181320.029長寬比Ratiooflengthtowidth 單倍型間Amonghaplotypes31.4245.145**30.9735.141** 單倍型內Withinhaplotypes1540.2771320.189千粒重1000-grainweight 單倍型間Amonghaplotypes331.5932.47034.1650.279 單倍型內Withinhaplotypes15412.78813214.953

*和**分別表示在0.05水平和0.01水平上差異顯著。

*and**mean significant difference at the 0.05 and 0.01 levels, respectively.

表4GS5不同單倍型對水稻粒形性狀的差異顯著性分析

Table 4. Analysis of the difference of grain-related traits based on different haplotypes in geneGS5.

單倍型HaplotypeGS5-1GS5-2樣品數Number粒長Grainlength/mm粒寬Grainwidth/mm粒厚Grainthickness/mm長寬比Ratiooflengthtowidth千粒重1000-grainweight/g秈亞種indicaHap1ACCA578.61±0.14 2.74±0.04b2.00±0.02b3.20±0.08a23.07±0.52Hap2ACCC88.13±0.233.01±0.11a2.10±0.03ab2.75±0.18b23.60±0.41Hap3CTAA348.36±0.132.99±0.05a2.13±0.02a2.84±0.08b24.76±0.67Hap4CTAC598.38±0.102.93±0.04a2.09±0.01a2.89±0.06b24.65±0.41粳亞種japonicaHap1ACCA1027.70±0.08b3.23±0.03a2.20±0.02 2.41±0.04b25.68±0.40Hap2ACCC38.28±0.51a3.03±0.27b2.15±0.082.77±0.28a25.51±2.22Hap3CTAA188.19±0.22a3.01±0.04b2.12±0.032.73±0.09a24.80±0.85Hap4CTAC138.28±0.18a3.03±0.09b2.14±0.032.77±0.14a25.76±0.76

表中籽粒相關性狀的數據為平均數±標準誤。數據后跟相同小寫字母表示差異未達顯著水平(最小顯著差數法)。

All data about grain-related traits were given as mean±SE. Values followed by common lowercase letters are not significantry different by least significant difference(LSD) test.

2.2GS5不同變異位點對水稻粒形性狀的影響

為了解析GS5第2和第9外顯子的兩個變異位點對水稻籽粒相關性狀的影響，我們利用標記GS5-1和GS5-2分別對水稻微核心種質的基因型進行了測定，并對每個位點的不同變異類型進行了t測驗。從表2中可以看出，GS5的第2和第9外顯子的兩個變異位點對水稻籽粒的粒長、粒寬和長寬比的影響達到了顯著或極顯著的水平；但這兩個變異位點對水稻千粒重的影響沒有達到顯著水平，這表明GS5的第2和第9外顯子的兩個變異位點對水稻籽粒的粒形性狀均有重要影響。

2.3基因GS5的單倍型類型及其效應分析

為了進一步明確GS5這兩個變異位點的不同組合(單倍型)對水稻籽粒相關性狀的效應，我們依據這兩個變異位點在水稻微核心種質中的不同組合將GS5分成了4個單倍型(表4)。鑒于秈粳亞種間的籽粒性狀差異明顯，我們進一步利用GS5的4個單倍型對水稻微核心種質按秈粳亞種分別進行了方差分析(表3)和多重比較(表4)。

A-引物GS5-1的擴增產物和DdeⅠ酶切電泳。B-引物GS5-2的擴增產物和SalⅠ酶切電泳。M, DL2000 DNA 標記(TaKaRa); 泳道1和3為水稻品種日本晴；泳道2和4為珍汕97。

A, PCR amplification products and their correspondingDdeⅠ-digested ones of primer GS5-1; B, PCR amplification products and their correspondingSalⅠ-digested ones of primer GS5-2. M, DL2000 DNA Marker(TaKaRa). Lanes 1 and 3, Nipponbare; Lanes 2 and 4, Zhenshan 97.

圖1水稻基因GS5特異引物GS5-1(A)和GS5-2(B)的PCR擴增和酶切鑒定

Fig. 1. PCR identification and enzyme-digested characterization of specific primers GS5-1(A) and GS5-2(B) for gene GS5 in rice.

在水稻秈亞種中，從表3中可以看出，GS5的不同單倍型在粒寬、粒厚和籽粒長寬比這3個粒形性狀都存在極顯著的差異。表4的多重比較進一步表明GS5的不同單倍型對上述3個粒形性狀也有著不同程度的影響，其中，以單倍型Hap1的粒寬最小，粒厚最小，長寬比最大。

在水稻粳亞種中，從表3中可以看出，GS5的不同單倍型在粒厚和籽粒長寬比這2個粒形性狀上都存在極顯著的差異，在粒長性狀上也存在顯著的差異。表4的多重比較進一步表明GS5的不同單倍型對上述3個粒形性狀也有著不同程度的影響，其中，以單倍型Hap1的粒長最小、粒寬最大，長寬比最小。這些結果表明水稻秈粳亞種間調控粒形性狀的遺傳基礎有所差異。

2.4近年來江蘇育成品種的GS5單倍型分析

為了更好地將上述研究結果應用到江蘇省的水稻育種實踐中，我們對2007-2013年江蘇省審定的65份粳稻品種GS5的兩個目標變異位點進行了基因型測定，結果發現近年來江蘇省審定的粳稻品種中，只有1個水稻品種(鎮稻13)利用GS5的Hap2單倍型，而其余64個水稻品種為同一單倍型(Hap1)。這表明江蘇省近年來育成水稻品種利用粒形基因GS5的等位變異較少。

3　討論

在過去的十年間，隨著水稻基因組的快速發展，許多粒形相關的QTL被定位和克隆。與粒寬有關的基因為GW8[3]、GW7[4]、qSW5/GW5[8, 9]、GS5[10]、GW2[15]、GS6[16]；與粒長有關的基因為GS3[6]、qGL3/qGL3.1[7, 17, 18]；與籽粒充實有關的基因為GS5[10]、GIF1[19]。這些基因通過調節水稻籽粒的大小和形狀(即粒形)，提高千粒重，進而提高了水稻的產量水平。除GS5和GW8為正調控因子外，其余基因對水稻粒形都起負調控作用。Li等[10]研究發現，將窄粒品種H94的GS5的cDNA片段接到35S啟動子或來源于寬粒品種珍汕97基因GS5的啟動子下，構建的轉基因水稻表現為粒寬增加和粒重提高，這表明啟動子轉錄效率的高低是影響GS5調控粒寬和粒重的主要因素。本研究中利用水稻微核心種質，我們也發現GS5的第2和第9外顯子兩個錯義突變對水稻粒長、粒寬和長寬比性狀上存在顯著或極顯著的差異。在GS5的單倍型分析時，秈亞種的不同單倍型在粒寬、粒厚和長寬比性狀上存在極顯著的差異；粳亞種的不同單倍型在粒寬和長寬比性狀上存在極顯著的差異，在粒長性狀上存在顯著的差異；不論秈亞種和粳亞種，不同單倍型對粒重的影響沒有達到顯著水平，這可能是因為水稻的千粒重受多個基因位點調控，且與粒形性狀有著不同的調控機制，導致在遺傳背景復雜的水稻微核心種質中，難以準確檢測GS5對水稻千粒重的效應。

雖然許多與水稻產量相關的重要功能粒形基因已被克隆，但是當前水稻育種工作中還很少涉及到這些基因，其原因主要是這些基因缺乏成本低廉且簡便實用的基因功能標記，這些基因有多少等位變異類型及其效應如何等等。利用近等基因系和轉基因的方法，Li等[10]證實了GS5的啟動子變異是該基因對水稻粒形起作用的主要原因。Xu等[12]進一步通過截短啟動子的方法證實啟動子區的-1109 bp和-1032 bp的兩處單堿基變異對GS5的表達水平有重要的影響。本研究發現GS5的第2和第9外顯子的兩個錯義突變對水稻粒形性狀也有著明顯的效應，為此我們分別開發了基于這些序列變異的PCR標記，為其應用到水稻育種實踐提供了便利的選擇方法，但是其遺傳機理還值得深入研究。

謝辭：中國農業大學李自超教授和張洪亮博士提供了水稻微核心種質；江蘇省農業科學研究院王軍博士提供了2007-2013年江蘇省審定的粳稻品種，在此一并表示感謝。

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Development of Functional Markers and Identification of Haplotypes for Rice Grain Width Gene GS5

YI Chuan-deng*, WANG De-rong, JIANG Wei, LI Wei, CHENG Xiao-jun, WANG Ying, ZHOU Yong,LIANG Guo-hua, GU Ming-hong

(Jiangsu Key Laboratory of Crop Genetics and Physiology/Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops/Key Laboratory of Plant Functional Genomics of the Ministry of Education, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China;*Corresponding author， E-mail: cdyi@yzu.edu.cn)

As a major component of rice grain shape, the grain width is an important trait which is correlated with the rice yield and quality. Based on the alignment of geneGS5 genomic DNA sequence, two functional markers were developed based on two missense polymorphisms (ACC/CTA in the exon2, A/C in the exon9, respectively). Subsequently, the markers were used to identify the genotypes of geneGS5 in the 294 accessions of a rice mini-core collection and 65japonicavarieties released in Jiangsu Province from 2007 to 2013. We found that the allelic variations at the two target loci had significant or extremely significant differences in the grain shape traits(grain length, grain width and ratio of length to width). Based on the two variation sites of geneGS5, four haplotypes (combinations) were found in the rice mini-core collection, and had extremely significant effect on grain width, grain thickness and ratio of length to width in theindicagroup, and on grain width and ratio of length to width in thejaponicagroup, respectively. While injaponicavarieties released by Jiangsu, only two haplotypes, Hap1 (represented by 64 varieties) and Hap2 (represented by one variety) were found. The results will lay a foundation for the application of the useful allelic variations or haplotypes of geneGS5 to the rice yield and quality breeding program.

rice; grain shape; geneGS5; functional markers; haplotype

2016-03-07； 修改稿收到日期: 2016-04-12。

國家自然科學基金資助項目(31571624, 31071382)； 國家重點基礎研究發展計劃資助項目(2010CB125904, 2013CBA01405)； 江蘇省高校自然科學研究重大項目(15KJA210004)； 江蘇省重點研發計劃資助項目(BE2015341)； 江蘇高校優勢學科建設工程資助項目。

Q755; S511.032

A

1001-7216(2016)05-0487-06

裔傳燈, 王德榮, 蔣偉，等. 水稻粒寬基因GS5的功能標記開發和單倍型鑒定. 中國水稻科學， 2016， 30(5)： 487-492.