種子老化的生理生化與分子機理研究進展

劉　娟,歸　靜,高　偉,馬俊峰,王佺珍

西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院, 楊陵　712100

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種子老化的生理生化與分子機理研究進展

劉娟,歸靜,高偉,馬俊峰,王佺珍*

西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院, 楊陵712100

種子作為植物遺傳資源的有效保存體以及重要的種質(zhì)創(chuàng)新原料,其老化或者劣變將直接導(dǎo)致發(fā)芽率、活力、生活力降低,抑制種胚正常發(fā)育以及幼苗生長,由此造成植物生產(chǎn)水平及其品質(zhì)大幅下降。這也將進一步涉及因種質(zhì)資源匱乏、土壤種子庫系統(tǒng)功能紊亂所引發(fā)的全球生物多樣性減小、草地退化和荒漠化加劇等生態(tài)危機問題。對種子老化生理生化特性和分子機理等研究進行了綜述。總結(jié)了近年來關(guān)于種子老化涉及的理化反應(yīng)包括保護酶活性的改變、核酸以及蛋白質(zhì)的分解、內(nèi)源激素的消長、質(zhì)膜完整性降低等相關(guān)研究;并從蛋白代謝、核酸代謝、種子含水量以及基因重組等多角度總結(jié)和闡述了與老化機理有關(guān)的最新研究觀點,以期為種子老化、種子活力修復(fù)和種子壽命延長等機理研究提供基礎(chǔ)理論參考。目前對種子老化的研究多集中于傳統(tǒng)的生理生化過程和內(nèi)外影響因子相對獨立變化的片段性研究,缺乏系統(tǒng)綜合的多層面體系研究。種子作為生命體,隨著探討生命衰老機理的生物技術(shù)日新月異,通過蛋白組學(xué)、酶學(xué)、基因工程技術(shù)、轉(zhuǎn)錄組測序等新技術(shù)的應(yīng)用,必將對未來種子老化機理機制的揭示有突破性推進作用。

種子;衰老;生理改變;研究進展

種子作為植物最主要的繁殖材料和生產(chǎn)資料,其品質(zhì)的優(yōu)劣直接影響農(nóng)作物、飼草、林木等的生產(chǎn)、經(jīng)濟與遺傳資源有效利用、土壤種子庫穩(wěn)態(tài)維持[1- 8]、以及植被恢復(fù)與重建等生態(tài)價值的實現(xiàn)[9- 10]。一般來講,具有正常生理活性的種子能夠在干燥條件下保持一定時間的活力,但是隨著貯存時間的延長、貯存條件的不當(dāng)、內(nèi)外環(huán)境的脅迫,種子劣變老化將不可逆、不可避免地發(fā)生[11]。種子老化或者劣變是一個逐步發(fā)生并且涉及眾多復(fù)雜生理生化反應(yīng)的過程。這體現(xiàn)在伴隨著膜脂過氧化,保護酶鈍化,蛋白質(zhì)降解,相關(guān)基因表達紊亂以及核酸降解等生理生化反應(yīng)[12- 14],老化過程表現(xiàn)出種子發(fā)芽率、生活力、質(zhì)膜完整性降低,內(nèi)部保護酶系統(tǒng)活性減弱,有毒有害物質(zhì)累積等特點[15]。以往關(guān)于種子老化的研究熱點主要集中于對老化的生理特性的考察,以及對種子最優(yōu)活力檢測條件的探討;其中涉及老化機理的研究則是McDonald[14]在總結(jié)前人研究基礎(chǔ)上提出的膜脂過氧化假說,即種子內(nèi)部自動氧化或在氧化酶參與下產(chǎn)生的自由基對細胞內(nèi)的脂類物質(zhì)進行氧化攻擊,從而使得質(zhì)膜完整性受損,老化加劇。另外,Miquel[16]等提出了衰老的線粒體學(xué)說,該學(xué)說認為,在不具備葉綠體的種子細胞內(nèi),線粒體呼吸電子傳遞鏈可能是活性氧(ROS)主要來源,而ROS的積累導(dǎo)致線粒體大分子有機物質(zhì)的氧化損傷,由此加速衰老的進程。

鑒于種子在生物多樣性保護、農(nóng)林牧業(yè)生產(chǎn)和植物群落重建、演替中具有舉足輕重的作用[4- 10],以及老化過程的復(fù)雜性、多變性,近年來國內(nèi)外關(guān)于老化的探究之路依然在曲折中前進。之前雖已有不少關(guān)于種子老化的機理探究性概述[11- 16]以及涉及破除老化方法、提高種子發(fā)芽率的研究[17-18],但是對老化所涉及的理化反應(yīng)包括美拉德反應(yīng)(Amadori-Maillard reaction),生化過程,種子含水量與衰老途徑,以及從分子生物學(xué)和基因組學(xué)等多角度解釋衰老機理的綜合性概述鮮有報道。由此,本文較為深入全面地總結(jié)了近年來國內(nèi)外關(guān)于種子老化所涉及的活力指標變化、Amadori-Maillard 反應(yīng)、膜脂過氧化作用、蛋白質(zhì)以及核酸代謝過程等方面的相關(guān)研究,試圖由大及小,由外至內(nèi)從分子、細胞生物學(xué)以及基因組學(xué)等多層次綜合分析不同觀點,總結(jié)種子衰老機理研究進展。以期為種子老化、種子活力修復(fù)和延長種子壽命等機理提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1　衰老種子的生理生化特性

1.1人工加速老化種子的特性研究

人工加速老化處理(Accelerating Aging Treatment, AAT)即通過高溫高濕法加速供試種子生理生化劣變,從而更直接、迅速地考察和判定其老化特性以及最優(yōu)活力檢測條件[19- 22]。從對花生(Arachishypogaea)[19]、辣椒(Capsicumannuum)[20]、萹蓄豆(Medicagoruthenica)[21]、大豆(Glycinemax)[22]、玉米(Zeamays)[23]、甜辣椒(Capsicumannuum)[24]、芝麻(Sesamumindicum)[25]、垂穗披堿草(Elymusnutans)[26]和黑麥草(Loliumperenne)[27]等,人工加速老化處理的研究中,一致的結(jié)果表明老化種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù),相關(guān)保護酶活力均隨老化時間的延長,整體呈下降趨勢;種子浸出液電導(dǎo)率、膜脂過氧化產(chǎn)物——丙二醛(MDA)含量和可溶性糖含量均隨老化時間的延長而升高,與種子的各項活力指標呈負相關(guān)。由此可知,伴隨老化程度的加深(AAT處理),種子內(nèi)部涉及復(fù)雜的物質(zhì)能量代謝變化以及生理生化劣變,而這些代謝產(chǎn)物有可能進一步作用于老化種子,加速其劣變,由此導(dǎo)致其活力的降低并直接抑制發(fā)芽。另外,通過考察人工老化處理過程中種子特定生理指標的變化,種子活力的檢測與評價也得以實現(xiàn),如：種子浸出液用來體現(xiàn)二行芥(Diplotaxismuralis)[28]老化種子活力,而四氮唑還原強度則適用于大麥(Hordeumvulgare)[29]種子評價。因此,對于種子活力的評價并不局限于單個、特定的老化生理指標變化趨勢,而與具體物種的植物學(xué)特征(單雙子葉)、種皮透性、養(yǎng)料貯存部位等因素有關(guān)。雖然大量的研究表明AAT處理能較為迅速直接地達到種子老化檢測目的、探討老化最佳檢測條件(溫度,濕度,時間),但是該方法的反應(yīng)其實驗過程過于激烈,所涉及到的老化細節(jié)難以全局把握[30]。因此,在AAT處理過程中加入適量的飽和NaCl溶液會顯著降低種子強烈的吸水性,從而使得人工加速老化過程進行得更為緩和,試驗干擾因素也因此降低[30-31]。 另外,相比傳統(tǒng)人工高溫高濕老化處理條件而言,利用分壓為18 Mpa的氧氣處理干燥貯存條件下的種子,同樣可以達到加速老化的目的,而且方法更為快捷,尤其適用于對干燥種子老化的生理生化特性研究[32]。

1.2老化種子的酶活性、激素變化

不論是人工老化還是自然老化,草本和木本植物種子老化的生理特性均表現(xiàn)出一致性:衰老種子在死亡之前,其內(nèi)部將發(fā)生一系列的生理生化反應(yīng),如保護酶活性的改變,內(nèi)源激素的漲落,核酸以及蛋白質(zhì)的降解,質(zhì)膜結(jié)構(gòu)不可逆地受損等等。人工老化毛竹(Phyllostachysedulis)[33]和歐洲赤松(Pinussylvestris)[34]種子活力的降低與細胞膜的完整性降低具有顯著相關(guān)性,研究者推測MDA將結(jié)合過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)等保護酶,致使保護酶空間構(gòu)象改變,導(dǎo)致自由基累積而促成膜脂發(fā)生過氧化。此外,伴隨老化程度的加深,供試毛竹種子還表現(xiàn)出赤霉素(GA),生長素(IAA)含量降低,而脫落酸(ABA)含量增加[33]。然而,關(guān)于GA對老化種子萌發(fā)力的顯著促進作用也早在芝麻[35]和秋葵(Abelmoschusesculentus)[36]種子的老化引發(fā)處理研究中得到驗證。因此,種子體內(nèi)一定含量的GA對老化具有明顯的抑制作用,那么未來是否可以通過增施一定量的GA并配合其他農(nóng)藝手段來有效延長稀有物種種子壽命,還有待后續(xù)深入的研究考證。以上研究可以看出,相關(guān)保護酶活性降低和內(nèi)源激素失衡是種子發(fā)生老化和劣變的主要原因。另有報道顯示在對種子做加速老化處理時,當(dāng)達到一定的熱處理溫度和時間,耐老品種將會產(chǎn)生一定分子量的特異蛋白[37- 38]。熱穩(wěn)定蛋白的含量與種子老化趨勢呈負相關(guān),并且此類蛋白可能作為一種應(yīng)激老化脅迫蛋白與作物的耐老化性及種子活力的喪失有關(guān)。

通過對人工老化和自然老化種子的綜合研究,眾多關(guān)于種子的老化特性、活力檢測條件、活力評價指標得以一一揭曉。以上研究進展也充分顯示,衰老種子涉及到內(nèi)源激素比例失調(diào)、保護酶活性減弱、蛋白含量改變、質(zhì)膜完整性受損等復(fù)雜多變的生理生化反應(yīng)。那么,究竟是什么樣的內(nèi)在機理驅(qū)使和啟動種子走向老化和死亡呢？越來越多的國內(nèi)外學(xué)者開始從細胞器分析,蛋白代謝,以及分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,核酸代謝等諸多角度,嘗試解釋種子老化機制。

2　種子衰老的生理生化解釋2.1　Amadori-Maillard反應(yīng)加速種子老化

具有生理活性的正常種子當(dāng)被干燥至含水量小于5%時,其細胞質(zhì)將由粘液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)椴ＡB(tài)[39-40]。種子老化涉及的生理生化反應(yīng)受其內(nèi)外水分的熱力學(xué)狀態(tài)(如水勢,水活動性,焓差,以及熵)控制[13,41- 42];并且低水分含量以及低溫可以降低老化種子內(nèi)部的酶活性,從而阻礙種子發(fā)生涉及酶促反應(yīng)的生化劣變[12]。因此,干燥條件下的種子(玻璃態(tài)種子)所發(fā)生非酶促反應(yīng)“阿爾多瑞-美拉德反應(yīng)(A-M,Amadori-Maillard reactions)”產(chǎn)物將會使細胞清除活性氧的能力下降,膜脂的過氧化程度加強,并且A-M反應(yīng)產(chǎn)物很可能通過對DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的修飾,改變其生化功能,從而促進種子的衰老與死亡[43- 44]。進一步的研究發(fā)現(xiàn),A-M反應(yīng)涉及到由細胞內(nèi)糖類減少而引起對蛋白質(zhì)進行的非酶促反應(yīng)攻擊,以及復(fù)合物的分子重排;由此產(chǎn)生的褐色細胞毒素產(chǎn)物也會對細胞結(jié)構(gòu)及其功能造成極大程度地損害[45-46]。作為最普遍的A-M產(chǎn)物——糖化蛋白、高級糖基化合物在各類種子老化或貯存過程中會隨著老化程度的增強而不斷增加[41,45-48]。因此,當(dāng)對供試種子進行脫水處理(含水量小于5%)后,老化組織中大量減少的游離糖類啟動了A-M反應(yīng),同時由此產(chǎn)生的細胞毒素產(chǎn)物更進一步加速了種子老化進程。例如：從對自然老化并且干燥的豌豆 (Pisumsativum),黃瓜(Cucumissativus),以及蕎麥(Fagopyrumesculentum)種子的研究中發(fā)現(xiàn),風(fēng)干種子內(nèi)部碳水化合物的水解程度會隨著其老化程度的加強而加強,其內(nèi)部的結(jié)合水參與了糖類水解反應(yīng),并且A-M 反應(yīng)產(chǎn)物在老化種子重新吸脹時關(guān)閉了水通道因此降低了細胞膜的透水性[49]。另外,隨著老化時間的延長,老化程度的加深,娑羅雙樹(Shorearobusta)種子不同部位(胚軸以及子葉)的A-M產(chǎn)物——酮醛類,過氧化氫等均呈逐漸增多的趨勢[41]。因此,當(dāng)種子內(nèi)部處于玻璃態(tài)(含水量小于5%)時,A-M產(chǎn)物(MDA,以及寡糖等)通過破壞細胞內(nèi)保護酶系統(tǒng)平衡、擾亂胞內(nèi)結(jié)合水正常代謝途徑、對核酸進行共價修飾等,從而加劇活性氧的累積,達到加速種子老化的目的[46]。然而關(guān)于動態(tài)監(jiān)控A-M產(chǎn)物在老化種子不同組織部位的分布、軌跡、以及定量分析,目前鮮有報道。

在自然環(huán)境下,種子的含水量會隨著周圍環(huán)境變化而波動[50],鑒于水分含量的不同,干燥和水合種子在衰老過程中總是走不同路線[51,13]。Kranner 等[52]也認為在水合種子中,雖然不能排除A-M反應(yīng)導(dǎo)致的細胞死亡,但是水合種子的老化的確更可能與可控的、活躍的生化活動即酶促反應(yīng)有關(guān)。由此可知,在一定程度的干燥條件下,作為非酶促反應(yīng)之一的Amadori-Maillard 反應(yīng)加速了種子的老化進程。

2.2膜脂過氧化作用與種子老化

活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)通過對質(zhì)膜誘發(fā)過氧化作用而被認為是降低膜完整性的首要因子[53-57]。氧原子攜帶兩個多余的電子將會間接產(chǎn)生超氧陰離子,過氧化氫以及羥自由基,即使種子內(nèi)少量的水分都會使得ROS擴散至其他細胞器、質(zhì)膜等部位并與之發(fā)生氧化還原反應(yīng),從而破壞細胞內(nèi)環(huán)境的電化學(xué)勢穩(wěn)態(tài)[58]。首先,羥自由基可以啟動有機分子一系列的過氧化反應(yīng),其中對質(zhì)膜中的不飽和脂肪酸的強氧化作用最為明顯,并且加速破壞脫氧核糖、嘌呤以及嘧啶的生化結(jié)構(gòu)[24]。Ouzouline[59]小組通過比較兩種軟粒小麥(Triticumaestivun)在老化處理前后質(zhì)膜組分的變化發(fā)現(xiàn),老化處理的小麥種子質(zhì)膜磷脂酰膽堿成分(不飽和脂肪酸,油酸,亞油酸組分)顯著減少,認為老化處理加速了ROS對質(zhì)膜的過氧化作用,由此加大了膜透性;類似的結(jié)果在綠番茄(Physalisphiladelphica)[60],甜辣椒(Capsicumannuum)[24],苦楝樹[61],豌豆(Pisumsativum)、山藜豆(Lathyruspratensis)、金雀兒(Cytisusscoparius)[62]種子的老化研究中均有報道。這些研究表明老化種子的發(fā)芽率大幅降低與其膜脂過氧化程度顯著相關(guān)。第二,近年來越來越多的學(xué)者開始探究老化種子不同部位包括胚,胚乳,子葉等的ROS分布軌跡,試圖更加密切地探究其對質(zhì)膜的氧化作用機理。如：不同貯存年限的歐洲山毛櫸(Fagussylvatica)老化種子在熒光下被監(jiān)測到其胚軸內(nèi)活性氧含量遠大于子葉中的含量[58];而在老化蘿卜種子(Rapanussativus)也被發(fā)現(xiàn)種皮內(nèi)含有比胚軸內(nèi)高16倍的ROS水平[63]。這說明ROS在根部頂端分生組織大量積累,致使胚軸無法伸出,而抑制了胚細胞分裂。第三,從酶學(xué)以及基因組學(xué)角度來看,涉及種子老化的膜脂劣變的主要原因是磷脂酶活化以及實現(xiàn)相關(guān)基因的表達造成的[64]。具體表現(xiàn)為：老化能夠促進磷脂酶(PLD)的活化因而大量降解膜脂的主要成分——磷酸酰膽堿(PC)和磷酸酰乙醇胺(PE);同時老化處理能夠顯著誘導(dǎo)涉及脂肪酸降解的脂氧合酶基因(OsLOX2)的轉(zhuǎn)錄[64]。Lee[65]等也認為抑制PLD的活性,將有利于大豆種子的貯存。由此說明,ROS的累積以及自由移動,保護酶活性減弱,是導(dǎo)致種子細胞質(zhì)膜完整性降低的重要因素之一,同時不可忽略的是,當(dāng)外部的水熱條件滿足時,引發(fā)質(zhì)膜完整性降低的因素還可能是磷脂酶以及脂氧合酶的活化而引起的酶促反應(yīng)所造成。老化種子的發(fā)芽率大幅降低與其膜脂過氧化程度呈顯著正相關(guān)。

2.3ROS對種子生死的雙重作用

目前,越來越多的研究已充分表明ROS在種子衰老過程中扮演雙重作用,而其作用的正負性往往取決于種子含水量[66- 71]。在干燥種子中(玻璃態(tài)種子，含水量小于5%),ROS更傾向分布于靠近其產(chǎn)生部位,相反,在有自由水的水合種子中,ROS(H2O2)更易擴散至距其產(chǎn)生部位較遠的靶位點;一般認為,產(chǎn)生于干燥種子的ROS更可能在當(dāng)此種子在吸脹的時候,作為一種胞內(nèi)的信使起到正向地調(diào)控種子萌發(fā)作用[66]。另外,在長期貯存過程中,尤其在高溫高濕環(huán)境下,種子的發(fā)芽能力以及活力的喪失與H2O2和超氧陰離子的積累具有密切聯(lián)系;而缺水的干燥種子因其內(nèi)部分子流動性受到玻璃體結(jié)構(gòu)的限制致使其生化代謝停止[67]。因此種子細胞粘液態(tài)對ROS的雙重角色的發(fā)揮具有重要意義[68-69],并且在細胞粘液態(tài)下ROS作用正負性還可能涉及深層次的胞內(nèi)外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控。例如,施加0.05%的H2O2水溶液(加CaSO4),能夠顯著提高老化玉米 (Zeamays)種子的發(fā)芽率、胚和胚乳的氧氣消耗率,以及乙醇脫氫酶(ADHase)的活性,這表明適量的H2O2能夠促進老化種子在萌發(fā)時期的生物代謝[70]。從以上研究可以看出,水分是促成ROS移動并發(fā)揮強氧化作用的首要因素之一[71]。一方面,當(dāng)種子儲藏于高溫高濕環(huán)境下,ROS的強氧化作用將加速種子內(nèi)部物質(zhì)劣變以及保護酶系統(tǒng)失活；另一方面,適量的ROS則可作為種子萌發(fā)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子。但是,關(guān)于ROS影響種子萌發(fā)或者劣變的臨界閾值以及作用的動態(tài)機理研究,鮮見報道。

2.4蛋白羰基化作用與種子老化

蛋白質(zhì)羰基化是蛋白質(zhì)的非酶促羰基修飾的不可逆生化過程[49,67,72]。有學(xué)者認為ROS是通過改變質(zhì)膜上轉(zhuǎn)運蛋白而非磷脂雙分子層的結(jié)構(gòu)和功能從而致使生物膜透性增大,膜完整性降低[24]。更深層次的研究則表明金屬羰基物是ROS攻擊賴氨酸(Lys),精氨酸(Arg),脯氨酸(Pro)以及蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的氨基和亞氨基而直接產(chǎn)生的[73-74]。研究顯示老化擬南芥(Arabidopsisthaliana)種子活力的缺失或者下降是由干燥種子內(nèi)蛋白質(zhì)的改變和低活力的種子在萌發(fā)時無法表現(xiàn)正常的蛋白質(zhì)組特性而引起的[75];另外,在玉米種子老化處理研究中發(fā)現(xiàn),伴隨著葡萄糖- 6-磷酸脫氫酶活性的降低,丙酮以及ATP的減少,干燥玉米胚芽中有16種蛋白質(zhì)被上調(diào)[76]。這表明,可控的種子劣變處理強烈增加了蛋白質(zhì)的羰基化反應(yīng),這很可能會導(dǎo)致種子蛋白的功能特性的缺失或者促進酶對水解反應(yīng)的敏感性;同時老化影響了細胞信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)以及基因的轉(zhuǎn)錄,因此干擾了正常的糖酵解,三羧酸循環(huán),以及呼吸電子傳遞鏈和氧化磷酸化等生化過程。進一步研究顯示,隨著貯存年限的增長,自然老化的歐洲山毛櫸(Fagussylvatica)種子內(nèi)羰基蛋白含量[脫水蛋白、USP(Anti-Universal Stress Protein)、TCP- 1(T-complex protein 1)、RAD23- 3、以及14- 3- 3蛋白]逐漸增多,這樣的趨勢在后續(xù)吸脹處理過程中一直都沒有改變[67];而人工老化的小麥種子在處理前后也表現(xiàn)出升高的可溶性糖含量和降低的可溶性蛋白含量,以及一定量的脯氨酸積累[77- 79]。因此,不論是自然還是人工老化種子,老化過程均涉及到了蛋白結(jié)構(gòu)的修飾以及改變、蛋白合成能力受阻,相關(guān)保護酶活性降低,以及水孔通道功能失調(diào)等特點,而伴隨蛋白羰基化過程的深入,其反應(yīng)產(chǎn)物則又進一步加劇老化、加速種子內(nèi)部生理生化劣變,最終導(dǎo)致細胞死亡。

然而,在對印度芥菜種子(Brassicajuncea)[80]以及秋葵[81]人工老化處理過程中,并未檢測到蛋白條帶的變化,研究者認為由老化引起的種子活力降低并不是蛋白結(jié)構(gòu)的改變引起,而是自由基所導(dǎo)致的膜脂過氧化反應(yīng)造成的[80-81]。盡管不同物種種子衰老的生理特性(見1.1,1.2)具有一致性,但究竟是蛋白羰基化還是膜脂過氧化作用而導(dǎo)致的種子老化以及活力喪失呢？從目前的研究進展看,并非單一因素造成種子劣變的發(fā)生,首先涉及到品種的遺傳特異性(耐老特性,單雙子葉等),其次關(guān)乎其內(nèi)外環(huán)境的水熱條件(干燥、水合等),再次與種子本身所處的生理狀態(tài)(老化階段以及程度)都具有不同程度的相關(guān)性,而蛋白羰基化作用則是促進種子老化的最主要因素之一。

2.5核酸裂解、線粒體機能改變與種子老化

早在1976年,有學(xué)者觀察到在干燥失活的黑麥(Secalecereale)種胚中產(chǎn)生18S的rRNA逐步劣變,并且伴隨著吸脹作用的發(fā)生其劣變狀態(tài)也隨之加深[82]。硬粒小麥[83]的老化種胚、胚乳,抗旱藍藻(Cyanobacteria)[84]以及老化豌豆種子[52]中也分別被監(jiān)測到逐步劣變的rRNA、被A-M產(chǎn)物修飾的DNA和DNA ladder。眾所周知,DNA Ladder 已被看做PCD事件發(fā)生的標記物。當(dāng)前,有學(xué)者嘗試從有關(guān)老化涉及的細胞程序性(Programmed)以及非程序性(Non-Programmed)死亡兩方面綜合解釋其原因[52]。在所有從分子水平上探究細胞程序性死亡(PCD)的報告中,普遍認為老化細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)刺激了線粒體功能的改變而致使內(nèi)部生化代謝紊亂。具體表現(xiàn)為：伴隨老化程度的加深,MAPK(mitogen-activated protein kinase, 絲裂原活化激酶)被激活并促進Bax以及Bcl類似基因啟動,于此同時細胞色素C在Ca2+的作用下,將經(jīng)由線粒體被“調(diào)遣”至細胞質(zhì)尋找并激活metacaspase,由此導(dǎo)致了核心蛋白,核酸,以及細胞骨架發(fā)生系統(tǒng)性的降解和退化(圖1)[52]。更加完善的發(fā)現(xiàn)則表明,老化不但涉及經(jīng)由基因表達調(diào)控而引起的PCD反應(yīng)而且還與Non-PCD關(guān)系密切。原因是在涉及PCD復(fù)雜反應(yīng)的流程中,還存在著“nano-switches”的化學(xué)反應(yīng),作為PCD的支路而驅(qū)使緩慢的非程序性(Non-programmed)生化事件的發(fā)生[52]。不論是脂質(zhì)過氧化作用,蛋白羰基化作用,還是核酸隨機發(fā)生的點突變以及共價修飾(A-M反應(yīng)產(chǎn)物修飾),其產(chǎn)物都將成為促進種子老化的誘導(dǎo)因子(第二毒素信號分子)(圖1)。每一種引發(fā)老化的因素既是起因(Cause)加速劣變的進程,也同時可以作為老化的結(jié)果(Effector)[52]。

圖1　種子老化過程中細胞死亡機理流程簡圖(參考Kranner I(2011)[52]改繪)Fig.1　Simplified scheme of mechanisms that contribute to cell deaths during seed aging

Kranner[85]對豌豆種子的老化特性研究也表明,細胞氧化還原電位的改變與種子活力喪失有關(guān),并且當(dāng)老化涉及的核酸在內(nèi)切酶作用下發(fā)生解體時,這一相關(guān)性更加明顯;從轉(zhuǎn)錄水平分析來看,涉及質(zhì)膜代謝、氧脅迫、以及蛋白泛素化基因的改變均發(fā)生在種子老化的初期;而老化種子的種胚以及胚乳內(nèi)的核酸降解程度也不同[83],這說明種子老化具有時空異質(zhì)性。另外,老化燕麥(Avenasativa)[86]、大豆[87]種子表現(xiàn)出例如：線粒體腫脹和雙層膜損傷以及呼吸功能下降、標記酶(SOD,APX,GR,等)活性降低、ASC-GSH(抗壞血酸-谷胱甘肽)循環(huán)活性減慢等典型的線粒體功能衰竭特征。綜上所述,種子老化涉及到了調(diào)控PCD的基因的表達、線粒體機能改變、氧脅迫、以及蛋白質(zhì)的泛素化作用,同時一系列復(fù)雜的的非程序性事件也伴隨種子的劣變而發(fā)生,形成了具有“起因-結(jié)果”的閉合、交叉式的鏈式關(guān)系。

此外,從轉(zhuǎn)基因角度考察種子衰老問題,一方面可以透視種子老化深層機理,同時也在一定程度上能夠?qū)崿F(xiàn)延長種子壽命的可能。例如：通過在煙草質(zhì)粒內(nèi)實現(xiàn)同時超量表達銅鋅超氧化物歧化酶(CuZnSOD)和抗壞血酸過氧化氫酶(APX),結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因煙草不但可以對任意嚴苛的非生物脅迫表現(xiàn)出強的抵抗性,而且相對于老化的對照組來說,具有更高的保護酶活性和更低的離子滲透率[88]。最新研究還發(fā)現(xiàn),經(jīng)分離得到的表型為長壽的擬南芥(Arabidopsisthaliana)顯性突變體,具有超量表達的RSL1(Ring finger of Seed Longevity1)基因,而研究證實此基因負責(zé)編碼具鋅指紋的環(huán)狀泛素連接酶,進一步研究發(fā)現(xiàn),RSL1加速了赤霉素的分泌而實現(xiàn)種子壽命的延長,因此研究者推測RSL1是作為種子在面臨衰老時是否存活的限制性因素[66]。

3　結(jié)論與展望

綜合來看,可靠的外界貯存條件(低溫,低含水量),以及其內(nèi)部充足而健全的保護酶系統(tǒng)、平衡穩(wěn)定的內(nèi)源激素系統(tǒng),是種子最大程度地避免老化,達到持續(xù)保有活力以及發(fā)芽能力的必備因素,這對稀有以及瀕危植物物種種質(zhì)資源延續(xù)以及創(chuàng)新具有重要價值。

(1) 目前對ROS加速種子老化、劣變的研究為數(shù)眾多,但是研究較為表象、單一或者片面。只專注于ROS在種子老化期間單方面的負向作用,而忽略其在種子萌發(fā)時所具有特定正向的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控機能;另外,ROS的綜合作用與種子含水量息息相關(guān),但是目前大多數(shù)此類研究往往顧此失彼。因此,探究老化機理之前,對種子本身含水量的把握將成為研究突破口;尤其是在探究玻璃態(tài)種子(含水量<5%)在其重新吸脹萌發(fā)時,對ROS進行實時連續(xù)的定性定量監(jiān)控,將會更加徹底地揭示種子老化機理。另一方面,種子內(nèi)線粒體是ROS積累的主要細胞器,考察線粒體在老化前后的生理生化特性以及機能改變,可以成為研究涉及衰老的細胞程序性死亡的靶點。

(2) 從目前分子以及轉(zhuǎn)錄水平考察和調(diào)節(jié)相關(guān)促進老化的生物酶,如脂氧合酶以及磷脂酶的代謝和表達,跟蹤其作用位點以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等的研究,雖然能夠較為深入了解老化的酶促反應(yīng)途徑,但是,其局限性在于在考慮細胞膜完整性降低的同時,并未兼顧膜蛋白生理機能的改變;而對于種子不同部位(胚乳、子葉等)、不同時期老化的綜合比較研究也涉及甚少。因此,精細考察并比較種子老化過程中所涉及的不同部位、老化涉及的不同時期(老化初期,中期,后期)生理生化變化,包括其在吸脹過程中(胚軸,子葉,以及胚乳內(nèi))動態(tài)的物質(zhì)以及能量變化、氧化還原電位變化、蛋白表達情況、以及核酸代謝情況,有利于探討種子不同部位的老化情況以及判斷老化的獨立性或者相依性的機理。

(3) 單獨涉及種子老化的PCD以及Non-PCD的理化反應(yīng)、生化事件的研究報道較為廣泛;而對這兩者之間的過渡性、連接性的生化反應(yīng),包括其反應(yīng)特點、作用機理等的探究卻鮮有報道。老化不但涉及經(jīng)由基因表達調(diào)控而引起的PCD反應(yīng);同時每一種引起老化的因素(AM反應(yīng),蛋白羰基化作用,膜脂過氧化作用)均可作為種子Non-PCD的可能結(jié)果,這就形成了具有“起因-結(jié)果”的閉合、交叉式的鏈式關(guān)系。因此考察PCD與Non-PCD之間的過渡生化反應(yīng)機理有助于全面破解種子老化之謎。此外,目前對種子老化的研究多集中于傳統(tǒng)的生理生化過程和內(nèi)外影響因子的相對獨立變化研究。缺乏系統(tǒng)綜合的多層面系統(tǒng)性的動態(tài)研究。隨著探討生命衰老機理的生物技術(shù)日新月異,通過蛋白組學(xué)、酶學(xué)、基因工程技術(shù)和轉(zhuǎn)錄組測序等新技術(shù)的應(yīng)用,必將對種子老化機理機制的揭示有突破性進展。

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Review of the physiological and biochemical reactions and molecular mechanisms of seed aging

LIU Juan,GUI Jing,GAO Wei, MA Junfeng,WANG Quanzhen*

CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling712100,China

Seeds undoubtedly play an essential role in the storage of germplasm resources preserved both to facilitate the preservation of rare species and genetic innovation. However, the negative effects of seed aging and deterioration on crop yield and quality, which negatively affects the germination rate, seed vigor and viability, embryo growth, and seedling emergence of future generations of seeds, has become a cause of increasing concern. In addition, problems associated with seed aging can also accelerate the loss of global biodiversity, grassland degradation, and desertification, because of the poor quality germplasm and dysfunction of the soil seed bank. This article summarizes current research on the physiological characteristics of naturally and artificially aged seeds and their various intrinsic chemical alterations, including their protective enzymatic activity, nucleic acid and protein content, endogenous hormones, and plasma membrane integrity. We also comprehensively interpret advances in research on the aging mechanism, including aspects of protein and nucleotide metabolism, seed moisture content, and genetic recombination. This work is intended to provide a theoretical reference for future exploration of seed aging, and insight into potential repair and lifespan elongation methods.(1) Seed moisture content should be a focus of future studies, because the biophysical status and quantity of the water in aged seeds determine the different pathways of seed death or deterioration. Furthermore, activation of ROS (reactive oxygen species) can significantly accelerate the aging process, particularly when seeds are hydrated, as this endows them with mobility and increases biological activity. In addition, ROS play a positive role as intracellular signaling molecules in seed germination and other physiological processes. Thus, real-time, continuous, and qualitative-quantitative analyses and monitoring of the ROS distribution in different embryo components may help to reveal the comprehensive and multiple functions of ROS during seed aging. Moreover, as mitochondria have been well established as the main organelle via which to detect ROS accumulation, detailed examinations of their physiological changes before and after aging (naturally and artificially induced) may provide a more specific target for the study of PCD (Programmed Cell Death) occurring during seed aging.(2) Enzymatic or non-enzymatic reactions can result in seed aging. Thus, observing and regulating the metabolism and signal transduction pathways of biological enzymes accelerating the aging process at the proteomics, transcriptional, and gene recombination levels could be a promising strategy for future seed aging research. Relevant enzymes include PLD (Phospholipases D) and LOX (lipoxygenase). Therefore, comparing the physiological and biochemical changes,from aspects of matter and energy metabolism, redox potential, protein expression, and nucleic acid metabolism, involved in different parts of the aged seeds (hypocotyl,cotyledon, endosperm), and different periods of aging process (aged in the early, middle, late) is a necessity to gain a better understanding of aging mechanism. Nevertheless, current attention has mostly been on traditional and fragmentary reaction procedures as well as the internal and external factors that influence the aging process. Some perspective studies, which are more systematic and multidimensional, may facilitate the development of targeted research on seed aging. This in turn could prompt the development of biotechnological advances for organismal biology and the seed aging mechanism.

seed; aging; physiological alterations; research progress

國家自然科學(xué)基金資助項目(31472138)

2015- 02- 04; 網(wǎng)絡(luò)出版日期:2015- 12- 03

Corresponding author.E-mail: wangquanzhen191@163.com

10.5846/stxb201502040289

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