人臍帶間充質干細胞外泌小體保護缺氧復氧損傷的心肌細胞*

李　佳，　辛　毅，　崔　巍，　劉　颯，　黃然然，　陳　娟，　周　潔△，　李　娜△

(1首都醫科大學附屬北京安貞醫院，北京 100029； 2華中科技大學同濟醫學院生物化學與分子生物學系，湖北 武漢 430030； 3北京市心肺血管疾病研究所，北京 100029)

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·論著·

人臍帶間充質干細胞外泌小體保護缺氧復氧損傷的心肌細胞*

李佳2，辛毅1,3，崔巍1,3，劉颯1,3，黃然然1,3，陳娟2，周潔2△，李娜1,3△

(1首都醫科大學附屬北京安貞醫院，北京 100029；2華中科技大學同濟醫學院生物化學與分子生物學系，湖北 武漢 430030；3北京市心肺血管疾病研究所，北京 100029)

目的： 研究人臍帶間充質干細胞(human umbilical mesenchymal stem cells，HUMSCs)外泌小體對心肌細胞缺氧復氧損傷后細胞凋亡的作用，并分析外泌小體內具有心臟保護作用的微小RNA(microRNA,miRNA)表達水平。方法：酶消化法培養HUMSCs并對其免疫表型進行流式細胞術鑒定；收集培養的第3代HUMSCs上清液，利用試劑盒提取外泌小體，電鏡觀察其形態結構，并采用Western blot 法鑒定試劑盒所提物質CD63蛋白水平的表達；用提取的外泌小體處理缺氧復氧條件下的心肌細胞，流式細胞術Annexin V-FITC/PI標記法觀察外泌小體對心肌細胞凋亡的影響；實時熒光定量PCR 檢測外泌小體中miRNA的表達水平；miR-22抑制劑處理缺氧復氧條件下的心肌細胞，流式細胞術檢測心肌細胞的凋亡。結果：流式細胞術檢測第3代HUMSCs的CD105、CD73和CD90呈高表達,而CD45、CD34、CD11b、CD79a、CD19和HLA-DR 的表達陽性率低，說明第3代培養的HUMSCs具有間充質干細胞的特異性表型特征。向骨細胞分化誘導HUMSCs，鈣結節形成明顯，經茜素紅染色呈紅色結節，分化率為(92.5±5.1)%以上。經向脂肪細胞分化，細胞見脂滴形成，油紅染色將脂滴染成紅色，分化率為(91.6±3.8)%以上，說明第3代培養的HUMSCs具有間充質干細胞的多向分化能力。掃描電鏡觀察可見外泌小體球狀結構，并且外泌小體特異性蛋白CD63表達強陽性。 缺氧復氧導致心肌細胞凋亡率明顯增加(P<0.05)。在缺氧復氧條件下，外泌小體處理使心肌細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。不同濃度外泌小體處理心肌細胞，其抗細胞凋亡作用無明顯變化(P>0.05)。實時熒光定量PCR 檢測外泌小體中富含miR-1a、miR-22、miR-24、miR-133a 和miR-139-5p，其中miR-22表達水平最高；在缺氧復氧條件下miR-22抑制劑處理心肌細胞，細胞凋亡率明顯增加(P<0.05)。 結論：人臍帶間充質干細胞外泌小體可有效減少缺氧復氧條件下的心肌細胞凋亡，其抗凋亡作用與外泌小體富含的miR-22密切相關。

人臍帶間充質干細胞； 外泌小體； 微小RNA； 心肌細胞； 缺氧； 復氧

缺氧復氧損傷引起心肌細胞凋亡、心臟纖維化和心室重構,最終導致心衰，嚴重威脅人類健康和生命。間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有多向分化潛能、并可通過旁分泌作用改善心梗局部炎癥反應、抑制心肌細胞的凋亡而成為干細胞治療心肌梗死的潛能細胞。大量的臨床試驗結果表明，MSCs 移植治療急性心肌梗死和慢性心衰可使患者的心臟射血分數提高4.5%～11.3%[1]。但MSCs在心肌缺氧復氧損傷中發揮心臟保護功能的相關機制尚不甚清楚。深入研究MSCs 發揮心臟保護功能的機制對于MSCs 治療心肌缺血性疾病具有重要的臨床指導意義。

外泌小體(exosome)是一種直徑在30～120 nm、含有RNA和蛋白質的微小囊泡，具有脂質雙層膜結構，由幾乎所有類型的細胞分泌而來，同時在體液如血液、唾液、尿液和乳汁中大量發現。最近研究表明外泌小體可以起到間接傳遞信號分子給其它細胞從而改變其細胞功能的作用，如腫瘤的生長與遷移、組織損傷的修復等[2]。但是HUMSCs外泌小體對于心肌細胞在缺氧復氧條件下的保護作用及其內相關microRNA表達尚不甚清楚。本研究利用人臍帶間充質干細胞(human umbilical mesenchymal stem cells，HUMSCs)外泌小體處理小鼠心肌細胞，觀察其對心肌細胞凋亡的作用，并進一步研究HUMSCs外泌小體中與心臟保護作用相關microRNA的表達，探討HUMSCs通過旁分泌機制保護心肌細胞減少凋亡的機制。

材　料　和　方　法

1實驗動物和材料

SPF級C57BL/6乳小鼠，雌雄不限，1～2日齡，體質量1.2～1.5 g來源于斯貝福(北京)實驗動物科技有限公司；人臍帶標本取自首都醫科大學附屬北京安貞醫院婦產科當日剖宮產健康嬰兒，產婦體健，年齡<35歲，胎齡為38～40周，無肝炎、梅毒、艾滋病等傳染病，無遺傳性疾病史，產婦及家屬對臍帶用于實驗研究均知情同意，并經北京安貞醫院倫理委員會批準。

2主要試劑

DMEM/F12 培養基、胎牛血清(fetal bovine se-rum，FBS)、Ⅱ型膠原酶和胰蛋白酶購自Gibco；青、鏈霉素混合液購自Solaribio；0.01 mmol/L 磷酸鹽緩沖溶液(PBS)購自HyClone；成脂和成骨誘導試劑盒購自Millipore；心肌細胞培養基(cardiac myocyte me-dium，CMM)購自ScienCell；外泌小體提取試劑盒和外泌小體RNA與蛋白分離試劑盒均購自Life Technologies；CD63兔多克隆抗體購自Santa Cruz；逆轉錄試劑盒購自Thermo；IRDye標記的山羊抗兔IgG購自LI-COR；流式細胞術采用的熒光團標記的小鼠抗人抗體: FITC-CD90、PE-CD105、FITC-CD73、PE-CD45、APC-CD34、PECD79a、APC-CD11b、APC-CD19、PEcy5；5-HLA-DR 及同型對照抗體、FITC Annexin V凋亡檢測試劑盒購自BD；實驗中所用引物U6、miR-1a、miR-22、miR24、miR-133a 和miR-139-5p，以及inhibitor negative control # 22和miR-22 inhibitor均購自廣州市銳博生物科技有限公司。

3主要方法

3.1原代人臍帶間充質干細胞的培養將符合入選標準的新鮮臍帶置于預冷的含10%雙抗的1×PBS的培養皿中清洗3次，分別剪取臍帶4 cm兩段，剖開臍帶去除其內的動脈及靜脈血管后得到臍帶華通膠組織，再次分別置于含10%雙抗的1×PBS中清洗3次，去除血污抗菌，將臍帶剪碎成約1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，加入2 g/L Ⅱ型膠原酶與2 g/L透明質酸酶(1∶1) 混合消化液，37 ℃、100 r/min 水浴搖床消化60～90 min，用移液管輕柔吹打，重復消化2～3 次，過200 目銅網純化。收集溶液，1 000 r/min離心5 min，棄上清，將沉淀溶解，細胞接種于培養瓶中，置于5% CO2、37 ℃培養箱中培養，隔日更換培養基，適時傳代[3]。

3.2原代心肌細胞的培養取新生C57乳鼠的心臟置于含有10%雙抗的1×PBS 中，去除心臟組織中的血及雜質，將心臟組織剪碎，加入0.2%的膠原酶Ⅱ消化，37 ℃條件下孵育30 min，用移液管輕柔吹打混勻，過200目銅網，收集溶液，1 000 r/min離心5 min，棄上清，將沉淀溶解，細胞種于培養皿中，孵箱中貼壁1 h，收集未貼壁細胞，計數，以5×105/cm2接種于培養板中。

3.3HUMSCs外泌小體的提取HUMSCs傳至第3代后，以5×106個細胞接種于75 cm2的培養瓶中，加入10 mL無血清培養基，培養3 d后，收集無血清培養基，將培養基10 000 r/min離心30 min，去除細胞殘渣和雜質，吸取上清，按每1 mL細胞培養基體積，加入500 μL外泌小體提取試劑充分混勻，4 ℃孵育過夜，10 000×g離心1 h，沉淀即為外泌小體，以1 mL的初始細胞培養基體積加入25 μL的1×PBS重懸沉淀，以此作為外泌小體實驗原液，-20 ℃保存備用。

3.4細胞缺氧復氧(anoxia/reoxygenation，A/R)模型的建立心肌細胞的培養基更換成經氮氣處理的低氧低血清培養基，置于Thermo的低氧培養箱內進行缺氧處理60 min 后更換成含10% FBS的DMEM培養基，置于5% CO2、37 ℃細胞培養箱內復氧6 h, 進行下一步實驗檢測。

3.5電鏡觀察外泌小體的結構收集培養人臍帶間充質干細胞的上清液，經外泌小體提取試劑盒提純外泌小體，離心后在管底可見少量的白色沉淀物。用1×PBS溶解，經2.5%戊二醛固定、脫水后，利用掃描電鏡觀察。

3.6Western blot 法檢測HUMSCs外泌小體蛋白水平CD63的表達溶于1×PBS的外泌小體置于冰上，加入5×SDS-PAGE，30 min混勻，經SDS-PAGE 蛋白分離后，將其轉移至0.45 μm孔徑NC膜上，轉膜2 h，50 g/L 脫脂奶粉室溫封閉1 h; 分別加入CD63抗體(1∶200)，4 ℃過夜；TBST洗膜8 min×3 次，分別加入IRDye標記的山羊抗兔IgG(1∶8 000)，室溫孵育2 h; TBST洗膜8 min×3次，Bio-Rad凝膠成像系統進行圖像掃描和分析。

3.7實時熒光定量PCR 檢測HUMSCs外泌小體microRNA的表達利用外泌小體總RNA分離試劑盒提取微小RNA，應用逆轉錄試劑盒合成cDNA ，反轉錄進行PCR 擴增。利用Bio-Rad實時定量PCR儀檢測，反應程序設定為94 ℃ 5 min;94 ℃ 18 s, 60 ℃ 18 s,55 ℃ 6 s,擴增40 個循環;從55 ℃ 開始繪制熔解曲線。

3.8心肌細胞凋亡的檢測將1×106個心肌細胞接種于24孔板中，培養24 h后更換心肌細胞培養液，1%胎牛血清的DMEM培養基進行饑餓處理24 h，按實驗分組分別加入不同濃度外泌小體處理24 h、miR-22抑制劑處理48 h后，用2.5 g/L 胰蛋白酶消化，1 000 r/min離心5 min，棄上清，利用Annexin V-FITC/PI檢測試劑盒中的1×buffer重懸細胞，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，一組空白，一組只加5 μL FITC 標記的Annexin V，一組只加5 μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)溶液，其它各組分別加入5 μL FITC 標記的Annexin V和5 μL 濃度為20 mg/L 的PI溶液，混勻后室溫避光孵育15 min，加入300 μL 1×buffer終止反應，混勻，立即用流式細胞儀檢測分析。

4統計學處理

應用統計學軟件Prism GraphPad進行統計學分析，實驗數據以均數±標準誤(mean±SEM)表示，2 組比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，方差分析后各組間的兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結　　果

1人臍帶間充質干細胞的分離與鑒定

用流式細胞術檢測第3代HUMSCs 的CD105、CD73和CD90 表達陽性率高,分別為(99.4±1.62)%、(99.1±2.41)%和(99.5±2.41)%，而CD45、CD34、CD11b、CD79a、CD19和HLA-DR 的表達陽性率低，分別為(0.2±0.08)%、(0.8±0.09)%、(0.2±0.08)%、(0.2±0.06)%、(0.2±0.04)%和(0.1±0.08)%，說明第3代培養的HUMSCs具有MSCs特異性表型特征，見圖1A；向骨細胞分化誘導HUMSCs可見鈣結節形成明顯，經茜素紅染色呈紅色結節，分化率為(92.5±5.1)%以上，見圖1B；經向脂肪細胞分化的細胞見脂滴形成，油紅染色將脂滴染成紅色，分化率為(91.6±3.8)%以上，見圖1C，說明培養的第3代HUMSCs具有MSCs多向分化能力。

Figure 1.Phynotype and differentiation of HUMSCs. A: phenotype of HUMSCs; B: differentiation of HUMSCs towards the osteogenic progenitors (Alizarin red staining, ×100); C: HUMSCs differentiated into adipocytes (oil red O staining).

圖1人臍帶間充質干細胞的分離與鑒定

2間充質干細胞外泌小體的分離與鑒定

經外泌小體提取試劑盒提純的外泌小體經離心后在管底可見少量的白色沉淀物。用25 μL 1×PBS溶解，經2.5%戊二醛固定、脫水后，利用掃描電鏡觀察，可清晰地看到外泌小體的球狀結構，見圖2A；Western blot檢測外泌小體中的CD63蛋白表達水平，并利用細胞培養上清作為陰性對照。從灰度圖中可看出沉淀即提取物在CD63蛋白水平上表達強陽性，見圖2B，提取的外泌小體高表達外泌小體特異性標志物CD63。

Figure 2.Isolation and identification the exosome of the HUMSCs. A: scanning electron microscopy showed the globular structure of the exosome; B: the exosome-specific protein CD63 was strongly positive identified by Western blot.

圖2間充質干細胞外泌小體的分離與鑒定

3外泌小體對心肌細胞缺氧復氧后細胞凋亡的作用

心肌細胞經Annexin V-FITC/PI標記采用流式細胞術檢測凋亡，缺氧復氧處理后的心肌細胞凋亡率明顯增加(P<0.05)，利用外泌小體處理缺氧復氧組可顯著減少細胞的凋亡率(P<0.05)；為觀察不同濃度的外泌小體對心肌細胞凋亡的作用，將外泌小體實驗原液與培養基以1∶100、2∶100、3∶100混合后處理心肌細胞，觀察其是否仍具有同樣的抗細胞凋亡作用，結果顯示差異無統計學顯著性，見圖3。

Figure 3.Apoptosis of the cardiomyocytes treated with HUMSCs exosomes (EXO) after anoxia and reoxygenation (A/R). Mean±SEM.n=4.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

圖3外泌小體對心肌細胞缺氧復氧后細胞凋亡的作用

4實時熒光定量 PCR驗證MSCs外泌小體中microRNA表達

我們利用實時熒光定量PCR 檢測HUMSCs外泌小體中與心臟保護相關microRNA的表達水平。 實驗結果顯示外泌小體富含miR-1a、miR-22、miR-24、miR-133a和miR-139p，其中miR-22的表達水平最高，達到內參照U6的(270.4±9.7)倍，見圖4。

Figure 4.The microRNA expression levels in the exosomes detected by real-time PCR. Mean±SEM.n=4.

圖4Real-time PCR驗證HUMSCs外泌小體中microRNA的表達

5miR-22抑制心肌細胞凋亡

利用miR-22抑制劑處理心肌細胞可增加缺氧復氧后細胞凋亡率(P<0.05)，說明外泌小體中富含的miR-22可有效抑制心肌細胞的凋亡，見圖5。

Figure 5.Apoptosis of the cardiomyocytes treated with miR-22 inhibitor after anoxia and reoxygenation (A/R). miR-22 INC: miR-22 inhibitor negative control; miR-22 INH: miR-22 inhibitor. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vsA/R+miR-22 INC.

圖5miR-22抑制缺氧復氧后心肌細胞的凋亡

討　　論

心肌缺血再灌注損傷導致氧自由基增加和細胞鈣超載引起心肌細胞凝固型壞死、間質細胞水腫、大量炎癥細胞浸潤等，從而導致患者心功能的嚴重受損[4]。研究結果表明，MSCs 發揮心臟保護功能主要是通過旁分泌細胞因子、生長因子等，抑制心肌缺血區局部炎癥的級聯反應、抑制心肌細胞凋亡、促進局部血管新生[5]。MSCs不僅旁分泌細胞因子，而且能夠旁分泌具有生物活性的microRNA，在抑制心肌細胞凋亡、拮抗心肌肥大、改善血管新生等方面起重要的調控作用。

本研究成功培養具有MSCs特異性表型特征的人臍帶間充質干細胞。并且發現外泌小體處理缺氧復氧條件下的心肌細胞，其凋亡率較單純缺氧復氧組有顯著降低，說明外泌小體在缺氧復氧條件下抑制心肌細胞的凋亡起到了一定的關鍵性作用；不同濃度外泌小體處理心肌細胞后，其抗細胞凋亡作用并無明顯變化，外泌小體的作用達到生物學劑量后，對細胞凋亡的影響趨向于穩定，繼續增加劑量其抗凋亡作用不會進一步增加。

MicroRNA 廣泛參與心臟病理和生理過程的調節。既往研究成果顯示microRNA 在心肌細胞和血管內皮細胞的分化、心肌細胞凋亡、心肌缺血區炎癥級聯反應等方面都起到重要的調控作用[6]。心肌梗死急性發作時， miR-1、miR-133a、miR-499 和miR-208a在患者血清中表達迅速增加，參與心肌細胞缺血預適應，可作為急性心肌梗死的預警標志物[7]。過表達miR-499 和miR-1 可間接上調肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain，MHC)和心肌轉錄因子Mef2c，促進MSCs 向心肌細胞方向分化[8]。miR-1 通過靶向性抑制Bcl-2 減少細胞凋亡率，從而降低大鼠心肌缺血再灌注損傷[9]。miR-133、miR-210 和miR-21 通過抑制caspase 級聯反應從而抑制心肌細胞凋亡[10]。本實驗通過對外泌小體內可能與心臟保護作用相關microRNAs的分析，發現外泌小體富含miR-1a、miR-22、 miR-24、miR-133a和miR-139p，說明microRNA可能是外泌小體起到心臟保護作用的重要因素。

近來研究發現，miR-22在腫瘤發生、細胞凋亡、心肌細胞肥大中起重要的調控作用。在神經系統中，miR-22過表達通過抑制絲裂原活化蛋白激酶(MAPK14/p38)和腫瘤蛋白p53誘導核蛋白1(tumor protein p53-inducible nuclear protein 1，Tp53inp1) 能夠有效抑制細胞凋亡，從而起到神經細胞保護作用[11]。在后負荷增加條件下，miR-22基因敲除鼠肌漿網鈣負荷降低較容易發生心肌細胞肥大和心室擴張[12]。最近研究表明，缺氧導致MSCs分泌富含miR-22的外泌小體可通過下調Mecp2而減少心肌細胞凋亡[13]。以上研究結果提示miR-22是參與調控細胞凋亡的重要因子。

我們發現外泌小體富含miR-1a、miR-22、miR-24、miR-133a和miR-139p。其中miR-22表達水平最高，達到內參照U6的(270.4±9.7)倍，提示外泌小體發揮作用可能與外泌小體內的miR-22有關；在缺氧復氧條件下miR-22抑制劑處理心肌細胞后，其細胞凋亡率明顯增加，說明miR-22在心肌細胞缺氧復氧損傷下起到了一定的保護作用。

本課題組前期已證實臍帶MSCs 較骨髓MSCs 具有較強的增殖能力及分化潛能[14]，而且多次尾靜脈注射HUMSCs，未引起大鼠Th1、Th2 細胞免疫和體液免疫系統的變化，Th1/Th2 軸無明顯改變；移植的HUMSCs 能較長時間地存活于大鼠骨髓內，具有較好的免疫相容性[15]。故本實驗取材于人臍帶間充質干細胞，該材料具有方便的可獲得性，對受試對象無傷害，免疫原性低、不涉及法律倫理問題的優勢，為減少心肌缺氧復氧損傷提供了另一種可有效利用的材料。我們成功提取人臍帶間充質干細胞外泌小體，并驗證了外泌小體在心肌缺氧復氧條件下減少心肌細胞凋亡，對心肌細胞起到了一定的保護作用。與此同時，本實驗進一步提示外泌小體起到心肌細胞保護作用的關鍵性因素可能源于外泌小體富含的miRNA-22。本研究為臨床干細胞治療心臟缺血再灌注損傷提供了一個新的理論基礎。外泌小體中富含的miR-22可能成為干細胞治療的新靶點。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Exosomes secreted by human umbilical mesenchymal stem cells protect cardiomyocytes from anoxia-reoxygenation injury

LI Jia2, XIN Yi1,3, CUI Wei1,3, LIU Sa1,3, HUANG Ran-ran1,3, CHEN Juan2, ZHOU Jie2, LI Na1,3

(1CapitalMedicalUniversityAffiliatedBeijingAnzhenHospital,Beijing100029,China;2DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China;3BeijingInstituteofHeart,Lung&BloodVesselDiseases,Beijing100029,China.E-mail:lina82002@126.com)

AIM: To investigate the anti-apoptosis effects of exosomes secreted by human umbilical mesenchymal stem cells (HUMSCs) in anoxia-reoxygenation injury and to analyze the protective microRNA expression levels in the exosomes. METHODS: HUMSCs were isolated and cultured until the 3rd generation, and the immunophenotype were identified by flow cytometry. The culture supernatant was collected, and the exosomes were purified using a Total Exosome Isolation kit. The morphology of the exosome was observed under electron microscope. The protein expression level of exosome-specific marker CD63 in the extract was determined by Western blot. The cardiomyocytes were treated with the exosomes under the anoxia and reoxygenation conditions and the apoptosis was studied by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI staining. The expression levels of the cardioprotective microRNAs in the exosomes were detected. The apoptosis of the cardiomyocytes treated with miR-22 inhibitor was analyzed. RESULTS: The 3rd generation of HUMSCs highly expressed CD105, CD73 and CD90, but negatively expressed CD45, CD34, CD11b, CD79a, CD19 and HLA-DR, indicating that the culture of the 3rd generation of HUMSCs had the specific phenotype characteristics of MSCs. The differentiation percentage of the HUMSCs towards osteocytes was more than (92.5±5.1)%. In the adipocyte differentiation assay, the lipid droplets in the cells were observed and the differentiation rate was more than (91.6±3.8)%, indicating that the HUMSCs had multipotent differentiation capacity. Scanning electron microscopy showed globular structure of the exosomes which also strongly expressed the exosome-specific protein CD63. Anoxia and reoxygenation induced higher apoptosis of cardiomyocytes (P<0.05). The exosome treatment significantly decreased the apoptosis of cardiomyocytes (P<0.05). The anti-apoptotic effects of the exosomes at different concentrations, were almost the same (P>0.05). The high levels of miR-1a, miR-22, miR24, miR-133a and miR-139-5p were detected in the exosomes, among which the expression level of miR-22 was the highest, (270.4±9.7) times as high as the internal reference U6. Under the anoxia and reoxygenation conditions, the apoptosis of cardiomyocytes was significantly increased after miR-22 inhibitor treatment (P<0.05). CONCLUSION: Exosomes secreted by HUMSCs effectively reduce the apoptosis of cardiomyocytes from anoxia-reoxygenation injury. It might be related to high expression level of miR-22 in the secreted exosomes.

Human umbilical mesenchymal stem cells; Exosomes; MicroRNAs; Cardiomyocytes; Anoxia; Reoxygenation

1000- 4718(2016)04- 0577- 07

2015- 10- 27

2015- 12- 18

國家自然科學基金資助項目(No. 81370228);省部共建重點教育部心血管重塑相關疾病重點實驗室項目(No. 110267);北京市衛生系統高層次衛生技術人才培養計劃(No. 2014-3-045)

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R363.2

A

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