抑制囊泡轉運對大鼠內皮祖細胞增殖及鈣庫操縱性鈣內流的影響*

張　弢，　王彥偉，　楊　杰，　袁方正圓，　張繼航，　黃　嵐

(第三軍醫大學新橋醫院全軍心血管病研究所，重慶 400037)

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抑制囊泡轉運對大鼠內皮祖細胞增殖及鈣庫操縱性鈣內流的影響*

張弢，王彥偉，楊杰，袁方正圓，張繼航，黃嵐△

(第三軍醫大學新橋醫院全軍心血管病研究所，重慶 400037)

目的： 研究囊泡轉運在大鼠內皮祖細胞(EPCs)增殖及鈣庫操縱性鈣內流(SOCE)調控中的作用。方法: 密度梯度離心法分離獲取、并用acLDL-DiI和FITC-UEA-I熒光雙染鑒定脾源性EPCs。布雷菲德菌素A(BFA)抑制囊泡轉運，CCK-8法和實時無標記細胞功能分析儀觀察EPCs增殖變化，流式細胞術檢測凋亡情況，并檢測囊泡轉運關鍵蛋白ADP核糖基化因子GTP酶活化蛋白1(ARFGAP1)的表達。激光共聚焦顯微鏡觀察囊泡轉運抑制后SOCE并用Western blot 檢測SOCC復合體蛋白表達，進一步采用RNA干擾的方式觀察囊泡轉運對瞬時受體電位通道1(TRPC1)蛋白表達及SOCE的影響。結果: 雙染鑒定大鼠脾源性EPCs陽性率為82.53%±6.12%。BFA顯著抑制EPCs的增殖但對凋亡無明顯影響，同時ARFGAP1表達也明顯降低，說明EPCs的囊泡轉運受到抑制。抑制EPCs囊泡轉運顯著下調TRPC1的表達，并降低SOCE。siTRPC1使EPCs的SOCE下降，但si-TRPC1預處理并抑制囊泡轉運并沒有使EPCs的SOCE進一步降低。結論: 抑制EPCs的囊泡轉運可以抑制EPCs的增殖并通過下調TRPC1的表達降低SOCE水平。

內皮祖細胞； 囊泡轉運； 瞬時受體電位通道1

血管內皮損傷是動脈粥樣硬化發生的病理基礎，血管損傷后，鄰近的內皮細胞對損傷的血管內皮進行有限的修復。既往研究證實，內皮損傷后內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)——內皮細胞的前體細胞——通過動員到外周血，歸巢至損傷血管處，參與受損內皮的修復。因此，研究內皮祖細胞增殖的相關機制顯得尤為重要。

本實驗室早先的研究發現鈣庫操縱性鈣通道(store-operated Ca2+channels，SOCC)通過調控鈣庫操縱性鈣內流(store-operated calcium entry，SOCE)影響EPCs的增殖等生物學功能[1]。間質相互作用分子1(stromal interaction molecule 1，STIM1)作為SOCC的鈣離子感受器，感受內質網鈣庫鈣離子濃度變化，當鈣庫耗竭時通過與細胞膜上鈣釋放激活鈣調因子1(calcium release-activated calcium modulator 1，Orai1)和/或瞬時受體電位通道1(transient receptor potential channel 1，TRPC1)相互作用，從而激活SOCE。Orai1和TRPC1是細胞膜上的通道蛋白，SOCC的重要組成部分。Orai1、TRPC1和STIM1對EPCs的SOCE起重要調節作用[2-3]。囊泡轉運作為部分膜蛋白的重要運輸方式[4]可能會影響Orai1和TRPC1的表達與轉運，進一步調控SOCE。ADP核糖基化因子(ADP-ribosylation factor，ARF)是囊泡轉運的關鍵成分，調控囊泡的生成。ARF只有和GTP結合時才具有活性。ARF主要參與蛋白質在內質網和高爾基體之間的轉運，對蛋白的分揀起到啟動作用。本課題使用布雷菲德菌素A(brefeldin A，BFA)抑制細胞內部ARF的活性，阻斷ARF與GTP的結合，從而特異性地抑制細胞內囊泡轉運。囊泡轉運受抑制后，細胞增殖減弱，因此，細胞的增殖功能也常被用作評價囊泡轉運抑制效率的重要參考。囊泡轉運與調節TRPC1的膜表達密切相關[5]，但其對SOCE及SOCC其它組成蛋白是否有影響尚未見報道。我們擬使用BFA抑制大鼠EPCs的囊泡轉運觀察其對SOCC復合體組成蛋白表達和SOCE的影響，這將有助于找到全新的SOCC復合體調節靶點，提高EPCs的血管修復能力，為血管損傷修復提供新的研究方向。

材　料　和　方　法

1動物

成年雄性SD大鼠，重約150 g，SPF級，購自新橋醫院實驗動物中心。

2主要試劑

BFA購自Selleck；DMEM低糖培養基和胎牛血清購自Gibco；大鼠淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物公司；蛋白裂解液、CCK-8試劑和Fluo-3/AM購自碧云天生物公司；STIM1和ARF GTP酶活化蛋白1(ARF GTPase-activating protein 1, ARFGAP1)抗體購自CST；TRPC1-siRNA和Orai1抗體購自Santa Cruz；TRPC1抗體購自Abcam；LipofectamineTM2000由Invitrogen生產。

3主要方法

3.1脾源性大鼠EPCs的培養與鑒定參照本實驗室前期工作方法[1]，頸部脫臼法處死大鼠，無菌條件下取脾臟分離單個核細胞培養5～7 d。用acLDL-DiI和FITC-UEA-I熒光雙染鑒定EPCs。

3.2實時無標記細胞功能分析儀(real-time cell analyzer instrument，RTCA)測定BFA對EPCs增殖能力的影響原代EPCs以每孔5×104個細胞密度接種至E-Plate L8，對照組和BFA組各設3個復孔。上樣后將E-Plate L8放到iCelligence系統上，系統會自動掃描記錄細胞生長全程。37 ℃、5% CO2培養48 h，換新鮮培養基并向BFA組中加入BFA(1 μmol/L)，繼續培養至120 h。數據導入RTCAData Analysis Software 1.0進行分析。

3.3CCK-8法測定BFA對EPCs增殖能力的影響根據說明書，將原代EPCs以每孔5 000個的密度接種至96孔板，每組4個復孔。設置不同濃度BFA組(0.01、0.1、0.5、1、10、100 μmol/L)，37 ℃、5% CO2培養24 h，棄原培養基，每孔加100 μL不含血清DMEM培養基和10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h后酶標儀測定450 nm波長的吸光度，重復3次。

3.4流式細胞術檢測凋亡率預處理好EPCs，收集各組細胞上清液，PBS洗滌并用胰酶消化貼壁細胞3 min，終止消化后與先前收集的對應組上清液細胞混合，PBS洗滌3次制備1×106的細胞懸液，加Anne-xin V和PI染色，上流式細胞儀檢測凋亡率。

3.5細胞內鈣離子濃度的測定共聚焦培養皿上接種原代EPCs，培養至細胞融合率超過80%，加5 nmol/L的Fluo-3/AM，37 ℃避光孵育30 min。換新鮮DMEM培養基繼續孵育40 min，無鈣PBS洗滌3次加1 mL無鈣PBS，激光共聚焦顯微鏡下觀察(激發波長488 nm，發射波長530 nm)細胞的熒光強度。

3.6蛋白印跡實驗細胞裂解液處理EPCs提取總蛋白，BCA法測量蛋白濃度。10% SDS-PAGE分離蛋白，50 μg蛋白上樣量，120 V恒壓電泳至目的蛋白與其它蛋白明顯分離，后以90 V、90 min將分離膠上蛋白電轉至PVDF膜。電轉后5%的脫脂奶粉封閉，4 ℃條件下I抗孵育過夜，TBST洗滌3次，加II抗37 ℃孵育1 h，TBST洗滌3次，ECL顯色。

3.7TRPC1-siRNA轉染EPCs6孔板培養EPCs至細胞融合率達到70%以上，換成無青霉素和鏈霉素的含20%胎牛血清的DMEM低糖培養基繼續培養24 h。250 μL轉染培養基稀釋4 μg TRPC1-siRNA，另外250 μL轉染培養基稀釋5 μL LipofectamineTM2000，后將兩者混合，于室溫下靜置20 min。再將500 μL混合液加入6孔板單孔，37 ℃、5% CO2培養6 h后換成2 mL的含血清DMEM低糖培養基繼續培養48 h。最后通過Western blot檢測轉染效率。

4統計學處理

使用SPSS 19.0軟件進行分析，數據表示為均數±標準差(mean±SD),多組間比較使用單因素方差分析，兩組之間比較使用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結　　果

1BFA對EPCs增殖的影響

BFA是囊泡轉運的特異性抑制劑，為了探索BFA合適的作用濃度，我們用0.1～100 μmol/L不同濃度BFA處理EPCs并觀察對增殖的影響。如圖1所示，BFA濃度為1 μmol/L時細胞增殖明顯受到抑制。為了進一步探索合適的BFA作用時間，我們用1 μmol/L BFA處理細胞后利用RTCA技術動態觀察細胞增殖情況，發現24 h 時BFA處理組與對照組比較差異有統計學顯著性(P<0.05)?？紤]到藥物對細胞的其它影響，我們選擇把濃度為1 μmol/L 的BFA處理24 h作為后續實驗的處理條件。

Figure 1.BFA inhibited the proliferation of EPCs detected by CCK-8 assay after the cells were exposed to different concentrations of BFA (A), and the proliferation of the cells at different time points after treated with BFA (1 μmol/L) was detected (B). Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group.

圖1BFA抑制EPCs增殖

2BFA對EPCs凋亡的影響

如圖2所示，對照組的凋亡率為8.73%±0.63%，BFA處理組的凋亡率為9.67%±0.29%，2組間差異無統計學顯著性，從而說明EPCs增殖降低不是因為凋亡引起。

3BFA對ARFGAP1蛋白表達的影響

我們用濃度為1 μmol/L 和0.1 μmol/L的BFA分別 處理EPCs，觀察ARFGAP1的表達變化，結果顯示，1 μmol/L處理組的 ARFGAP1表達明顯低于對照組(P<0.05)，見圖3。

Figure 2.BFA had no influence on the apoptosis of EPCs. Apoptosis was detected by flow cytometry after treatment with BFA (1 μmol/L). Mean±SD.n=3.

圖2BFA對EPCs凋亡無影響

Figure 3.BFA down-regulated the expression of ARFGAP1. EPCs were treated with various concentrations (0.1 and 1 μmol/L) of BFA. The expression of ARFGAP1 was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖3BFA下調ARFGAP1表達

4抑制囊泡轉運對SOCE以及細胞內鈣濃度的影響

如圖4所示，BFA處理組所激發的SOCE波峰明顯低于對照組，細胞內游離鈣離子濃度同樣明顯低于對照組(P<0.05)。

Figure 4.Vesicular transport inhibition reduced SOCE and concentration of intracellular calcium. EPCs, incubated with or without BFA (1 μmol/L) for 24 h, were treated with thapsigargin (TG; 2 μmol/L) to induce the release of intracellular calcium store in a calcium-free solution (left peak of A), followed by Ca2+(2 mmol/L)to induce calcium [Ca2+] inward (right peak of A). At the same time, the average value of intracellular calcium ([Ca2+]i) was detected (B). Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group.

圖4抑制囊泡轉運降低SOCE和細胞內鈣濃度

5抑制囊泡轉運對SOCC主要組成蛋白表達的影響

TRPC1、Orai1和STIM1是SOCC復合體的主要組成分子，其表達的改變能夠明顯影響SOCE。我們研究發現抑制囊泡轉運會下調TRPC1的表達，但對Orai1和STIM1的表達無明顯抑制，見圖5。

Figure 5.Vesicular transport inhibition down-regulated the expression of TRPC1. The EPCs were treated with BFA (1 μmol/L), and then the main proteins of SOCC complex were detected. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group.

圖5抑制囊泡轉運下調TRPC1表達

6TRPC1-siRNA轉染EPCs后對鈣流的影響

TRPC1-siRNA轉染后，TRPC1表達明顯受到抑制(P<0.01)，而后我們檢測抑制TRPC1對EPCs的SOCE水平的影響，發現其明顯低于對照組，進一步在抑制TRPC1的基礎上同時抑制囊泡轉運，SOCE的水平與單獨抑制TRPC1無明顯差異。我們還觀察了有鈣環境下EPCs的鈣內流水平變化情況，發現單獨抑制TRPC1和抑制囊泡轉運都會降低鈣內流水平，而同時抑制TRPC1和囊泡轉運鈣內流水平與單獨抑制TRPC1無明顯差異。這說明了抑制囊泡轉運引起的SOCE降低與TRPC1相關，見圖6。

Figure 6.Vesicular transport inhibition decreased the levels of SOCE in the EPCs via regulation of TRPC1. The expression of TRPC1 was detected by Western blot after transfection with siTRPC1 (A). EPCs were treated with TG (2 μmol/L) to induce the release of intracellular calcium-store in a calcium-free solution (left peak of B), followed by Ca2+to induce calcium inward (right peak of B). Meanwhile, the calcium current was detected after EPCs were treated with Ca2+(C). Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖6抑制囊泡轉運通過調控TRPC1減弱EPCs的SOCE

討　　論

既往研究發現，囊泡轉運是細胞的基本生理過程之一，調控著細胞內多種物質的轉運，囊泡轉運受到抑制時細胞增殖會相應地下降。我們用囊泡轉運抑制劑BFA處理EPCs發現增殖受到明顯抑制，推測囊泡轉運可能受到抑制，但有文獻報道BFA還可以誘導內質網應激引起凋亡[6]，因此我們觀察了BFA對EPCs凋亡的影響，結果顯示BFA處理對EPCs凋亡無明顯影響，說明EPCs增殖的抑制主要由囊泡轉運的抑制引起。與此同時我們檢測了囊泡轉運相關蛋白ARFGAP1的表達情況，它的主要作用是調節囊泡形成以及膜轉運過程，其表達水平的變化可以間接反映胞內囊泡轉運情況[7]，進一步證實了 EPCs的增殖抑制主要由囊泡轉運受到抑制引起。

我們的研究發現，抑制大鼠EPCs的囊泡轉運， EPCs的鈣釋放激活通道電流和細胞內鈣濃度均明顯降低，說明抑制囊泡轉運降低SOCE。為了探索SOCE降低的相關機制，我們觀察了BFA對SOCC復合體主要組成蛋白(Orai1、STIM1和TRPC1)表達的影響，結果顯示TRPC1表達明顯下調，而Orai1和STIM1表達無明顯變化，故我們推測抑制囊泡轉運對SOCE的影響可能與TRPC1有關。繼而我們利用基因技術干擾TRPC1表達并觀察BFA對SOCE的影響，結果顯示與siTRPC1組相比，干擾TRPC1后加BFA處理SOCE無明顯變化，說明抑制囊泡轉運通過下調TRPC1表達，進而導致SOCE的降低。我們的發現首次闡明了囊泡轉運與SOCE之間的關系，并對相關機制進行了初步探索。

我們的研究主要通過BFA抑制ARF分子來實現對囊泡轉運的調控。ARF廣泛存在于真核細胞中，對于膜轉運具有關鍵性的調節作用[7]。它主要作用于囊泡的形成起始階段，通過調控招募囊泡的生物合成蛋白以及修飾跨膜蛋白來實現此功能。ARF與其它調節型GTP結合蛋白一樣，在GTP和GDP的循環之間起到分子開關的作用[8]，當ARF與GTP結合時才具有活性，而這種活性狀態能夠被BFA所阻斷[9]。研究表明BFA可以競爭性抑制ARF與GTP的結合從而導致囊泡前體COPI受阻，使蛋白質在內質網中堆積，不能正常轉運到高爾基體[10]，通過此方式運輸的膜蛋白也無法正常轉運到細胞膜上進一步發揮生物學功能。

TRPC通道蛋白受囊泡轉運相關蛋白的調控，從而影響其在細胞膜上的定位和功能發揮。有文獻報道，正常細胞內異源性表達TRPC1對SOCE無明顯影響[11]，而抑制正常細胞內的TRPC1蛋白表達則會明顯降低SOCE[12]，這可能說明TRPC1只有轉運到細胞膜上才能發揮功能。最近的研究還發現TRPC1只有轉運到細胞膜上并且正確錨定到功能位點與輔助蛋白結合才能形成有功能的通道，囊泡轉運在這一過程發揮了重要作用[13-14]。我們的研究發現，在EPCs上抑制囊泡轉運，能夠明顯降低TRPC1的表達，進而降低SOCE， EPCs的增殖也同時受到了抑制。本實驗室前期研究已經證明了通過下調SOCE可以降低EPC的增殖，但是抑制囊泡轉運是否是通過調節SOCE來影響EPCs的增殖目前還不清楚，因而我們將在下一階段的實驗來進行驗證。

本研究發現抑制EPCs的囊泡轉運可以抑制EPCs的增殖并通過下調TRPC1的表達影響SOCC復合體的功能從而降低SOCE的水平。這說明囊泡轉運可以作為SOCC復合體的一種全新的調控靶點從而影響EPCs生物學功能。在未來的研究中我們可以對TRPC1蛋白囊泡轉運過程的進一步探索來實現對TRPC1功能的調控，從而為臨床心血管疾病的治療提供全新的分子靶標。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Influences of vesicular transport inhibition on proliferation and store-operated calcium entry in rat endothelial progenitor cells

ZHANG Tao, WANG Yan-wei, YANG Jie, YUAN Fang-zheng-yuan, ZHANG Ji-hang, HUANG Lan

(InstituteofCardiovascularDiseasesofPLA,XinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China.E-mail:huanglan260@126.com)

AIM: To investigate the effects of vesicular transport inhibition on the proliferation and regulation of store-operated calcium entry (SOCE) in rat endothelial progenitor cells (EPCs). METHODS: EPCs were isolated from the rats with density-gradient centrifugation and confirmed via double fluorescence staining with acLDL-DiI and FITC-UEA-I. After inhibition of vesicular transport with brefeldin A (BFA), the proliferation of EPCs was measured by CCK-8 assay and real-time cell analyzer instrument, apoptosis was analyzed by flow cytometry, and the expression of ADP-ribosylation factor GTPase-activating protein 1 (ARFGAP1), a key protein to vesicular transport, was also detected. SOCE was observed under laser scanning confocal microscope after the vesicular transport was inhibited, and the protein expression of SOCC complex was determined by Western blot. Furthermore, the influences of vesicular transport inhibition on the expression of transient receptor potential channel 1 (TRPC1) and SOCE were examined with a RNA interference method. RESULTS: The acLDL-DiI and FITC-UEA-I double positive rate of the cells was 82.53%±6.12%. BFA insult significantly inhibited the proliferation of EPCs and down-regulated the expression of ARFGAP1, and no influence on the apoptosis of the EPCs was observed, suggesting that vesicular transport of EPCs was inhibited. Vesicular transport inhibition remarkably down-regulated the expression of TRPC1 and decreased SOCE level. No evident difference in the level of SOCE between siTRPC1 group and siTRPC1+BFA group, in which the cells were pretreated with siTRPC1 before BFA addition, was observed. CONCLUSION: Vesicular transport inhibition in EPCs reduces the proliferation of EPCs and decreases SOCE level through down-regulation of TRPC1.

Endothelial progenitor cells; Vesicular transport; Transient receptor potential channel 1

1000- 4718(2016)04- 0591- 06

2015- 12- 31

2016- 03- 07

國家自然科學基金資助項目(No. 81370211)

Tel: 023-68755601; E-mail: huanglan260@126.com

R329.25

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.04.003

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