Aliskiren抑制LPS誘導(dǎo)HUVECs新生血管的形成及可能機(jī)制*

李兆欣，　劉江月，　王其新△

(1青島大學(xué)附屬醫(yī)院, 山東 青島 266000； 2濰坊醫(yī)學(xué)院病理生理教研室， 山東 濰坊 261053)

?

Aliskiren抑制LPS誘導(dǎo)HUVECs新生血管的形成及可能機(jī)制*

李兆欣1，劉江月2，王其新1△

(1青島大學(xué)附屬醫(yī)院, 山東 青島 266000；2濰坊醫(yī)學(xué)院病理生理教研室， 山東 濰坊 261053)

目的： 研究阿利吉侖(aliskiren)對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)新生血管形成能力的影響及可能的機(jī)制。方法: 常規(guī)培養(yǎng)的HUVECs隨機(jī)分為空白組和腎素組，ELISA法測(cè)定炎性細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)水平， Western blot法檢測(cè)Toll樣受體4(TLR4)和ICAM-1的蛋白水平。將常規(guī)培養(yǎng)的HUVECs隨機(jī)分為空白對(duì)照組、LPS模型組以及aliskiren低劑量(1 μmol/L)、中劑量(10 μmol/L)和高劑量(100 μmol/L)組。MTT法和BrdU法檢測(cè)HUVECs的增殖能力，Transwell法測(cè)定HUVECs的遷移率，以HUVECs在Matrigel膠上形成管腔結(jié)構(gòu)情況來判斷其血管形成能力。ELISA測(cè)定炎性細(xì)胞因子TNF-α、ICAM-1和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)的水平，RT-PCR和Western blot 法檢測(cè)腎素、TLR4、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的mRNA和蛋白水平。結(jié)果: 腎素能夠刺激HUVECs炎癥因子的分泌及TLR4的表達(dá)；aliskiren呈濃度依賴性抑制HUVECs增殖、遷移及新生血管形成，降低MCP-1、TNF-α、IL-6水平及腎素、MMP-2、MMP-9的表達(dá)，抑制TLR4表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論: Aliskiren能夠有效抑制LPS誘導(dǎo)HUVECs新生血管形成能力，可能與其下調(diào)腎素表達(dá)抑制TLR4途徑介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及MMP-2、MMP-9生成有關(guān)。

阿利吉倫； 新生血管形成； 炎癥反應(yīng)； Toll樣受體 4； 腎素

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是心腦血管疾病的病理生理基礎(chǔ)，斑塊不穩(wěn)定與急性心腦血管事件發(fā)生密切相關(guān)。近年研究證明，斑塊內(nèi)血管新生是衡量斑塊穩(wěn)定性的一項(xiàng)新指標(biāo)[1]。新生血管可促進(jìn)炎癥細(xì)胞聚集，誘發(fā)斑塊出血和破裂，因此，減少斑塊內(nèi)血管新生、穩(wěn)定斑塊成為防治冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的治療靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)腎素基因高表達(dá)能夠使血管炎癥因子、黏附分子的基因和蛋白表達(dá)增加，加重內(nèi)皮細(xì)胞損傷，使AS斑塊不穩(wěn)定性增加[2-3]。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)介導(dǎo)的細(xì)胞因子和趨化因子產(chǎn)生增加能刺激細(xì)胞的遷移和細(xì)胞增殖[4]。TLR4激動(dòng)還能導(dǎo)致基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-2、-9和組織蛋白酶表達(dá)增加，這些蛋白酶參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解[5]。MMP-2 通過重塑細(xì)胞外基質(zhì)和降解基底膜使內(nèi)皮細(xì)胞從原有血管遷移到外周形成新生血管，最終導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展[6]。Celletti等[7]發(fā)現(xiàn)，在AS 斑塊內(nèi)MMP-9 的水平與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)呈正相關(guān)，提示MMP-9 的水平可能影響斑塊內(nèi)血管生成。阿利吉侖(aliskiren)是近年新發(fā)現(xiàn)的腎素抑制劑，具有抗氧化應(yīng)激和炎癥[8]的作用。炎癥激活的內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生增殖和遷移，能夠促進(jìn)斑塊內(nèi)血管和血管網(wǎng)的形成。本研究以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)為對(duì)象，觀察aliskiren是否通過下調(diào)腎素表達(dá)抑制TLR4途徑介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及MMP的生成，抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)新生血管的形成，增強(qiáng)斑塊的穩(wěn)定性，延緩AS的發(fā)生發(fā)展。

材　料　和　方　法

1材料

1.1細(xì)胞株HUVECs購(gòu)于Thermo Fisher Scienti-fic。

1.2藥物與主要試劑Aliskiren(瑞士諾華制藥有限公司)；人重組腎素(Cayman)；細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和胰蛋白酶(Sigma)；DMEM 低糖培養(yǎng)基(Gibco)；胎牛血清(HyClone)；Western blot相關(guān)試劑以及檢測(cè)TLR4、MMP-2和MMP-9的RT-PCR試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)和細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)ELISA試劑盒，腎素、TLR4、MMP-2和MMP-9抗體(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3主要儀器752型紫外分光光度計(jì)(上海精密儀器有限公司)；DYCZ-25D型電泳儀(北京市六一儀器廠)；Bio-Rad 型濕轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad)。

2方法

2.1ELISA測(cè)定腎素對(duì)HUVECs分泌TNF-α和ICAM-1的影響將生長(zhǎng)良好的HUVECs接種于6孔板，分為空白組、腎素組，腎素組加入10-9mol/L 腎素孵育20 min后，收集上清，采用ELISA試劑盒分別檢測(cè)TNF-α和ICAM-1的水平。

2.2Western blot 法檢測(cè)腎素對(duì)HUVECs TLR4和ICAM-1蛋白表達(dá)的影響細(xì)胞處理同ELISA實(shí)驗(yàn)，收集細(xì)胞后加入細(xì)胞裂解液提取蛋白，SDS-PAGE分離蛋白后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入 I 抗(1∶500)后4 ℃過夜，TBST漂洗后加入 II 抗孵育1 h，化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，顯影定影，圖像分析。

2.3MTT法檢測(cè)Aliskiren對(duì)LPS誘導(dǎo)HUVECs活力的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVECs處理后接種于96孔板，分為空白對(duì)照(control)組、LPS(10 mg/L)組以及aliskiren低劑量(low-dose,LD)、中劑量(middle-dose,MD)和高劑量組(high-dose,HD)。LD、MD和HD組分別加入1、10和100 μmol/L aliskiren孵育24 h后，除control組外，其余各組加入終濃度10 mg/L的LPS繼續(xù)培養(yǎng)24 h。換新的培養(yǎng)基，加入MTT(0.5%)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加入150 μL DMSO，用酶標(biāo)儀490 nm測(cè)定吸光度(A)值。

2.4BrdU法檢測(cè)aliskiren對(duì)LPS誘導(dǎo)HUVECs增殖的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVECs處理后接種于96孔板，低、中和高劑量組分別加入1、10和100 μmol/L aliskiren孵育24 h后，除control組外，其余各組加入終濃度10 mg/L的LPS繼續(xù)培養(yǎng)24 h。換新的培養(yǎng)基，每孔加入BrdU 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，去除BrdU加入FixDenat 200 μL固定細(xì)胞30 min。去除FixDenat，每孔加入BrdU-Pod抗體100 μL，常溫孵育90 min，洗板3次后每孔加入100 μL底物顯色液，孵育20 min后觀察顏色變化，用酶標(biāo)儀490 nm測(cè)定吸光度(A)值。

2.5Transwell法測(cè)定aliskiren對(duì)LPS誘導(dǎo)HUVECs的遷移率將生長(zhǎng)良好的HUVECs調(diào)整密度為2×109/L。取100 μL 細(xì)胞懸液加入Transwell小室上室中，同時(shí)低、中和高劑量組分別加入1、10和100 μmol/L aliskiren。下室除control組外，其余各組加入LPS作為刺激劑。培養(yǎng)6 h后，拿出小室，4%多聚甲醛固定10 min，結(jié)晶紫染色30 min，PBS 漂洗3次，去除濾膜上層細(xì)胞后，鏡下觀察細(xì)胞遷移情況并拍照。

2.6HUVECs管腔形成實(shí)驗(yàn)在24孔板中加入預(yù)冷融化的Matrigel膠，37 ℃凝固 1 h，預(yù)處理的HUVECs(處理方法同前)以每孔1×104的密度鋪于Matrigel膠上，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h，光鏡下觀察拍照。

2.7ELISA測(cè)定aliskiren對(duì)LPS誘導(dǎo)HUVECs的TNF-α、ICAM-1和MCP-1水平將生長(zhǎng)良好的HUVECs接種于6孔板，低、中和高劑量組分別加入1、10和100 μmol/L aliskiren孵育24 h后，除control組外，其余各組加入終濃度10 mg/L的LPS繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集上清，采用ELISA試劑盒分別檢測(cè)TNF-α、ICAM-1、MCP-1水平。

2.8RT-PCR法檢測(cè)aliskiren對(duì)LPS誘導(dǎo)HUVECs腎素、TLR4、MMP-2和MMP-9的mRNA表達(dá)細(xì)胞處理同ELISA實(shí)驗(yàn)，收集細(xì)胞，提取總RNA后合成cDNA，GAPDH為內(nèi)參照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 30 s, 55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min,共30個(gè)循環(huán)。

表1　引物序列

2.9Western blot 法檢測(cè)aliskiren對(duì)LPS誘導(dǎo)HUVECs腎素、TLR4、MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)細(xì)胞處理同ELISA實(shí)驗(yàn)，收集細(xì)胞后加入細(xì)胞裂解液提取蛋白，SDS-PAGE分離蛋白后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入 I 抗(1∶500)后4 ℃過夜，TBST漂洗后加入 II 抗孵育1 h，化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，顯影、定影，圖像分析。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

1腎素對(duì)HUVECs分泌TNF-α和ICAM-1的影響

與空白組比較，腎素組的TNF-α和ICAM-1水平明顯升高(P<0.05)，說明腎素可以刺激HUVECs分泌炎癥因子，見圖1。

Figure 1.The effect of renin on the secretion of TNF-α and ICAM-1 in HUVECs.Mean±SD.n=10.*P<0.05vsblank group.

圖1腎素對(duì)HUVECs分泌TNF-α和ICAM-1的影響

2腎素對(duì)HUVECs TLR4和ICAM-1蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，腎素組TLR4和ICAM-1蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05)，說明腎素可以激活TLR4炎癥通路，促進(jìn)HUVECs炎癥因子的表達(dá)，見圖2。

Figure 2.The effect of renin on the expression of TLR4 and ICAM-1 proteins in HUVECs. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsblank group.

圖2腎素對(duì)HUVECs分泌TLR4、ICAM-1蛋白表達(dá)的影響

3Aliskiren對(duì)LPS誘導(dǎo)HUVECs增殖的影響

MTT和BrdU結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，LPS模型組細(xì)胞的增殖明顯增強(qiáng)(P<0.05)；與LPS模型組比較，aliskiren低、中、高劑量各組細(xì)胞的增殖明顯受抑制(P<0.05)；與aliskiren中劑量組比較，低劑量組的細(xì)胞增殖抑制作用明顯減弱(P<0.05)，高劑量組的細(xì)胞增殖抑制作用明顯增強(qiáng)(P<0.05)，說明aliskiren對(duì)LPS誘導(dǎo)HUVECs增殖呈明顯劑量依賴性抑制作用，見圖3、4。

Figure 3.The effect of aliskiren on the viability of LPS-induced HUVECs. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsLPS group;△P<0.05vsMD group.

圖3Aliskiren對(duì)LPS誘導(dǎo)HUVECs活力的影響

4Aliskiren對(duì)LPS誘導(dǎo)HUVECs遷移的影響

與空白對(duì)照組比較，LPS模型組HUVECs的遷移能力明顯增強(qiáng)，細(xì)胞遷移數(shù)量明顯增多，而aliskiren低、中、高劑量組加入不同濃度aliskiren干預(yù)后細(xì)胞

Figure 4.The effect of aliskiren on the proliferation of LPS-induced HUVECs. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsLPS group;△P<0.05vsMD group.

圖4Aliskiren對(duì)LPS誘導(dǎo)HUVECs增殖的影響

遷移的數(shù)量明顯減少(P<0.05)；且與aliskiren中劑量組比較，低劑量組細(xì)胞遷移的數(shù)量明顯增多(P<0.05)，高劑量組細(xì)胞遷移的數(shù)量明顯減少(P<0.05)，表明 LPS 對(duì) HUVECs 有很強(qiáng)的誘導(dǎo)遷移作用，而aliskiren呈濃度依賴性抑制了其誘導(dǎo)遷移的能力，見圖5。

5Aliskiren對(duì)LPS誘導(dǎo)HUVECs管腔形成的影響

空白對(duì)照組HUVECs多形成條索狀或不連續(xù)小管樣結(jié)構(gòu)，完整小管形成數(shù)量少；與空白對(duì)照組比較，LPS模型組小管形成數(shù)量明顯增加；與LPS模型組比較，不同濃度的aliskiren干預(yù)對(duì)HUVECs小管形成有明顯濃度依賴性抑制作用(P<0.05),見圖6。

Figure 5.The effect of aliskiren on the migration of LPS-induced HUVECs. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsLPS group;△P<0.05vsMD group.

圖5Aliskiren對(duì)LPS誘導(dǎo)HUVECs遷移的影響

6Aliskiren對(duì)LPS誘導(dǎo)HUVECs分泌TNF-α、ICAM-1和MCP-1的影響

與空白對(duì)照組比較，LPS模型組的TNF-α、ICAM-1和MCP-1水平明顯升高(P<0.05)；與LPS模型組比較，aliskiren低、中、高劑量各組的TNF-α、ICAM-1和MCP-1水平均明顯減少(P<0.05)；與

Figure 6.The effect of aliskiren on the capillary-like tube formation of LPS-induced HUVECs. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsLPS group;△P<0.05vsMD group.

圖6Aliskiren對(duì)LPS誘導(dǎo)HUVECs管腔形成的影響

aliskiren中劑量組比較，低劑量組的TNF-α、ICAM-1和MCP-1水平明顯升高(P<0.05)，而高劑量組的TNF-α、ICAM-1和MCP-1水平明顯降低(P<0.05)，說明aliskiren呈明顯濃度依賴性抑制LPS誘導(dǎo)HUVECs的TNF-α、ICAM-1和MCP-1分泌，見圖7。

Figure 7.The effect of aliskiren on the secretion of TNF-α, ICAM-1 and MCP-1 in LPS-induced HUVECs. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsLPS group;△P<0.05vsMD group.

圖7Aliskiren對(duì)LPS誘導(dǎo)HUVECs分泌TNF-α、ICAM-1和MCP-1的影響

7Aliskiren對(duì)LPS誘導(dǎo)HUVECs腎素、TLR4、MMP-2和MMP-9 mRNA表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較，LPS模型組腎素、TLR4、MMP-2和MMP-9的mRNA表達(dá)均顯著升高；與LPS模型組比較，aliskiren低、中和高劑量各組腎素、TLR4、MMP-2和MMP-9的mRNA表達(dá)均明顯減少(P<0.05)；與aliskiren中劑量組比較，低劑量組腎素、TLR4、MMP-2和MMP-9的mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.05)，而高劑量組腎素、TLR4、MMP-2和MMP-9的mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)，說明aliskiren呈明顯濃度依賴性抑制LPS誘導(dǎo)HUVECs腎素、TLR4、MMP-2和MMP-9的mRNA表達(dá)，見圖8。

8Aliskiren對(duì)LPS誘導(dǎo)HUVECs腎素、TLR4、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較，LPS模型組腎素、TLR4、MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)均顯著升高；與LPS模型組比較，aliskiren低、中和高劑量各組腎素、TLR4、MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)均明顯減少(P<0.05)；與aliskiren中劑量組比較，低劑量組腎素、TLR4、MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)，而高劑量組腎素、TLR4、MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，說明aliskiren呈明顯濃度依賴性抑制LPS誘導(dǎo)HUVECs腎素、TLR4、MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)，見圖9。

討　　論

AS是一種嚴(yán)重威脅人類健康的常見病、多發(fā)病。研究認(rèn)為AS是由多種致病因素引起的以內(nèi)皮細(xì)胞損傷為基礎(chǔ)、以血管的慢性炎癥為特征的病理過程。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)由一系列酶、肽類、激素及其受體所組成，在AS發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。腎素是腎素原在激活酶催化作用下生成的一種蛋白酶，是血管緊張素(angiotensin，Ang)II上游的RAS成員。研究發(fā)現(xiàn)腎素基因高表達(dá)能夠促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。腎素高表達(dá)，通過激活RAS使Ang I和Ang II生成增多，而Ang原生成減少，進(jìn)而使血管炎癥因子、黏附分子的基因和蛋白表達(dá)增加；增多的Ang II進(jìn)一步加重內(nèi)皮細(xì)胞損傷、平滑肌細(xì)胞增殖等的炎癥反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)腎素能夠通過TLR4途徑促進(jìn)HUVECs炎癥因子的分泌與表達(dá)，LPS誘導(dǎo)的HUVECs腎素表達(dá)明顯增高，TLR4及炎癥因子表達(dá)明顯增高，提示LPS誘導(dǎo)的HUVECs炎癥反應(yīng)可能是上調(diào)腎素高表達(dá)后，通過TLR4途徑促進(jìn)HUVECs炎癥因子的分泌與表達(dá)。

Figure 8.The effect of aliskiren on the mRNA expression of renin, TLR4, MMP-2 and MMP-9 in LPS-induced HUVECs. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsLPS group;△P<0.05vsMD group.

圖8Aliskiren對(duì)LPS誘導(dǎo)HUVECs腎素、TLR4、MMP-2和MMP-9 mRNA表達(dá)的影響

AS不穩(wěn)定斑塊形成，甚至斑塊破裂，是引發(fā)急性冠狀動(dòng)脈綜合癥等臨床嚴(yán)重并發(fā)癥的主要病理學(xué)基礎(chǔ)[9]。而不穩(wěn)定斑塊的重要特征之一就是斑塊內(nèi)血管新生。血管新生是通過血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，從先前存在的血管處以芽生或者非芽生的形式形成新的血管的過程，主要分為內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、管腔形成3個(gè)階段。斑塊內(nèi)的新生血管無平滑肌支持，管壁薄弱，易于引起斑塊不穩(wěn)定、斑塊內(nèi)出血,甚至斑塊破裂。Moulton 等[10]的研究證實(shí)，血管生成抑制藥物可以抑制動(dòng)脈粥樣硬化病灶內(nèi)新生血管的形成，穩(wěn)定斑塊、減緩斑塊的發(fā)展。Aliskiren是新發(fā)現(xiàn)的腎素抑制劑，在動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病的治療中具有重要意義[11-12]。HUVECs 是研究血管新生的主要細(xì)胞，故本研究通過觀察aliskiren對(duì)HUVECs的增殖、遷移及管腔形成能力來評(píng)價(jià)aliskiren對(duì)新生血管形成的抑制作用。研究結(jié)果表明，aliskiren呈濃度依賴性抑制HUVECs增殖、遷移及新生血管形成。

Ross[13]認(rèn)為，炎癥反應(yīng)存在于動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的每一個(gè)環(huán)節(jié)。研究表明，炎癥反應(yīng)也是引起動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)血管新生的主要原因之一。

Figure 9.The effect of aliskiren on the protein expression of renin, TLR4, MMP-2 and MMP-9 in LPS-induced HUVECs. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsLPS group;△P<0.05vsMD group.

圖9Aliskiren對(duì)LPS誘導(dǎo)HUVECs腎素、TLR4、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的影響

LPS是實(shí)驗(yàn)中最常用的經(jīng)典炎癥刺激因子，可通過激活TLR4傳導(dǎo)途徑激活內(nèi)皮細(xì)胞，介導(dǎo)趨化因子、炎癥因子等的表達(dá)。本研究以LPS作為炎癥刺激物，觀察TLR4傳導(dǎo)途徑激活對(duì)新生血管形成的影響，探討aliskiren抑制新生血管形成的機(jī)制。研究結(jié)果表明，aliskiren呈濃度依賴性抑制TLR4表達(dá)及TNF-α、ICAM-1和MCP-1等炎癥因子的分泌，說明aliskiren可能通過抑制TLR4傳導(dǎo)途徑激活減輕炎癥反應(yīng)，從而抑制新生血管的形成，穩(wěn)定斑塊。

斑塊內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的代謝情況是影響動(dòng)脈粥樣斑塊穩(wěn)定性的又一個(gè)重要因素。基質(zhì)金屬蛋白酶家族是影響基質(zhì)分解的關(guān)鍵因子。AS病變時(shí)，被激活的內(nèi)皮細(xì)胞以及單核-巨噬細(xì)胞均可分泌MMP-2、MMP-9及VEGF等，刺激新生血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移而加快血管新生，另一方面，基質(zhì)金屬蛋白酶通過降解基底膜和重塑細(xì)胞外基質(zhì)使內(nèi)皮細(xì)胞從原有血管遷移到外周形成新生血管[14]。有研究將HUVECs培養(yǎng)于基膜樣物質(zhì)上時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞很快排成直線，圍成管狀，用明膠酶譜分析，上清液中檢測(cè)出大量活化的MMP-2 和MMP-9，說明MMP-2、MMP-9與新生血管的形成有密切的關(guān)系[15]。本研究結(jié)果表明，aliskiren呈濃度依賴性抑制MMP-2、MMP-9的mRNA及蛋白的表達(dá)，說明aliskiren可能通過抑制MMP-2、MMP-9的表達(dá)，抑制新生血管的形成，穩(wěn)定斑塊。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)腎素在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中的可能作用，aliskiren通過下調(diào)腎素表達(dá)抑制TLR4途徑介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及MMP的生成，抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)新生血管的形成，增強(qiáng)斑塊的穩(wěn)定性，為動(dòng)脈粥樣硬化的防治提供新的治療靶點(diǎn)和理論依據(jù)。

[1]Liu XQ, Mao Y, Wang B, et al. Specific matrix metalloproteinases play different roles in intraplaque angiogenesis and plaque instability in rabbits[J]. PLoS One, 2014, 9(9):e107851.

[2]Meltzer PS. Cancer genomics: small RNAs with big impacts[J]. Nature, 2005, 435(7043):745-746.

[3]Bartel DP. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function[J]. Cell, 2004, 116(2):281-297.

[4]Vink A, Schoneveld AH, van der Meer JJ, et al.Invivoevidence for a role of toll-like receptor 4 in the development of intimal lesions[J]. Circulation, 2002, 106(15):1985-1990.

[5]Okamura Y, Watari M, Jerud ES, et al. The extra domain A of fibronectin activates Toll-like receptor 4[J]. J Biol Chem, 2001, 276(13):10229-10233.

[6]Johnson JL, Baker AH, Oka K, et al. Suppression of atherosclerotic plaque progression and instability by tissue inhibitor of metalloproteinase-2: involvement of macrophage migration and apoptosis[J]. Circulation, 2006, 113(20):2435-2444.

[7]Celletti FL, Hilfiker PR, Ghafouri P, et al. Effect of human recombinant vascular endothelial growth factor165on progression of atherosclerotic plaque[J]. J Am Coll Cardiol, 2001, 37(8): 2126-2130．

[8]Higashikuni Y, Takaoka M, Iwata H, et al. Aliskiren in combination with valsartan exerts synergistic protective effects against ventricular remodeling after myocardial infarction in mice[J]. Hypertens Res, 2012, 35(1):62-69.

[9]Cheng C, Chrifi I, Pasterkamp G, et al. Biological mechanisms of microvessel formation in advanced atherosclerosis: the big five[J]. Trends Cardiovasc Med, 2013, 23(5):153-164.

[10]Moulton KS, Olsen BR, Sonn S, et al. Loss of collagen XVIII enhances neovascularization and vascular permeabi-lity in atherosclerosis[J]. Circulation, 2004, 110(10):1330-1336.

[11]Nussberger J, Aubert JF, Bouzourene K, et al. Renin inhibition by aliskiren prevents atheroscleresis progression: comparison with irbesartan, atenolol, and amlodipine[J]. Hypertension, 2008, 51(3):1306-1311.

[12]Yamamoto E, Kataoka K, Dong YF, et al. Aliskiren enhances the protective effects of valsaltan against cardiovascular and renal injury in endothelial nitric oxide synthase-deficient mice[J]. Hypertension, 2009, 54(3): 633-638.

[13]Ross R. Atherosclerosis: an inflammatory disease[J]. New Engl J Med, 1999, 340(2):115-126.

[14]Raffetto JD, Khalil RA. Matrix metalloproteinases and their inhibitors in vascular remodeling and vascular disease[J]. Biochem Pharmacol, 2008,75(2):346-359.

[15]Cho JS, Kang JH, Um JY, et al. Lipopolysaccharide induces pro-inflammatory cytokines and MMP production via TLR4 in nasal polyp-derived fibroblast and organ culture[J].PLoS One, 2004, 9(11):e90683.

(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)

Inhibitory effect of aliskiren on LPS-induced angiogenesis of HUVECs

LI Zhao-xin1, LIU Jiang-yue2, WANG Qi-xin1

(1TheAffiliatedHospitalofQingdaoUniversity,Qingdao266000,China;2DepartmentofPathophysiology,WeifangMedicalCollege,Weifang261053,China.E-mail:lilyzx@163.com)

AIM: To investigate the inhibitory effect of aliskiren on the angiogenesis of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) induced by lipopolysaccharide (LPS) and to explore its possible mechanism. METHODS: HUVECs were cultured and randomly divided into blank group and renin group. The levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) in the culture supernatant were detected by ELISA. The protein levels of Toll-like receptor 4 (TLR4) and ICAM-1 in the HUVECs were determined by Western blot. HUVECs were cultured and randomly divided into control group, LPS group, low-dose (1 μmol/L) aliskiren group, middle-dose (10 μmol/L) aliskiren group and high-dose (100 μmol/L) aliskiren group. The proliferation of HUVECs was detected by MTT and BrdU assays. The mobility of HUVECs was measured by Transwell assay. The formation of the vessels was judged by observing the formation of the luminal structure by HUVECs in Matrigel. The levels of TNF-α, ICAM-1 and monocyte chemotactic protein 1 (MCP-1) in the culture supernatant were measured by ELISA. The expression of renin, TLR4, matrix me-talloproteinases-2 (MMP-2) and matrix metalloproteinases-9 (MMP-9) at mRNA and protein levels in the HUVECs was determined by RT-PCR and Western blot. RESULTS: Renin stimulated the expression of inflammatory factors and TLR4 in the HUVECs. Aliskiren inhibited the growth, migration and angiogenesis of HUVECs in a dose-dependent manner, decreased the levels of TNF-α, ICAM-1 and MCP-1 and the expression of renin, MMP-2 and MMP-9, and inhibited TLR4 expression (P<0.05).CONCLUSION: Aliskiren inhibits LPS-induced angiogenesis of HUVECs, which may be related to the down-regulation of renin expression, the inhibition of TLR4-mediated inflammatory reaction, and the formation of MMP-9 and MMP-2.

Aliskiren; Angiogenesis; Inflammation; Toll-like receptor 4; Renin

1000- 4718(2016)04- 0602- 08

2015- 07- 27

2016- 03- 14

山東省中醫(yī)藥管理局資助項(xiàng)目(No.2013-237)； 青島市民生計(jì)劃項(xiàng)目(No.13-1-4-139-jch)

Tel: 0532-82911619； E-mail: lilyzx@163.com

R972.6; R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.04.005

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net