落新婦苷對高糖刺激的血管內皮細胞SDF-1α表達的影響*

王可可， 鄧雅妍，　賴建鴻，　張幫艷，　黃　琛，　申志華，　姜漢國, 2，　揭　偉,2△

(1廣東醫學院病理學系，廣東 湛江 524023； 2廣東醫學院附屬醫院病理診斷與研究中心，廣東 湛江 524001；3廣東醫學院基礎醫學院病理生理教研室，廣東 湛江 524023； 4肇慶市第一人民醫院兒科，廣東 肇慶 526021)

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落新婦苷對高糖刺激的血管內皮細胞SDF-1α表達的影響*

王可可1,2▲， 鄧雅妍1,4▲，賴建鴻1，張幫艷1，黃琛1，申志華3，姜漢國1, 2，揭偉1,2△

(1廣東醫學院病理學系，廣東 湛江 524023；2廣東醫學院附屬醫院病理診斷與研究中心，廣東 湛江 524001；3廣東醫學院基礎醫學院病理生理教研室，廣東 湛江 524023；4肇慶市第一人民醫院兒科，廣東 肇慶 526021)

目的： 分析落新婦苷對高糖刺激的血管內皮細胞間質細胞衍生因子1α(SDF-1α)表達的影響。方法: SD大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素后誘導成急性糖尿病模型，采用硫代巴比妥酸法測量血漿丙二醛(MDA)濃度，采用紫外分光光度法檢測血漿H2O2濃度，采用免疫熒光檢測大鼠胸主動脈內皮細胞中SDF-1α的表達。人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)經高糖刺激后，用real-time PCR、ELISA和免疫熒光檢測SDF-1α的表達，流式細胞術觀察細胞周期分布情況，免疫熒光檢測p65的表達和細胞內定位。結果: 糖尿病大鼠血漿MDA和H2O2水平均高于正常對照組，其胸主動脈內皮細胞SDF-1α的表達較正常組減弱；落新婦苷能降低糖尿病大鼠血漿MDA及H2O2的水平并增加胸主動脈內皮細胞SDF-1α的表達。體外高糖刺激呈濃度和時間依賴性減少HUVECs中SDF-1α表達，落新婦苷能一定程度地恢復SDF-1α表達。高糖刺激增加HUVECs S期比例，而落新婦苷減少其S期分布。高糖刺激HUVECs中p65蛋白核轉位，落新婦苷抑制高糖誘導的p65核轉位。結論: 落新婦苷能增加高糖刺激下內皮細胞表達SDF-1α，減少高糖狀態下的氧化應激和NF-κB的活化。

高糖； 落新婦苷； 間質細胞衍生因子1α； 人臍靜脈內皮細胞

糖尿病是危害人群健康的常見病、多發病。廣東省是中國的高發區之一，發病率超過全國平均水平，且年輕化趨勢明顯[1-2]。糖尿病的一個主要特征就是高血糖癥。在長期的高糖刺激下，血管內皮細胞容易受到損傷。而血管內皮細胞內有關信號的活化，進而導致內皮細胞出現分泌細胞因子功能紊亂是糖尿病血管并發癥最早期的變化之一。

間質細胞衍生因子1α(stromal cell-derived factor-1α，SDF-1α)主要是由內皮細胞、血管平滑肌細胞等分泌的一種小分子蛋白質。作為一種配體，在具有CXCR4或CCR7受體的細胞遷移及歸巢中發揮重要的作用[3]。研究表明，循環SDF-1α表達的減少是糖尿病的重要分子事件[4]。SDF-1α表達減少，將不能保護內皮細胞抗損傷因子，因而內皮細胞易出現凋亡；同時低水平的SDF-1α對循環內皮祖細胞的趨化作用減弱，不能及時修復損傷的內皮細胞。因此，如能改善糖尿病時SDF-1α水平，理論上對糖尿病血管并發癥將起到延緩作用。

高糖刺激容易在體液中形成大量活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，繼而誘導細胞內重要炎癥信號通路如p38 MAPK和NF-κB的激活。落新婦苷(astilbin,Ast)是從土茯苓中分離得到的二氫黃酮醇，具有利尿、鎮痛、抗炎、抑制免疫排斥、減輕缺血再灌注損傷及抑制動脈粥樣硬化發生發展等方面的作用，口服效果好且無明顯毒副作用[5-7]。在糖尿病腎病及缺血再灌注肝損傷中起到明顯的治療作用[8-10]。目前國內外均未見有關Ast對SDF-1α表達影響的報道。本項目旨在分析Ast對高糖刺激的血管內皮細胞中SDF-1α表達的影響，為臨床糖尿病血管病并發癥的防治提供新的科學依據。

材　料　和　方　法

1主要抗體及試劑

羊抗鼠SDF-1α及p65的Ⅰ抗(Santa Cruz)；熒光標記Ⅱ抗(武漢三鷹)；落新婦苷(成都曼斯特公司)；鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)購自Sigma；SDF-1α ELISA試劑盒(R&D)；RNA抽提試劑盒、RT試劑盒及定量PCR試劑盒(TOYOBO)；PCR引物由上海生工公司合成；DMEM培養基、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自HyClone；青霉素及鏈霉素雙抗(北京博奧森)；H2O2及丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒(南京建成生物公司)；D-葡萄糖及D-甘露醇(mannitol)為國產分析純試劑。

2實驗動物

雄性SD大鼠22只，體重180～210 g。由廣東醫學院實驗動物中心提供，動物使用許可證號為SYXK(粵)2008-0007。

3主要方法

3.1急性糖尿病大鼠模型復制及處理大鼠分組如下：(1)正常血糖(normoglycemia，NG)組：腹腔一次性注射檸檬酸鹽水后正常飲食飲水(n=7)；(2)高糖血癥(hyperglycemia，HG)組：腹腔一次性注射STZ(pH 4.5，0.1%枸櫞酸緩沖液新鮮配制，50 mg/kg)后正常飲食飲水，2周后腹腔注射生理鹽水(n=10)；(3) Ast干預組：55 mg/kg腹腔一次性注射STZ，2周后再每天腹腔給予Ast(20 mg·kg-1·d-1，生理鹽水溶解)，正常飲食飲水(n=5)。各組大鼠在給予STZ 72 h后采用斷尾取血測血糖值，連續測3 d，以血糖水平≥16.7為糖尿病建模成功。4周時處死大鼠，抽取心室血，分離血漿，分別用硫代巴比妥酸法測量MDA和紫外分光光度法檢測H2O2濃度， 具體參考試劑盒說明書進行。胸主動脈冰凍切片后用于免疫熒光檢測內皮細胞中SDF-1α的表達。

3.2細胞培養及分組人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)購自中科院上海細胞所。HUVECs以DMEM培養基(含10% FBS、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)常規培養，經免疫組化檢測細胞CD31表達以鑒定，細胞匯合后經0.25%胰酶消化，1∶3傳代培養，取對數生長期細胞用于相關實驗。分組：正常糖濃度(normal glucose，NG)組，DMEM基礎培養液含10% FBS，5.5 mmol/L D-葡萄糖；高糖(high glucose，HG)組，DMEM基礎培養液含10% FBS，12.5、25或50 mmol/L D-葡萄糖；滲透壓對照(Mtol)組，DMEM基礎培養液含10% FBS，25 mmol/L D-甘露醇；高糖+落新婦苷(HG+Ast)組，DMEM基礎培養液含10% FBS，25 mmol/L D-葡萄糖及25 μmol/L落新婦苷。HUVECs以0.5% FBS的DMEM培養基培養12 h同步化后再進行上述分組處理，于預訂時點分別收獲細胞與上清用于相關實驗。

3.3Real-time PCR檢測細胞SDF-1α的mRNA表達TRIzol試劑提取各組細胞總RNA，取1 μg RNA反轉錄為cDNA，采用real-time PCR檢測SDF-1α的mRNA表達。PCR引物序列如下：SDF-1α正義鏈為5’-GAT TCT TCG AAA GCC ATG TTG-3’，SDF-1反義鏈為5’-CAC TTT AGC TTC GGG TCA ATG-3’；β-actin正義鏈為5’-TGA CGT GGA CAT CCG CAA AG-3’，β-actin反義鏈為5’-CTG GAA GGT GGA CAG CGA GG-3’。采用LightCycler 480 循環儀(Roche)進行PCR循環，總反應體系20 μL，包括10 μL SYBR Green I PCR Master Mix, 0.4 μL 正義鏈引物 (10 μmol/L), 0.4 μL 反義鏈引物 (10 μmol/L), 2 μL cDNA 和 7.2 μL dH2O。PCR 擴增條件為95 °C 5 min;95 °C 15 s,60 °C 60 s,共45個循環。目標基因的表達量用2-ΔΔCt法計算。

3.4ELISA檢測細胞培養液上清中SDF-1α蛋白的表達各組細胞培養液上清經4 ℃離心后棄去沉渣，取上清用于ELISA測定，具體過程參照試劑盒說明書進行。各組測定A值經標準曲線換算得到濃度值，根據各樣本收集的細胞數值進行標準化，結果以μg/L(每104細胞)表示。每組重復3孔。

3.5免疫熒光檢測SDF-1α及p65的表達及細胞內定位間接免疫熒光法檢測大鼠主動脈冰凍切片內 SDF-1α蛋白的表達，檢測HUVECs中SDF-1α及p65蛋白的表達及細胞內定位。細胞爬片及主動脈冰凍切片經0.5% BSA-PBS 37 ℃孵育30 min，PBS洗滌，滴加相應 I 抗，4 ℃冰箱過夜孵育，PBS洗滌，滴加熒光Ⅱ抗后37 ℃避光孵育30 min，DAPI復染細胞核，PBS洗滌后甘油明膠封片，激光共聚焦顯微鏡(Leica)下觀察并拍照。計數6個典型中倍視野，統計p65核表達細胞的百分率。

3.6細胞周期分析上述各組細胞經0.25%胰酶消化，PBS洗滌，75%冷乙醇過夜固定，PBS洗滌后重懸，加入PI和 RNaseA，37 ℃ 溫浴30 min，流式細胞儀(BD)測定細胞周期分布。

4統計學處理

數據以均數±標準誤(Mean±SEM)表示，用GraphPad Prism 5軟件行單因素方差(one-way ANOVA)分析，兩兩比較采用Student-Newman-Keuls檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結　　果

1Ast降低糖尿病大鼠氧化應激并增加血管內皮細胞中SDF-1α的表達

用STZ誘導的急性糖尿病大鼠血漿中H2O2和MAD均高于正常對照組，而Ast治療組中H2O2和MAD濃度較糖尿病組下降，差異有統計學顯著性。同時，免疫熒光結果顯示糖尿病組其胸主動脈內皮細胞中SDF-1α表達的熒光信號較正常對照組弱，而Ast治療組熒光信號得到增強，見圖1。

Figure 1.Astilbin (Ast) decreased plasma H2O2and MDA levels and increased SDF-1α expression in diabetic rats. NG: normoglycemia; HG: hyperglycemia. Mean±SEM.n=5～10.**P<0.01vsNG;##P<0.01vsHG.

圖1落新婦苷降低糖尿病大鼠血漿ROS,增加主動脈內皮細胞SDF-1α表達

2高糖刺激呈時間及濃度依賴方式下調內皮細胞中SDF-1α mRNA水平

體外用25 mmol/L HG刺激HUEVCs 48 h后其SDF-1α的mRNA水平明顯較正常組顯著下降，而滲透性對照組中SDF-1α的mRNA水平相對NG組亦有一定程度下降，初步提示HG刺激下調SDF-1α的mRNA不僅與高滲透壓有關，又與高糖刺激有關。進一步發現，這種下降呈現葡萄糖濃度依賴和刺激時間依賴的方式,見圖2。

3Ast逆轉高糖刺激抑制的HUEVCs中SDF-1α的表達

體外實驗證實，Ast能上調HG導致的SDF-1α mRNA水平的抑制，見圖2；其次，ELISA結果顯示，Ast能升高HG組細胞培養上清中分泌的SDF-1α蛋白；最后，免疫熒光結果證實Ast增加HG組內皮細胞胞漿中SDF-1α蛋白的熒光信號強度，見圖3。

Figure 2.The changes of SDF-1α mRNA levels in HUVECs assessed by real-time RT-PCR. NG: normal glucose (5.5 mmol/L); HG: high glucose (25 mmol/L); Mtol: mannitol (25 mmol/L; osmotic control); Ast: astilbin. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vsNG;#P<0.05,##P<0.01vsHG.

圖2Real-time PCR檢測HUVECs中SDF-1α的mRNA水平

4Ast對高糖條件下HUVECs細胞周期的影響

與NG組比較，HG刺激顯著下調HUVECs細胞周期中G1期比值(P<0.01)和上調S期比值(P<0.01)，而Ast刺激減少了HG組的S期分布(P<0.05)，而G2/M期在NG、HG及Ast組之間差異不明顯。與NG組比較，Mtol刺激輕度增加了G1期并輕度減少了S期分布，見圖4。

5Ast抑制HUVECs中高糖介導的NF-κB活化

在NG條件下，HUVECs胞質中有少量p65蛋白表達，未見明顯p65核定位；單純高滲透壓刺激僅見少許細胞存在p65核定位信號，而高糖刺激48 h后p65核定位信號顯著增加；在應用Ast后減少了高糖誘導的p65核定位，見圖5、6。

討　　論

血管內皮細胞功能受損是糖尿病血管并發癥的早期分子事件，而引起血管內皮功能紊亂與高糖條件下產生的ROS有關。ROS是機體氧化反應中產生的有害化合物，具有強氧化性。高血糖時ROS的大量生成導致血液中的氧化應激反應的概率急劇上升，進而使各類型的功能蛋白質變性，形成大量的晚期糖基化終末產物。同時ROS是細胞炎癥基因如p38、NF-κB等激活的重要誘因。因此，逆轉內皮的功能障礙能有效降低患糖尿病心血管并發癥的風險。本研究表明，體內給予落新婦苷能緩解糖尿病大鼠氧化應激因子如H2O2和MDA的產生，同時落新婦苷還可以促進高糖條件下血管內皮細胞重要細胞因子SDF-1α的產生，研究結果初步提示落新婦苷在糖尿病血管內皮功能紊亂的修復中具有一定的作用。

Figure 3.SDF-1α protein in HUVECs and their supernatants. NG: normal glucose; HG: high glucose; Mtol: mannitol (osmotic control); Ast: astilbin. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vsNG and Mtol;#P<0.05vsHG.

圖3HUVECs及其培養液上清中SDF-1α蛋白的表達情況

Figure 4.The cell cycle distribution in HUVECs. NG: normal glucose (5.5 mmol/L); HG: high glucose (25 mmol/L); Mtol: mannitol (25 mmol/L; osmotic control); Ast: astilbin (25 μmol/L). Mean±SEM.n=3.**P<0.01vsNG and Mtol;#P<0.05,##P<0.01vsHG.

圖4HUVECs細胞周期的變化

Figure 5.The expression and cellular location of p65 in HUVECs. Arrows indicate nuclear location. NG: normal glucose (5.5 mmol/L); HG: high glucose (25 mmol/L); Mtol: mannitol (25 mmol/L; osmotic control); Ast: astilbin (25 μmol/L).

圖5免疫熒光檢測HUVECs中p65蛋白的表達及細胞內定位

Figure 6.The percentage of nuclear localization of p65 in HUVECs. NG: normal glucose; HG: high glucose; Mtol: mannitol (osmotic control); Ast: astilbin. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vsNG and Mtol;#P<0.05vsHG.

圖6HUVECs中p65蛋白核定位細胞百分比

SDF-1α是一種強烈的趨化因子，循環血液中SDF-1α水平與內皮祖細胞數量呈正相關[4]。糖尿病患者SDF-1α與HbA1c、低密度脂蛋白負相關，提示改善血糖、血脂狀況可能升高外周血中SDF-1α水平，進而改善內皮功能。動脈粥樣化發生的始動環節是因為諸多危險因素造成動脈內皮損傷，而這些環節受趨化因子和黏附因子的調控。糖尿病早期，由于內皮細胞功能紊亂，血液中SDF-1α水平下降，對內皮祖細胞的趨化能力不足因而不能及時修復受損的內皮。因此，早期提高血液中SDF-1α水平對糖尿病血管并發癥的防治具有積極意義。當糖尿病發展至合并動脈粥樣硬化的時期，外周血中SDF-1α水平下降，血管壁上的SDF-1α的濃度表達卻增加，這勢必提高了血管壁與血中SDF-1α的濃度梯度，很可能因此而提高了SDF-1α趨化單核細胞侵入內皮下和誘導平滑肌細胞的遷移，從而加速動脈粥樣硬化進展[11]。因此，糖尿病晚期應恢復血管壁與血液中SDF-1α水平的正常比值。本研究發現，急性糖尿病大鼠胸主動脈內皮細胞SDF-1α較正常對照組下降，但我們未進一步分析胸主動脈壁與循環血液中SDF-1α水平比值的改變。SDF-1α在糖尿病性動脈粥樣硬化并發癥的發生發展中到底是起保護還是加速作用，在不同時期所扮演的角色與作用機制尚待進一步研究。

落新婦苷是一種二氫黃酮醇。黃酮類藥物能通過誘導下游基因表達，以達到影響細胞生物學功能，抑制或殺滅細菌菌株，抑制重要的病毒酶、逆轉錄酶和蛋白酶等[12]。落新婦苷可通過調節IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-α、MCP-1 和 COX-2等炎癥因子而發揮抗炎作用[13-14]。另有研究顯示，落新婦苷可通過抑制葡萄糖-6-磷酸酶活性而調節葡萄糖的合成[15]。我們早期的研究顯示落新婦苷具有抗平滑肌細胞增殖的作用[16]。此外，落新婦苷通過抗氧化應激在糖尿病腎病及缺血再灌注肝損傷中起到明顯的恢復作用[8-10]。在本實驗顯示落新婦苷能明顯降低高血糖條件下的血漿中的自由基數量，顯示了很好的抗氧化作用，與Petacci等[17]的報道相一致。此外，我們的研究首次發現落新婦苷可拮抗糖尿病高糖對血管內皮細胞SDF-1α因子的損傷。

NF-κB是重要的轉錄因子，在炎癥損傷、氧化應激、缺血再灌注損傷等反應中具有關鍵性作用。p65作為其活性亞基，其核定位的增加是判斷NF-κB信號活化的重要證據。本研究顯示，與正常對照相比，高糖刺激顯著活化了HUVECs中NF-κB信號，表現為p65蛋白核定位信號的顯著增加，而落新婦苷明顯減低了高糖刺激導致的p65蛋白的核定位，提示落新婦苷具有抑制高糖誘導的NF-κB信號活化作用。這與我們早期研究發現落新婦苷能抑制血管緊張素Ⅱ活化平滑肌細胞中NF-κB信號結果相似[16]，也一定程度上支持了Diao等[18]發現落新婦苷能通過阻斷高遷移率族蛋白B1而抑制糖尿病大鼠心肌組織中NF-κB磷酸化的結果的報道。

NF-κB信號的活化可以通過經典途徑和非經典途徑來實現。糖尿病或高糖可通過產生ROS而活化NF-κB信號[19]，但NF-κB信號與SDF-1α的關系較為復雜。一方面外源性SDF-1α可以活化NF-κB信號[20]，提示SDF-1α是NF-κB信號的上游；另一方面，非經典途徑活化的NF-κB信號可以調節包括SDF-1α基因在內的少部分靶基因的表達[21-22]，提示SDF-1α是NF-κB下游靶基因。非常有趣的是，經典途徑活化的NF-κB信號可以抑制非經典途徑活化NF-κB信號介導的SDF-1α的表達[23]。因此，很可能糖尿病時血管內皮細胞中存在高糖→ROS→非經典NF-κB信號→SDF-1α→經典NF-κB信號→抑制非經典NF-κB的信號反饋環路，而落新婦苷可能通過抗氧化應激減弱糖尿病時經典NF-κB信號的活化而弱化了對非經典NF-κB信號活化介導的SDF-1α表達的負性調控，因而最終表現為SDF-1α表達的增加，但這一假設仍需要進一步的探討。

總之，本研究結果顯示在高糖應激的條件下，機體會產生大量的ROS并抑制血管內皮細胞中SDF-1α的表達，落新婦苷可以增加高糖條件下血管內皮細胞表達SDF-1α，減少ROS釋放和抑制NF-κB信號活化。落新婦苷在糖尿病血管并發癥防治上的確切的藥用價值及其作用機制仍需更多的深入研究。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Effects of astilbin on expression of SDF-1α in high glucose-treated vascular endothelial cells

WANG Ke-ke1, 2, DENG Ya-yan1, 4, LAI Jian-hong1, ZHANG Bang-yan1, HUANG Chen1, SHEN Zhi-hua3, JIANG Han-guo1, 2, JIE Wei1, 2

(1DepartmentofPathology,GuangdongMedicalUniversity,Zhanjiang524023,China;2PathologicalDiagnosisandResearchCentre,AffiliatedHospitalofGuangdongMedicalUniversity,Zhanjiang524001,China;3DepartmentofPathophy-siology,SchoolofBasicMedicalScience,GuangdongMedicalUniversity,Zhanjiang524023,China;4DepartmentofPediatrics,FirstPeople’sHospitalofZhaoqingCity,Zhaoqing526021,China.E-mail:wei.jie@gdmc.edu.cn)

AIM: To explore the effects of astilbin on high glucose-induced stromal cell-derived factor-1α (SDF-1α) expression in vascular endothelial cells.METHODS: The acute diabetic SD rats were established by intraperitoneally injection of streptozotocin. The plasma malondialdehyde (MDA) and H2O2levels were measured by thiobarbituric acid method and UV spectrophotometry, respectively. The SDF-1α expression in the endothelial cells of thoracic aorta was assessed by immunofluorescent staining. Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were treated with high glucose. The expression of SDF-1α in HUVECs was detected by real-time PCR, ELISA and immunofluorescence. Flow cytometry was adopted to analyze the cell cycle distribution. The expression and intracellular localization of p65 was assessed by immunofluorescent staining.RESULTS: The plasma levels of MDA and H2O2in diabetic rats were higher than those in the normal controls. The expression of SDF-1α in the aortic endothelial cells of diabetic rats was decreased as compared with the normal controls. Astilbin alleviated plasma MDA and H2O2levels in the diabetic rats and increased SDF-1α in the thoracic aorta endothelial cells.Invitrostimulation with high glucose significantly reduced the expression of SDF-1α in the HUVECs, which was restored by astilbin. High glucose stimulation increased the proportion of S phase in the HUVECs, and astilbin reduced S phase proportion. High glucose increased p65 nuclear translocation in the HUVECs, which was attenuated by astilbin treatment. CONCLUSION: Astilbin increases the expression of SDF-1α and reduces oxidative stress and NF-κB activation in high glucose-stimulated vascular endothelial cells.

High glucose; Astilbin; Stromal cell-derived factor-1α; Human umbilical vein endothelial cells

1000- 4718(2016)04- 0610- 08

2015- 10- 13

2015- 12- 14

廣東省大學生創新訓練項目(No. 1057112014);廣東醫學院大學生創新實驗項目(No. 2011ZZZF002);國家自然科學基金資助項目(No. 81170121)

Tel: 0759-2388584; E-mail: wei.jie@gdmc.edu.cn

R363; R587.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.04.006

雜志網址： http://www.cjpp.net

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