Perifosine通過抑制PI3K/Akt途徑調節人膠質瘤U251細胞增殖、凋亡與自噬*

李若彤，　王　麗，　曹　亭，　陳圣文，　費洪榮，　王鳳澤△

(1泰山醫學院基礎醫學院，山東 泰安 271000； 泰山醫學院 2生命科學學院， 3藥學院,山東 泰安 271016)

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Perifosine通過抑制PI3K/Akt途徑調節人膠質瘤U251細胞增殖、凋亡與自噬*

李若彤1，王麗2，曹亭2，陳圣文2，費洪榮3，王鳳澤2△

(1泰山醫學院基礎醫學院，山東 泰安 271000； 泰山醫學院2生命科學學院，3藥學院,山東 泰安 271016)

目的： 探討Akt激酶抑制劑perifosine對人膠質瘤U251細胞凋亡、細胞周期和自噬的影響，確定perifosine誘導的細胞自噬與其促進膠質瘤細胞凋亡的相關性。方法：Perifosine處理U251細胞后，采用MTT法檢測細胞活力；流式細胞術分析perifosine對U251細胞周期的影響；Annexin V-FITC/PI雙標法檢測perifosine對膠質瘤細胞凋亡的作用；免疫印跡法檢測細胞內P21、P27和cyclin B1等細胞周期調控相關蛋白以及caspase-9、PARP等細胞凋亡相關蛋白的表達水平；通過觀察細胞內自噬標志分子LC3-II的分布與表達來確定perifosine對自噬的誘導作用。結果：Perifosine劑量依賴性地抑制U251細胞活力，能夠通過抑制cyclin B1的表達而阻滯膠質瘤細胞周期于G2期。Perifosine促進了U251細胞內caspase-9和PARP的剪切，抑制survivin表達，從而誘導膠質瘤細胞發生凋亡。同時，perifosine與自噬抑制劑氯喹聯用后，U251細胞凋亡數量明顯增加。結論：Perifosine能夠抑制U251細胞的增殖，同時誘導細胞發生凋亡與自噬，抑制自噬促進了perifosine誘導的膠質瘤細胞凋亡。

Perifosine； Akt； 膠質瘤； 細胞凋亡； 自噬

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信號通路廣泛參與調控細胞的增殖、存活和分化等生理病理活動。由于11該信號途徑上游抑制因子PTEN 的突變，或者PI3K基因的擴增及Akt 的過度活化，導致PI3K/Akt 信號通路在人類腫瘤譜中廣泛失調[1-2]。因此，抑制該通路可能成為惡性腫瘤治療的有效手段。Perifosine是新型的烷基磷脂類化合物，主要通過調節PI3K/Akt 和MAPK 等信號通路發揮抗腫瘤作用[3-4]。我們在前期研究發現perifosine能夠抑制胃癌細胞SGC-7901的增殖并誘導其凋亡，表現出良好的體外抗腫瘤活性[5]。本研究以人膠質瘤細胞系U251為實驗材料，探討perifosine抑制細胞增殖的分子機理，在觀察perifosine對U251細胞凋亡和自噬影響的同時，分析perifosine誘導細胞自噬與其促進U251細胞凋亡的相關性。

材　料　和　方　法

1實驗材料

Perifosine購自Selleck Chemicals；胎牛血清購自Gibco；MTT、氯喹(chloroquine，CQ)、碘化丙啶(propidium iodine，PI)、β-actin抗體和LC3-Ⅱ抗體購自Sigma；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自BD Biosciences；Akt抗體、caspase-9 抗體、PARP抗體、survivin抗體和Cdc2抗體購自CST；CyclinB1抗體購自Santa Cruz；P21抗體和P27抗體購自BD Biosciences；p-Akt 抗體購自Abcam；II 抗均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。ECL化學發光檢測試劑盒購自Thermo。

2實驗方法

2.1細胞培養人膠質瘤細胞株U251購自上海中科院細胞庫，在37 ℃、5% CO2條件下，用含有10% 胎牛血清的DMEM 培養基培養。

2.2MTT實驗檢測細胞活力胰酶消化U251細胞并接種于96孔板中，過夜培養后加入不同劑量的perifosine 處理24 h，對照組加入PBS。終止培養前4 h，加20 μL MTT(5 g/L)于各個孔中。吸去培養基，加入150 μL二甲基亞砜，室溫振蕩10 min，490 nm波長下測定各孔吸光度值。實驗重復3次。

2.3流式細胞術檢測細胞周期不同濃度的perifosine作用細胞24 h后，胰酶消化并制備單細胞懸液，然后加入預冷的75%無水乙醇于4 ℃固定18 h。接著用PBS洗滌細胞2次，加入終濃度為50 mg/L RNase A于37 ℃孵育30 min；加入終濃度為50 mg/L的PI于4 ℃閉光染色20 min，然后上機檢測分析各組細胞的周期分布。實驗重復3次。

2.4細胞凋亡的檢測采用Annexin V-FITC/PI雙標法檢測細胞凋亡，具體操作方法參照試劑盒說明書進行，根據Annexin V-FITC/PI的熒光強度計算細胞凋亡百分率。實驗重復3次。

2.5免疫印跡實驗細胞經不同劑量perifosine處理24 h后，進行免疫印跡分析。各組細胞經PBS洗滌2次后，用預冷的RIPA蛋白裂解液冰上裂解30 min，然后4 ℃ 12 000 r/min離心20 min，收集上清并用BCA 法定量。經SDS-PAGE分離蛋白，將凝膠上的蛋白質電轉至硝酸纖維素膜上；再用5%脫脂奶粉封閉過夜，加入 I 抗，室溫孵育3h后加入 II 抗，最后ECL 發光液曝光顯影。實驗重復3次。

2.6細胞內GFP-LC3 融合蛋白的表達接種U251細胞于6 孔板中，待細胞融合至80% 左右用Lipofectamine 2000 轉染GFP-LC3 質粒。轉染24 h 后，加入不同濃度的perifosine 繼續處理24 h，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。無自噬時，GFP-LC3 融合蛋白一般呈彌散狀態分布于胞漿中，當細胞發生自噬時，GFP-LC3 融合蛋白轉位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成明亮的綠色斑點(相當于自噬體)。

3統計學處理

采用SPSS 16.0統計軟件分析，數據用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較應用單因素方差分析，組間兩兩比較應用SNK-q檢驗，以P<0.05 為差異有統計學意義。

結　　果

1Perifosine抑制U251細胞內Akt的磷酸化

Akt 第473 位點絲氨酸磷酸化(p-AktS473)增強通常被作為Akt激活的指標。由于perifosine是Akt 的抑制劑，所以本研究首先檢測了perifosine對U251細胞內Akt 磷酸化(p-AktS473)的抑制作用。免疫印跡結果顯示經perifosine處理24 h后，細胞內Akt的磷酸化水平顯著受到抑制，且抑制作用呈劑量依賴性。細胞內總Akt 的表達量無明顯變化,見圖1。

2Perifosine阻滯U251細胞于G2期

用MTT法檢測了perifosine作用24 h 后對U251細胞活力的影響。結果顯示perifosine可顯著抑制U251細胞活力，且抑制作用呈劑量依賴性,見圖2。用流式細胞術分析了perifosine對U251細胞周期的影響，結果如圖3和表1所示，perifosine處理24 h后，處于G2期的細胞數量明顯增多，表明perifosine能夠誘導細胞發生G2期阻滯。

Figure 1.The protein levels of p-Akt and total Akt in the U251 cells treated with perifosine for 24 h determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L.

圖1Perifosine 抑制U251細胞內Akt的磷酸化

Figure 2.The effects of perifosine treatment for 24 h at different concentrations on the viability of the U251 cells determined by MTT assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L.

圖2Perifosine抑制U251細胞活力

免疫印跡實驗結果表明，perifosine抑制膠質瘤細胞中P27和cyclin B1的表達，而P21的蛋白水平則隨著perifosine的濃度增加而上調，但Cdc2的表達水平無明顯變化,見圖4。

3Perifosine 誘導U251細胞發生凋亡

誘導腫瘤細胞發生凋亡如同抑制細胞增殖一樣，也是小分子藥物抗腫瘤作用的重要理論依據。因此，我們采用Annexin V-FITC/PI雙標法檢測perifosine對膠質瘤細胞凋亡的影響。如同對SGC-7901胃癌細胞凋亡的誘導作用，較高濃度的perifosine同樣促進了膠質瘤細胞U251發生凋亡,見表2。

免疫印跡法檢測了perifosine對U251細胞內凋亡相關蛋白活性及表達水平的影響。發現較高濃度的perifosine促進了胱天蛋白酶家族成員caspase-9和PARP的切割，而凋亡抑制蛋白survivin的表達則逐漸降低，見圖5。

Figure 3.Upon exposure to perifosine for 24 h, U251 cells exhiibted G2phase arrest.

圖3Perifosine誘導U251細胞阻滯于G2期

表1Perifosine誘導U251細胞周期阻滯于G2期

Table 1.Upon exposure to perifosine for 24 h, U251 cells exhi-bited G2phase arrest (%. Mean±SD.n=3)

Perifosine(μmol/L)G0/G1SG2/M066.86±3.7518.53±1.5114.27±1.38559.26±3.77*17.89±1.6323.68±1.82*1041.31±2.93*18.03±1.8739.20±2.49*

*P<0.05vs0 μmol/L.

4Perifosine抑制U251細胞發生自噬

轉染GFP-LC3質粒的膠質瘤細胞經perifosine處理24 h 后，GFP-LC3 細胞內的點狀分布增加，證實perifosine能夠促進膠質瘤細胞自噬的發生,見圖6。同時，免疫印跡法檢測perifosine對人膠質瘤細胞內LC3-Ⅱ蛋白表達的影響，發現不同濃度的perifosine處理細胞后，LC3-Ⅱ蛋白表達水平明顯增多，進一步證明perifosine能夠誘導U251細胞發生自噬,見圖7。

Figure 4.The effects of perifosine treatment at different concentrations for 24 h on the expression of cell cycle-associated proteins in the U251 cells. Cell lysates were analyzed by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L.

圖4Perifosine對細胞周期相關蛋白表達水平的影響

表2　Perifosine 促進U251細胞發生凋亡

*P<0.05vs0 μmol/L.

5抑制自噬促進perifosine誘導的U251細胞凋亡

CQ是特異性自噬抑制劑，主要抑制細胞內自噬體和溶酶體的融合[6]。U251細胞經CQ(10 μmol/L)與perifosine(20 μmol/L)聯合作用24 h后，Annexin V-FITC/PI雙標法檢測了細胞凋亡的變化。結果表明抑制自噬促進了perifosine誘導的U251細胞凋亡，見表3。同時免疫印跡結果顯示，自噬抑制劑CQ與perifosine 聯用促進了PARP的切割，見圖8。

Figure 5.The effects of perifosine treatment for 24 h at different concentrations on the levels of apoptosis-related proteins in the U251 cells determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L.

圖5免疫印跡檢測perifosine對U251細胞內凋亡相關蛋白的影響

Figure 6.Representative images of GFP-LC3 in the U251 cells transfected with GFP-LC3 plasmid. After transfection for 24 h, the cells were treated with perifosine for another 24 h.

圖6Perifosine對U251細胞GFP-LC3融合蛋白表達的影響

討　　論

膠質瘤是成人常見的惡性腦腫瘤，其侵襲性強，術后復發率高。盡管治療手段不斷進步，但中位生存期仍無明顯改進。目前膠質瘤的治療以手術治療為主，化療則是常規的輔助治療方法，但化療藥物的獲得性耐藥使得化療效果較差，因此迫切需要尋找新的藥物來輔助膠質瘤的手術治療。PI3K/Akt信號通路廣泛存在于細胞中，通過調節細胞周期和細胞能量代謝等多種途徑發揮重要的生理功能。研究發現，PI3K/Akt信號途徑在膠質瘤中過度活化[7-8]，提示該通路與膠質瘤的發生發展關系密切，而PI3K和Akt激酶或許成為膠質瘤臨床治療的有效靶點。

Perifosine作為新型的Akt抑制劑，能夠通過抑制Akt和細胞外信號調節激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)的磷酸化而抑制小鼠膠質祖細胞的增殖[9]。本研究以U251膠質瘤細胞為實驗材料，主要探討Akt抑制劑perifosine對U251細胞增殖、凋亡和自噬的影響。我們發現，perifosine能夠阻滯細胞于G2期而抑制增殖；通過促進caspase-9和PARP的切割，抑制survivin的表達而誘導細胞凋亡。細胞增殖失控是惡性腫瘤最基本的生物學特征，而細胞周期調控紊亂是增殖失控的根本原因。因此，調控細胞周期進程與誘導細胞凋亡或壞死一樣已成為腫瘤治療的重要途徑之一。細胞周期蛋白是真核細胞周期進程的主要調節蛋白，通過與細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，CDKs)結合形成cyclin-CDKs 復合物共同調控著細胞周期[10]。當腫瘤細胞經藥物或輻射處理后，通常出現G1/S期或G2/M期阻滯，以便修復受損的DNA。Cdc2/cyclin B1作為G2期檢驗點的重要開關，與Cdc25C相互作用于細胞周期，開啟細胞有絲分裂進程[11]。本研究用perifosine處理U251細胞后，cyclin B1的蛋白水平下調，使Cdc2/cyclin B1 復合物的活性降低，從而發生G2期阻滯。

Figure 7.The effect of perifosine treatment for 24 h at different concentrations on the expression of LC3-II in the U251 cells detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖7Perifosine對U251細胞中LC3-II表達的影響

表3抑制自噬增強perifosine誘導的U251細胞凋亡

Table 3.The effects of autophagic inhibitor chloroquine (CQ) on perifosine-induced cell apoptosis (Mean±SD.n=3)

TreatmentEarlyapoptoticrate(%)Lateapoptoticornecroticrate(%)Control1.36±0.644.25±1.33Perifosine5.03±1.95*5.80±2.17CQ2.53±0.866.38±1.75Perifosine+CQ12.07±3.72*#11.40±3.69*#

*P<0.05vscontrol；#P<0.05vsperifosine group.

Figure 8.U251 cells were treated with 20 μmol/L perifosine and/or with 10 μmol/L CQ for 24 h, and the protein level of cleaved PARP was determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol；#P<0.05vsperifosine group.

圖8CQ抑制自噬增強perifosine誘導的PARP切割

細胞自噬是真核細胞所特有的一種胞內代謝途徑，細胞通過自我消化折疊錯誤的蛋白質或受損的細胞器，為機體提供物質能量從而保證大分子的合成[12]。自噬與腫瘤的發生、發展密切相關。有研究證明自噬能夠誘導腫瘤細胞發生非凋亡途徑的細胞死亡；但越來越多實驗發現自噬不但能夠為腫瘤細胞提供能量，促進腫瘤細胞存活，而且與腫瘤細胞的化療耐藥性相關[13-15]。當用化療藥物誘導腫瘤細胞凋亡時，細胞自噬活性增強，產生耐藥性，而與自噬抑制劑聯用能夠減弱這種耐藥性[16]。本研究中，我們觀察了perifosine對U251細胞自噬的影響，發現perifosine促進了U251細胞發生自噬，抑制自噬增強了perifosine誘導的U251細胞凋亡，表明perifosine誘導的U251細胞自噬對細胞是保護性的。

總之，perifosine能夠誘導細胞周期阻滯、細胞凋亡和自噬。抑制自噬增強了perifosine誘導的U251細胞凋亡，本研究為膠質瘤的臨床輔助治療提供了新的策略。

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(責任編輯： 林白霜， 羅森)

Perifosine regulates human brain glioma U251 cell proliferation, apoptosis and autophagy through suppression of PI3K/Akt pathway

LI Ruo-tong1, WANG Li2, CAO Ting2, CHEN Sheng-wen2, FEI Hong-rong3, WANG Feng-ze2

(1SchoolofBasicMedicalSciences,TaishanMedicalUniversity,Tai’an271000,China;2SchoolofLifeSciences,3SchoolofPharmaceuticalSciences,TaishanMedicalUniversity,Tai’an271016,China.E-mail:wfz221@sina.com)

AIM: To investigate the effect of perifosine, an inhibitor of protein kinase B (PKB/Akt), on the cell cycle, apoptosis and autophagy in human brain glioma U251 cells, and to determine the relationship between perifosine-induced autophagy and apoptosis of glioma. METHODS: The cell growth inhibition was determined by MTT assay. The cell cycle distribution of U251 cells was examined by flow cytometry. The cell apoptosis was analyzed by Annexin V-FITC apoptosis detection kit. The protein expression of P21, P27, cyclin B1, caspase-9 and PARP was examined by Wes-tern blot analysis. The distribution and expression of LC3-II, an autophagy marker, was observed to determine the effect of perifosine-induced autophagy. RESULTS: Perifosine inhibited the cell viability in a dose-dependent manner. In perifosine-treated U251 cells, the cell cycle was arrested in G2phase and the expression of cyclin B1 was inhibited. Perifosine induced apoptosis of U251 cells through activation of caspase-9 cleavage, PARP cleavage and survivin inhibition. In addition, suppression of autophagy by chloroquin, an inhibitor of autophagy, increased the number of apoptotic cells. CONCLUSION: Perifosine inhibits cell proliferation and triggers apoptosis and autophagy in human U251 cells. Blocking autophagy magnifies perifosine-induced glioma cell apoptosis.

Perifosine; Akt; Glioma; Apoptosis; Autophagy

1000- 4718(2016)04- 0644- 07

2015- 10- 27

2015- 12- 31

國家自然科學基金資助項目(No.81272683)；山東省高等學?？萍加媱濏椖?No.J15LM09)

Tel: 0538-6236991； E-mail: wfz221@sina.com

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.04.011

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