miR-140在人胃癌組織中的表達及對SGC-7901胃癌細胞功能的影響*

王顯艷，　高　峰，　趙春明，　孫玉榮，　溫秋婷，　于秀文，　張曉杰

(齊齊哈爾醫學院 1病理學院， 2第三附屬醫院麻醉科，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

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miR-140在人胃癌組織中的表達及對SGC-7901胃癌細胞功能的影響*

王顯艷1△，高峰2，趙春明1，孫玉榮1，溫秋婷1，于秀文1，張曉杰1

(齊齊哈爾醫學院1病理學院，2第三附屬醫院麻醉科，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

目的： 研究microRNA-140(miR-140)在人胃癌和正常胃組織中的表達水平，以及調控miR-140表達后對SGC-7901胃癌細胞功能的影響。方法： 采用實時熒光定量PCR檢測miR-140在人胃癌和正常胃組織中的表達水平；將miR-140 mimics(miR-140上調表達)和miR-140 inhibitors(miR-140下調表達)分別通過脂質體轉染至人胃癌SGC-7901細胞中，同時設置未轉染對照組(control組)和miRNA無義序列轉染對照組(NC組)。實時熒光定量PCR檢測轉染后各組細胞中miR-140的表達變化；MTT方法檢測各組細胞的生長活力和順鉑(DDP)作用下的生長抑制率；流式細胞術檢測各組的細胞周期和凋亡率；Transwell實驗檢測各組細胞侵襲能力；Western blot檢測各組細胞中組蛋白脫乙酰酶4(HDAC4)蛋白表達。結果：miR-140在人胃癌組織中表達水平顯著低于正常胃組織(P<0.05)。與control和NC組相比，miR-140 mimics組中SGC-7901細胞活力和侵襲能力下降，細胞周期被阻滯，DDP作用下細胞生長抑制率和凋亡率上升，且HDAC4蛋白表達下調，差異均有統計學意義(P<0.05)；而miR-140 inhibitors 組中SGC-7901細胞活力和侵襲能力上升，細胞周期被促進，DDP作用下細胞生長抑制率和凋亡率下降，且HDAC4蛋白表達上調，差異均有統計學意義(P<0.05)。結論：miR-140在胃癌組織中低表達，可作為抑癌因子調控胃癌細胞活力、細胞周期變化、凋亡、侵襲并通過下調HDAC4發揮作用。miR-140可能作為胃癌診斷和治療的新靶點。

胃癌； MicroRNA-140； SGC-7901細胞； 細胞活力； 細胞凋亡； 侵襲； 組蛋白脫乙酰酶4

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，在我國消化道惡性腫瘤中居首位，而胃癌細胞的增殖、侵襲和轉移是導致患者死亡的主要原因，已成為臨床胃癌治療的主要障礙[1]。同時胃癌細胞的增殖侵襲等細胞活動是一個極其復雜的過程，研究表明有多種基因、酶類及細胞因子等參與調控促進或抑制胃癌的細胞活動，但至今胃癌細胞發生發展的確切分子機制仍未充分闡明[2]。越來越多的研究表明 microRNAs (miRNA)與腫瘤關系密切，它不僅調控腫瘤細胞增殖、凋亡，而且參與調控腫瘤細胞侵襲轉移、耐藥等[3]。在多種腫瘤中均已發現相關miRNA表達量的改變，并發揮促癌或抑癌作用，提示miRNA參與到腫瘤的病理機制中[4]。miR-140是一種在軟骨增生和發育及骨關節炎發生過程中起重要作用的miRNA，但其在腫瘤發生與進展中發揮作用的研究尚少且無定論[5]。有研究發現miR-140在非小細胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)中低表達，其通過下調IGF1R抑制NSCLC的增殖和轉移[6]。另一項在腦膠質瘤中的研究則發現miR-140在由II級到IV級的進展過程中表達增高[7]。目前miR-140在胃癌中表達情況及其在胃癌細胞活動中的作用機制研究未見。本研究檢測miR-140在臨床胃癌標本中表達情況，通過上調和下調miR-140表達揭示其對胃癌SGC-7901細胞增殖、凋亡、侵襲等細胞功能的影響并闡明可能的作用機制，以探討miR-140能否作為臨床胃癌治療的靶點。

材　料　和　方　法

1標本來源

選取齊齊哈爾醫學院第三附屬醫院腫瘤外科2012年6月～2014年6月收治的30例經病理科證實為胃癌的病例，進行病理學檢查手術切除胃癌組織，并以患者遠離胃癌腫瘤大于10 cm的正常胃組織作為對照，標本取樣后用生理鹽水沖洗，去除黏膜組織放入液氮中凍存。腫瘤TNM分期以UICC/AJCC TNM病理分期第7版為準，具體患者臨床資料見表1。標本采集均通過齊齊哈爾醫學院醫學倫理委員會批準和患者知情同意。

表1miR-140的相對表達水平與臨床病理因素的關系

Table 1.Relationships of miR-140 expression and clinicopathological features of gastric carcinoma

FeaturesnmiR-140relativeexpressionPAverageexpression<0.05 Up-expression61.47±0.24 Down-expression240.38±0.21Gender>0.05 Male170.51±0.18 Female130.67±0.13Age(year)>0.05 ≤5591.01±0.11 >55210.65±0.21Tumorsize(cm)<0.05 ≤3.5120.83±0.14 >3.5180.44±0.12Histologicaldifferentiation>0.05 High140.74±0.13 Low160.61±0.15Depthofinvasion(Tstage)<0.05 T1-390.89±0.11 T4210.42±0.16Lymphnodemetastasis(Nstage)<0.05 N061.13±0.17 N1-3240.43±0.21

2細胞及試劑

人胃癌細胞株SGC-7901購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；RPMI-1640細胞培養基、0.25%的EDTA胰酶購自HyClone；胎牛血清購自Gibco；miR-140 mimics和miR-140 inhibitors及其無義序列購自Invitrogen；LipofectamineTM2000轉染試劑購自上海生工公司；real-time PCR試劑盒購自TaKaRa；四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)和順鉑(diamminedichloroplatinum，DDP)購自Sigma；Annexin V/PI細胞凋亡試劑盒購自北京鼎國公司；Transwell板購自Corning；多克隆兔抗人組蛋白脫乙酰酶4(histone deacetylase 4, HDAC4)和β-actin蛋白抗體購自Abcam。

3主要方法

3.1Real-time PCR檢測miR-140在人胃癌和正常胃組織中表達利用TRIzol提取試劑盒提取胃癌和正常胃組織樣品中總RNA，后用miR-140特異性逆轉錄引物(表2)和NCodeTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit轉錄合成cDNA。由Invitrogen設計合成miR-140和內參照U6 real-time PCR引物。根據OpenArray MicroRNA Real-time PCR Master Mix 試劑盒分別加入miR-140或U6引物、cDNA模板置于ABI7300實時熒光定量PCR儀上經行擴增檢測。miR-140和內參照U6均設置3個復孔，每個樣品經3次重復檢測，采用2-ΔΔCt方法對人胃癌和正常胃組織中miR-140 相對表達量進行比較。

表2　逆轉錄和實時熒光定量PCR引物

3.2miR-140 mimics和miR-140 inhibitors 轉染SGC-7901細胞將人胃癌細胞株SGC-7901復蘇后在含10%胎牛血清的RPMI-1640細胞培養基中培養，置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中。利用脂質體Lipofectamine 2000分別將miR-140 mimics和miR-140 inhibitors轉染至SGC-7901細胞中以使miR-140上調和下調。細胞分組為：空白對照(control)組：僅加入脂質體Lipofectamine 2000；陰性對照組(negative control， NC)：加入miRNA無義序列和Lipofectamine 2000；miR-140上調轉染組：加入miR-140 mimics和Lipofectamine 2000；miR-140下調轉染組：加入miR-140 inhibitors和Lipofectamine 2000。按照上述方法用real-time PCR檢測各組轉染后SGC-7901細胞中miR-140表達變化。

3.3MTT檢測細胞活力變化和生長抑制率將各組轉染后的SGC-7901細胞以5×107/L接種于96孔板，分別培養12、24、36、48、60、72 h，后在每孔中加入20 μL的MTT溶液(5 g/L)，繼續培養4 h后棄上清培養基，每孔加入150 μL DMSO，振蕩混勻10 min后置于酶標儀上測定570 nm波長時每孔的吸光度A值以反映細胞生長活力。同時將各組轉染后的SGC-7901細胞接種96孔板貼壁生長后分別更換含不同濃度(0、5、10、15、20 μmol/L)DDP的培養基繼續培養24 h，按照MTT方法測定各孔細胞的A值，并計算各組細胞生長抑制率(%)=(1-加藥組A值/未加藥對照組A值)×100%以反映各組細胞對順鉑藥物敏感性。

3.4流式細胞術檢測細胞周期和凋亡率收集各組轉染24 h后的SGC-7901細胞，用預冷的75%乙醇混勻固定后，離心收集細胞，用200 μL的PBS重懸細胞并避光孵育PI 20 min后直接經BDcantoⅡ流式細胞儀檢測各組細胞周期變化。同時根據上述實驗選擇10 μmol/L的DDP作用于各組轉染后SGC-7901細胞以測定細胞凋亡變化。將各組轉染后細胞接種于6孔板中，待細胞貼壁生長后更換含10 μmol/L DDP的培養基繼續培養12 h，后用胰酶消化細胞并收集。分別在各組細胞中加入5 μL的FITC標記Annexin V和10 μL的PI細胞凋亡檢測試劑，37 ℃下避光孵育20 min后，PBS洗滌1次重懸細胞，經BDcantoⅡ流式細胞儀測定各組細胞凋亡率變化。

3.5Transwell檢測細胞侵襲能力將轉染后的各組SGC-7901細胞調整細胞濃度為1×109/L，以每孔200 μL種植于預先用1 g/L的Matrigel膠包被的Transwell板上室中，下室中加入20%胎牛血清的RPMI-1640完全細胞培養基600 μL，每組設置6個復孔，置于細胞培養箱中繼續培養48 h。培養結束后用4%多聚甲醛固定Transwell小室的濾膜，擦去上表面的細胞，用結晶紫染色液染色10 min后，PBS洗滌3次，在顯微鏡下觀察各組侵襲穿過濾膜的細胞，并隨機拍照計算細胞侵襲率=(各組侵襲細胞數/未處理對照組侵襲細胞數)×100%。

3.6Western blot檢測HDAC4表達變化收集各組轉染后SGC-7901細胞，用RAPI細胞裂解液提取各組細胞中總蛋白，BCA試劑盒測定細胞中總蛋白濃度。各組上樣30 μg總蛋白經行10%的SDS-PAGE凝膠電泳2 h，后轉PVDF膜并封閉，4 ℃孵育多克隆兔抗人HDAC4和β-actin I 抗(1∶1 000)過夜；TBST洗滌后室溫孵育HRP標記的山羊抗兔IgG II 抗(1∶5 000)2 h，洗滌后ECL化學發光顯影，曝光掃描拍照。用Quantity One軟件分析各組轉染后細胞中HDAC4蛋白相對表達情況。

4統計學處理

所有數據采用SPSS 13.0軟件經行統計學分析，定量數據用均數±標準差(mean±SD)表示。多組間數據比較采用單因素方差(one-way ANOVA)分析，用SNK-q進行均數之間的兩兩比較。以P<0.05為差異有統計學意義。

對鋼鐵行業的用鋼標準和建筑工程設計規范應進行修訂和完善，將400 MPa級、500 MPa級和600 MPa級鋼筋納入相關的結構設計和施工驗收規范中，使相關條文具有強制性。同時，要加強與交通、鐵路、水利等行業的協調，使各行業的設計規范有效銜接，納入高強鋼筋生產和應用的新工藝、新技術，進行配套修訂，從而推進高強鋼筋在工程建設中的應用。

結　　果

1miR-140在胃癌中表達情況及與臨床病理參數之間的關系

利用real-time PCR檢測發現miR-140在人胃癌組織中表達水平顯著降低，miR-140低表達率為80%，見表1。對胃癌組織中miR-140的表達水平與臨床病理參數之間進行統計，全組30例胃癌患者，男17例，女13例，年齡在38～67歲，中位年齡58.9歲，miR-140總平均表達量為正常胃組織的(0.63±0.13)倍(P<0.05)。同時檢測發現，人胃癌組織中miR-140表達水平與腫瘤大小、胃癌侵襲度和淋巴轉移相關。

2miR-140 mimics和miR-140 inhibitors 轉染SGC-7901細胞后miR-140表達的變化

Real-time PCR檢測發現miR-140 mimics轉染SGC-7901細胞后能夠使miR-140表達上調，而轉染miR-140 inhibitors后能夠使miR-140表達下調，見圖1。與control組相比，NC轉染組中miR-140表達水平無明顯變化；與control組和NC組相比，miR-140 mimics組中miR-140表達水平上升至原來的(3.85±0.17)倍(P<0.05)；而miR-140 inhibitors組中miR-140表達水平下降至(15±9)%(P<0.05)，說明miR-140 mimics和miR-140 inhibitors 轉染SGC-7901細胞成功，能夠上調和下調細胞中miR-140表達。

Figure 1.The expression of miR-140 in SGC-7901 cells transfected with miR-140 mimics and miR-140 inhibitors. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group and NC group.

圖1miR-140在miR-140 mimics和miR-140 inhibitors轉染SGC-7901細胞后的表達差異

3miR-140調控表達對SGC-7901細胞活力和順鉑作用下生長抑制率的影響

MTT實驗發現miR-140 mimics轉染SGC-7901細胞后能夠降低細胞生長活力，而miR-140 inhibitors轉染后SGC-7901細胞活力有所提升。與control和NC組相比，在24～72 h時段內，miR-140 mimics轉染組SGC-7901的細胞活力均顯著降低，差異有統計學顯著性(P<0.05)；而在36～72 h時段內，miR-140 inhibitors轉染組中SGC-7901細胞活力均顯著提升，差異有統計學顯著性(P<0.05)，見圖2。同時用MTT實驗檢測各組細胞對DDP的敏感性，發現在不同濃度DDP作用下miR-140 mimics轉染組SGC-7901細胞生長抑制率顯著高于miR-140 inhibitors轉染組。與control和NC組相比，在DDP濃度大于10 μmol/L時，miR-140 mimics轉染組SGC-7901細胞生長抑制率顯著上升，而miR-140 inhibitors轉染組細胞生長抑制率顯著下降，差異均具有統計學顯著性(P<0.05)，見圖3。

Figure 2.The changes of SGC-7901 cell activity curve were detected by MTT assay. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group and NC group.

圖2MTT檢測miR-140調控表達后各組SGC-7901細胞生長活力曲線的變化

Figure 3.The sensitivity changes of SGC-7901 cell growth inhibition rate to DDP were detected by MTT assay. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol and NC group.

圖3miR-140調控表達后各組SGC-7901細胞在DDP作用下生長抑制率的變化

4miR-140調控表達對SGC-7901細胞周期的影響

流式細胞術檢測發現miR-140 mimics轉染SGC-7901細胞后能夠阻滯細胞周期變化，而miR-140 inhibitors轉染后能夠促進細胞周期。與control和NC組相比，miR-140 mimics轉染組SGC-7901細胞G0/G1期比例顯著上升，而G2/M期細胞比例顯著下降(P<0.05)；而miR-140 inhibitors轉染組SGC-7901細胞G0/G1期比例顯著下降，但S期和G2/M期細胞比例顯著上升(P<0.05)，見圖4。

Figure 4.The changes of SGC-7901 cell cycle detected by flow cytometry. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group and NC group.

圖4miR-140調控表達對各組SGC-7901細胞周期的影響

5miR-140調控表達對SGC-7901細胞凋亡的影響

流式細胞術檢測發現在10 μmol/L順鉑藥物的誘導下，miR-140 mimics轉染SGC-7901細胞能夠促進細胞凋亡，而miR-140 inhibitors轉染能夠抑制細胞凋亡。經過統計，與control和NC組相比，miR-140 mimics轉染組SGC-7901細胞凋亡率顯著上升，而miR-140 inhibitors轉染組細胞凋亡率顯著下降，差異均有統計學顯著性(P<0.05)，見圖5。

6miR-140調控表達對SGC-7901細胞侵襲能力的影響

Transwell實驗檢測發現miR-140 mimics轉染SGC-7901細胞能夠抑制細胞侵襲能力，而miR-140 inhibitors轉染能夠促進細胞侵襲能力。與control和NC組相比，miR-140 mimics轉染組SGC-7901細胞侵襲率顯著下降，而miR-140 inhibitors轉染組細胞侵襲率顯著上升，差異均有統計學顯著性(P<0.05)，見圖6。

7miR-140調控表達對SGC-7901細胞中HDAC4蛋白表達的影響

Western blot檢測發現miR-140調控表達能夠調節SGC-7901細胞中HDAC4蛋白表達。 與control和NC組相比，miR-140 mimics轉染組SGC-7901細胞中HDAC4蛋白相對表達量顯著下降，而miR-140 inhibitors轉染組細胞HDAC4蛋白相對表達量顯著上升，差異均有統計學顯著性(P<0.05)，見圖7。

討　　論

目前，miRNA和腫瘤的相關性受到廣泛的關注，如miR-15a、miR-16-1、miR-34a等多種miRNA可能成為腫瘤治療的新靶點[8-9]。miR-140是一種在軟骨增生和發育中發揮重要作用的微小RNA，與腫瘤細胞增殖、侵襲等活動也相關[10]。Iorio等[11]應用microRNA芯片技術篩選上皮源性卵巢癌與正常卵巢組織之間的差異表達miRNA，其中發現miR-140在卵巢癌中的表達水平顯著降低。但另一項研究應用實時熒光定量PCR比較了4例原發性II級神經膠質瘤與自發進展的繼發性IV級惡性膠質瘤之間的microRNA表達譜，發現miR-140在神經膠質瘤由II級到IV級的進展過程中表達增高[7]。因此，miR-140在不同腫瘤病理發生或不同進展階段中可能發揮不同的調節作用。本研究取30例臨床胃癌和正常胃組織標本檢測發現總體上miR-140在胃癌組織中表達水平低于正常胃組織，并且與腫瘤大小、侵襲度、淋巴轉移分期相關，胃癌腫瘤生長越大，侵襲度、淋巴轉移分期越高，miR-140相對表達水平越低。因此，本研究結果與上述Iorio等在其它腫瘤組織中的發現一致，并提示miR-140可能作為抑癌因子在人胃癌侵襲和轉移等細胞功能中發揮作用。

Figure 5.The changes of SGC-7901 cell apoptotic rate detected by flow cytometry. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group and NC group.

圖5miR-140調控表達對各組SGC-7901細胞凋亡率的影響

Figure 6.The changes of SGC-7901 cell invasion rate detected by Transwell assay (×200). Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group and NC group.

圖6miR-140調控表達對各組SGC-7901細胞侵襲率的影響

Figure 7.The changes of HDAC4 protein expression in SGC-7901 cells detected by Western blot. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol and NC group.

圖7miR-140調控表達對各組SGC-7901細胞中HDAC4蛋白表達的影響

研究表明，miRNA的異常表達與腫瘤增殖活性、藥物敏感性和侵襲轉移行為等細胞功能密切相關，如miR-21過表達能夠促進大腸癌、胃癌、肝癌和胰腺癌等腫瘤侵襲和轉移，而miR-34a過表達則抑制膠質瘤、乳腺癌等腫瘤增殖、侵襲，并增強藥物敏感性[12-13]。為進一步驗證miR-140在胃癌細胞功能中發揮的作用，選擇人胃癌細胞株SGC-7901為研究對象將miR-140模擬物(miR-140 mimics)和miR-140抑制物(miR-140 inhibitor)分別轉染SGC-7901細胞，real-time PCR檢測發現分別可以顯著上調和下調miR-140表達。同時，本研究也發現miR-140 mimics轉染組促進miR-140表達水平后，SGC-7901細胞活力下降，對順鉑敏感性增強，細胞周期被阻滯在G0/G1期，細胞凋亡率顯著上升，而侵襲能力下降；但miR-140 inhibitor轉染組下調miR-140表達水平后SGC-7901各細胞作用與之相反，證明了miR-140在人胃癌細胞功能中發揮抑癌作用。本研究結果與Yang等[14]報道miR-140過表達后抑制肝癌、非小細胞肺癌的增殖和侵襲轉移水平結果相一致。

Tuddenham等[10]在小鼠3T3細胞中，應用螢光素酶報告系統證實了HDAC4是miR-140的靶基因，miR-140通過抑制HDAC4表達來促進軟骨細胞的發育。有研究表明，HDAC4在乳腺癌和子宮內膜癌中高表達，能夠作為促癌基因調控相關腫瘤增殖凋亡和順鉑耐藥性[15]。為揭示miR-140在人胃癌細胞中發揮作用是否通過調控HDAC4靶基因及其調控關系，本研究利用Western blot直接檢測miR-140轉染各組中HDAC4蛋白的表達，發現對照組和NC組中HDAC4蛋白呈高表達水平，而miR-140 mimics轉染組中HDAC4蛋白表達顯著降低，相應miR-140 inhibitor轉染組中HDAC4蛋白表達顯著上升。結合上述研究說明miR-140可通過負調控HDAC4發揮抑制胃癌細胞增殖、侵襲并促進凋亡的作用。

綜上所述，本研究結果首先證明miR-140是調控胃癌細胞增殖、凋亡、侵襲等功能的關鍵因子之一，為其作為臨床胃癌治療的新靶點提供了依據。

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(責任編輯： 林白霜， 羅森)

Expression of miR-140 in human gastric cancer and its effect on function of SGC-7901 cells

WANG Xian-yan1, GAO Feng2, ZHAO Chun-ming1, SUN Yu-rong1, WEN Qiu-ting1, YU Xiu-wen1, ZHANG Xiao-jie1

(1SchoolofPathology,2DepartmentofAnesthesiology,TheThirdAffiliatedHospital,QiqiharMedicalUniversity,Qiqihar161006,China.E-mail:wxygf1976@sina.com)

AIM: To explore the expression level of microRNA-140 (miR-140) in human gastric cancer and normal gastric tissues, and the regulatory effect of miR-140 expression on the function of SGC-7901 cells. METHODS: The expression levels of miR-140 in human gastric cancer and normal gastric tissues were detected by real-time PCR. miR-140 mimics (miR-140 up-regulated expression) and miR-140 inhibitors (miR-140 down-regulated expression) were transfected into human gastric cancer SGC-7901 cells by liposome method. At the same time, the untransfected control group (control group) and miRNA nonsense sequence transfection group (NC group) were set up . The expression of miR-140 in the cells after transfection was detected by real-time PCR. The cell viability and growth inhibition rate with DDP were measured by MTT assay. The cell cycle and apoptotic rate of SGC-7901 cells were analyzed by flow cytometry. The invasion ability of SGC-7901 cells was measured by Transwell assay. The protein expression of histone deacetylase 4(HDAC4) in the cells was determined by Western blot. RESULTS: The expression level of miR-140 in human gastric cancer tissues was significantly lower than that in normal gastric tissues (P<0.05). Compared with control group and NC group, the viability and invasion ability of the SGC-7901 cells were decreased, the cell cycle was arrested, the cell growth inhibition rate and apoptotic rate with DDP treatment were increased, and the protein expression of HDAC4 was down-regulated (P<0.05) in miR-140 mimics group. However, in miR-140 inhibitors group, the viability and invasion ability of the SGC-7901 cells were increased, the cell cycle was promoted, the cell growth inhibition rate and apoptotic rate with DDP treatment were decreased, and the protein expression of HDAC4 was up-regulated (P<0.05). CONCLUSION: The expression level of miR-140 in the gastric cancer tissues is low. miR-140 serves as a tumor suppressor to regulate the viability, apoptosis and invasion ability of gastric cancer cells, and to play a role by down-regulating HDAC4 protein. miR-140 may serve as a new target for diagnosis and treatment of gastric cancer.

Gastric cancer; MicroRNA-140; SGC-7901 cells; Cell viability; Apoptosis; Invasion; Histone deacetylase 4

1000- 4718(2016)04- 0651- 07

2015- 12- 07

2016- 02- 04

黑龍江省教育廳科學技術研究面上項目(No. 12531804)

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R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.04.012

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