阿霉素誘導下多發性骨髓瘤細胞中自噬和氧化應激的相互作用*

羅　綦，　陳建斌

(重慶醫科大學附屬第一醫院血液科，重慶 400016)

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阿霉素誘導下多發性骨髓瘤細胞中自噬和氧化應激的相互作用*

羅綦，陳建斌△

(重慶醫科大學附屬第一醫院血液科，重慶 400016)

目的： 探討阿霉素(doxorubicin，DOX)誘導對多發性骨髓瘤細胞系RPMI-8226細胞內自噬和活性氧簇(reactive oxidative species，ROS)生成的影響及其相互作用關系。方法: 不同濃度阿霉素誘導RPMI-8226細胞24 h, 采用Western blot技術檢測細胞內beclin 1、LC3等自噬相關蛋白的表達水平。采用DCFH-DA 熒光染色法檢測RPMI-8226細胞內ROS的水平，熒光顯微鏡采集圖像。采用氧自由基清除劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)及tempol處理RPMI-8226細胞后，通過Western blot技術檢測阿霉素誘導下細胞內beclin 1、LC3等蛋白的表達水平。采用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)處理PRMI-8226細胞后，檢測阿霉素誘導下細胞內ROS和凋亡的表達水平。結果: RPMI-8226細胞內beclin 1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達水平呈阿霉素劑量依賴性增加，當阿霉素誘導濃度達2 mg/L時，與對照組比較顯著增加(P<0.05)。采用2 mg/L阿霉素處理RPMI-8226細胞，通過熒光顯微鏡觀察，ROS水平較對照組明顯增加。氧自由基清除劑NAC和tempol處理RPMI-8226細胞后，beclin 1和LC3Ⅱ/Ⅰ的表達水平較阿霉素處理組下降。采用自噬抑制劑3-MA處理細胞后，RPMI-8226細胞內ROS和凋亡的水平較阿霉素處理組及對照組增加。結論: 阿霉素能增加RPMI-8226細胞內自噬和ROS的生成，抑制自噬能增加阿霉素誘導下ROS和凋亡的水平，抑制ROS后能減少阿霉素誘導下多發性骨髓瘤細胞中的自噬。

多發性骨髓瘤； 阿霉素； 自噬； 活性氧簇

多發性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一種漿細胞惡性腫瘤，臨床表現為骨痛、貧血、腎功能不全和免疫力低下等[1-3]。近年來，雖新型藥物的應用和造血干細胞移植使MM患者生存期較前延長，但聯合化療仍是治療MM的主要手段[4-5]。阿霉素(doxorubicin，DOX)為蒽環素類抗生素，是目前用于治療MM聯合化療的常用藥物。自噬(autophagy)是一種溶酶體依賴的降解路徑。在正常生理狀態下，有利于細胞保持自身穩態。在腫瘤形成后，自噬為腫瘤細胞提供更豐富的營養，促進腫瘤生長[6]。3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)作為磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)抑制劑，對自噬能明顯起到抑制作用。細胞內的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)作為新陳代謝產物在各類細胞中不斷產生和清除，而且在不同的細胞中ROS生成的水平是不相同的，更為重要的是相對于腫瘤細胞，相應的正常細胞中本底的ROS水平更低[7-8]。線粒體在正常氧化呼吸時會產生少量的ROS，但研究顯示，中、高度的ROS產生導致ROS胞內蓄積引起氧化應激反應。研究顯示ROS產生通過增加線粒體膜通透性直接啟動凋亡[9-10]。N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)是一類含巰基的化合物，具有抑制自由基的生成、清除已產生的自由基、調節細胞活性、防止DNA損傷等功能。Tempol是一種超氧化物清除劑，具有神經保護、抗炎癥和鎮痛效果[11]。本研究顯示阿霉素誘導下多發性骨髓瘤細胞自噬相關蛋白表達增加，ROS水平增高。但自噬和ROS在阿霉素誘導的多發性骨髓瘤細胞中的相互作用尚不清楚。本文通過采用自噬抑制劑3-MA和氧自由基清除劑NAC、tempol闡明阿霉素誘導下多發性骨髓瘤細胞中自噬和ROS的相互作用。

材　料　和　方　法

1主要試劑和儀器

RPMI-8226細胞系由上海第二軍醫大學長征醫院血液科侯健教授惠贈。RPMI-1640和胎牛血清(Gibco)；二甲基亞砜、阿霉素、3-MA、NAC、tempol、抗β-actin抗體及HRP標記的羊抗兔IgG II抗(Sigma)；抗beclin 1抗體和抗LC3抗體(CST)。

2方法

2.1細胞培養RPMI-8226細胞于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，在37 ℃ 、5 % CO2及飽和濕度條件下傳代培養，每2～3 d換液1次。選取對數生長期細胞進行實驗。以未加任何處理的細胞作為正常對照組。

2.2Western blot檢測beclin 1和LC3蛋白表達按上述分組處理細胞后，收集各組細胞，PBS清洗細胞2次后，1 000×g離心 3 min，去上清，加入RIPA裂解液，裂解20 min，4 ℃、12 000×g離心20 min，收集上清，BCA法測定蛋白濃度。取50 μg總蛋白經SDS-PAGE分離，將蛋白電轉至PVDF膜上。封閉液(5%脫脂牛奶)室溫封閉2 h，加入 I 抗(beclin 1 1∶1 000，LC3 1∶1 000，β-actin 1∶5 000)，4 ℃ 搖床孵育過夜。次日TBST洗膜3次，室溫孵育II抗(1∶5 000) 1 h，ECL化學發光試劑盒(Pierce)顯色，曝光，保存圖片。

2.3DCFH-DA熒光探針檢測細胞內總ROS的變化處理細胞后，加入DCFH-DA熒光染料，37 ℃培養30 min 后，收集細胞，PBS清洗3次，加入新鮮培養基，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

2.4流式細胞術Annexin V/PI雙標法檢測細胞凋亡細胞處理結束后，PBS 清洗 2 次，將細胞重懸于 300 μL 70%乙醇中，送重慶醫科大學生命科學院按Annexin V/PI試劑盒說明檢測細胞凋亡。

3統計學處理

所有實驗均重復3次，計量資料采用均數±標準差(mean±SD)表示。采用SPSS 16.0統計軟件進行分析。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Bonferroni檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結　　果

1阿霉素處理下 RPMI-8226細胞LC3和Beclin 1的表達水平

與對照組相比，阿霉素處理組中2 mg/L及以上組beclin 1的表達明顯增加(P<0.05)。阿霉素處理組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達水平較對照組表達增加，阿霉素處理濃度達2 mg/L時，差異有統計學顯著性(P<0.05),見圖1。

2阿霉素處理下RPMI-8226細胞ROS的表達水平

與對照組相比，阿霉素處理組RPMI-8226細胞的ROS生成水平較對照組明顯增加,見圖2。

3抗氧化劑NAC和tempol處理下beclin 1及LC3的表達

單純阿霉素(2 mg/L)處理組較對照組beclin 1和LC3 II/I表達水平增加，差異有統計學顯著性(P<0.05)。加入抗氧化劑NAC (5 mmol/L)或tempol(2 mmol/L)預處理 RPMI-8226細胞2 h后，beclin 1及LC3 II/I表達較阿霉素組明顯降低(P<0.05),見圖3。

Figure 1.The protein levels of beclin 1 and LC3 in RPMI-8226 cells after stimulated with doxorubicin (DOX) detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 mg/L;#P<0.05vs2 mg/L.

圖1阿霉素誘導RPMI-8226細胞后beclin 1和LC3蛋白表達的變化

Figure 2.ROS levels in RPMI-8226 cells after stimulated with doxorubicin (DOX) (DCFH-DA staining,×100). Ctr: control.

圖2阿霉素誘導RPMI-8226細胞后ROS生成的變化

43-MA處理下 RPMI-8226細胞ROS生成的變化

阿霉素處理組的ROS生成較對照組明顯增加，阿霉素+NAC組的ROS生成較阿霉素處理組明顯減少。阿霉素+3-MA(5 mmol/L)處理組的ROS生成與阿霉素處理組比較明顯增加,見圖4。

53-MA處理下RPMI-8226 細胞凋亡的變化

阿霉素處理組的凋亡水平較對照組明顯增加，阿霉素+3-MA(5 mmol/L)處理組的凋亡水平較阿霉素處理組明顯增加，差異均有統計學顯著性(P<0.05),見圖5。

討　　論

研究顯示，多發性骨髓瘤是最常見的漿細胞克隆性血液系統腫瘤，在血液系統腫瘤中發病率為10%～15%，近年來發現其發病年齡呈現年輕化趨勢[1, 12]。隨著經濟的發展，現已出現許多治療多發性骨髓瘤疾病的新藥，但在化療藥物聯合用藥中，阿霉素仍起著非常重要的作用[7]。本實驗以阿霉素誘導多發性骨髓瘤RPMI-8226細胞作為體外模型，研究阿霉素誘導下ROS與自噬在RPMI-8226細胞中的相互作用。

細胞受到應激性的死亡威脅時，自噬通過將細胞內受損、變性或衰老的蛋白質以及細胞器運輸到溶酶體進行消化降解從而保持細胞的存活，是真核細胞維持穩態、實現更新的一種重要的進化保守機制[6, 13]。研究表明在惡性血液病化療中，腫瘤細胞激活自噬是腫瘤細胞逃避化療藥物殺傷的可能機制[14, 20-22]。Eretmer 等[23]報道在慢性粒細胞白血病中，可能通過抑制PI3K-AKT-mTORC1通路激活自噬，導致伊馬替尼對白血病細胞的殺傷作用減弱。本研究顯示阿霉素誘導下RPMI-8226細胞中自噬相關蛋白表達增加，采用3-MA抑制自噬后阿霉素誘導下RPMI-8226細胞凋亡較單用阿霉素增加，說明自噬能減少阿霉素對RPMI-8226細胞的殺傷作用。

Figure 3.The protein levels of beclin 1 and LC3 after stimulated with doxorubicin (DOX) and pretreated with tempol orN-acetyl-L-cysteine (NAC) determined by Western blot. Ctr: control. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCtr;#P<0.05vsDOX.

圖3RPMI-8226在抗氧化劑Tempol及NAC處理下beclin1及LC3的表達

Figure 4.ROS levels in RPMI-8226 cells (DCFH-DA staiing,×100). Ctr: control; DOX: doxorubicin; 3-MA: 3-methyladenine; NAC:N-acetyl-L-cysteine.

圖4RPMI-8226細胞ROS的水平

ROS是生物體有氧代謝產生的一類活性含氧化合物的總稱，細胞內ROS介導很多細胞生理和病理反應，ROS可作為一種細胞內信號分子參與細胞自噬的激活[24]。近年臨床及基礎研究都顯示高水平的ROS可導致細胞的凋亡[17-20]。在骨髓間充質干細胞中，過氧化氫(H2O2)可使骨髓間充質干細胞凋亡增加[25]。本研究發現阿霉素能誘導多發性骨髓瘤細胞內ROS產生增加。阿霉素可能通過增加多發性骨瘤RPMI-8226細胞內ROS的生成，從而促進RPMI-8226細胞的凋亡。自噬能有效緩解細胞內ROS產生從而發揮其促生存的作用[15-16]。為闡明阿霉素誘導下RPMI-8226細胞內ROS和自噬的相互影響，我們采用NAC及Tempol抑制細胞內ROS，發現阿霉素+NAC組及阿霉素+Tempol組細胞內自噬相關蛋白beclin1和LC3 II/I較阿霉素組表達下降。采用自噬特異性抑制劑3-MA預處理RPMI-8226細胞，阿霉素誘導下RPMI-8226細胞內ROS和凋亡增加。這說明減輕多發性骨髓瘤RPMI-8226細胞內的ROS水平，細胞內自噬水平相應地減少。

Figure 5.The changes of apoptotic rate after blockadge of autophagy. Ctr: control; DOX: doxorubicin; 3-MA: 3-methyladenine. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCtr;#P<0.05vsDOX.

圖5抑制自噬后細胞凋亡水平的變化

綜上所述，本研究發現阿霉素可同時誘導多發性骨髓瘤細胞中ROS和自噬的發生。抑制阿霉素誘導下多發性骨髓瘤細胞內ROS時，細胞內自噬相關蛋白表達下降。運用自噬抑制劑3-MA處理阿霉素誘導下的多發性骨髓瘤細胞，其ROS的生成增加，同時細胞凋亡增加，說明ROS可誘導細胞內自噬產生，自噬通過降解細胞內ROS減少細胞凋亡。為深入研究阿霉素治療多發性骨髓瘤的耐藥機制提供了新的方向。

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(責任編輯： 盧萍， 羅森)

Crosstalk of autophagy and ROS in multiple myeloma cells stimulated with doxorubicin

LUO Qi, CHEN Jian-bin

(DepartmentofHematology,TheFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China.E-mail:cqchenjianbin2007@126.com.cn)

AIM: To investigate the relationship of autophagy and reactive oxygen species (ROS) in multiple myeloma cell line RPMI-8226 stimulated with doxorubicin. METHODS: The RPMI-8226 cells were stimulated with doxorubicin at different doses, and untreated cells were used as control. The protein expression of beclin 1 and LC3 was detected by Western blot. ROS production was analyzed by DCFH-DA fluorescence staining. After treated with or without 3-methyladenine (3-MA), the ROS production and apoptosis in RPMI-8226 cells were determined by DCFH-DA and flow cytometry, respectively. After treated with or without antioxidants tempol andN-acetyl-L-cysteine (NAC), the expression of beclin 1 and LC3 in RPMI-8226 cells was determined by Western blot. RESULTS: The protein levels of beclin 1 and LC3Ⅱ/LC3Ⅰ were increased in the RPMI-8226 cells stimulated with doxorubicin compared with untreated group. The ROS production was increased in the RPMI-8226 cells stimulated with 2 mg/L doxorubicin compared with untreated group. After treated with 3-MA, the ROS production and apoptosis in the RPMI-8226 cells stimulated with doxorubicin were increased compared with doxorubicin group. After treated with antioxidant NAC or tempol, the expression of beclin 1 and LC3 II/I in the RPMI-8226 cells stimulated with doxorubicin was decreased compared with doxorubicin group.CONCLUSION: The autophagy and ROS levels are increased in RPMI-8226 cells stimulated with doxorubicin. Inhibition of autophagy increases the ROS production and apoptosis of RPMI-8226 cells stimulated with doxorubicin. Inhibition of ROS production reduces doxorubicin-induced autophagy in multiple myeloma cells.

Multiple myeloma; Doxorubicin; Autophagy; Reactive oxygen species

1000- 4718(2016)04- 0665- 06

2015- 11- 20

2016- 03- 17

重慶市衛生計生委醫學科研計劃項目(No. 2011-1-032)

Tel: 023-89011522; E-mail: cqchenjianbin2007@126.com.cn

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.04.014

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