TRPC1缺失對小鼠腦神經細胞生存的影響*

幸仁忠，　劉建軍，　許　華△，　楊細飛△

(1暨南大學藥學院，廣東 廣州 510632； 2深圳市疾病預防控制中心，深圳市現代毒理學重點實驗室, 廣東 深圳 518055)

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TRPC1缺失對小鼠腦神經細胞生存的影響*

幸仁忠1，劉建軍2，許華1△，楊細飛2△

(1暨南大學藥學院，廣東 廣州 510632；2深圳市疾病預防控制中心，深圳市現代毒理學重點實驗室, 廣東 深圳 518055)

目的：研究瞬時受體電位通道1(TRPC1)缺失對小鼠海馬神經元生存的影響。方法: 選用6月齡TRPC1基因敲除小鼠及其對照小鼠，通過神經元特異性標志物NeuN免疫染色、尼氏染色及TUNEL染色檢測TRPC1敲除小鼠海馬CA1、CA3及齒狀回(DG)神經細胞的變化情況。通過Western blot檢測TRPC1基因敲除小鼠促凋亡因子C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)及凋亡相關蛋白cleaved caspase-3的表達水平。結果: NeuN免疫熒光和尼氏染色發現，TRPC1基因敲除小鼠海馬CA1、CA3及DG區神經細胞顯著減少;TUNEL染色檢測發現TRPC1基因敲除小鼠以上區域神經細胞凋亡顯著增加；Western blot結果顯示，與對照小鼠相比，TRPC1基因敲除小鼠海馬組織CHOP及cleaved caspase-3的水平均顯著升高。結論:TRPC1基因缺失可導致小鼠海馬神經元數量顯著減少，其機制可能與TRPC1缺失促進神經細胞凋亡有關。

瞬時受體電位通道1； 神經元； C/EBP同源蛋白； Caspase-3

瞬時受體電位蛋白(transient receptor potential，TRP)是一跨膜蛋白，根據氨基酸序列的同源性和功能傾向性不同，可分為TRPC、TRPV、 TRPM、TRPP、 TRPML和TRPA 6種蛋白家族。TRPC即經典的TRP通道，TRPC 亞家族包括7個亞型(TRPC1～TRPC7)[1]，TRPC1是第1個在哺乳動物發現的TRP。TRPC1在腦、骨骼肌、心臟、腎臟、皮膚、睪丸、卵巢、前列腺和肺都檢測到其高表達[2]。

TRPC1是一種非選擇性陽離子通道，其主要功能是維持體內Ca2+穩態[3]。盡管TRPC1缺陷小鼠可以生存到成年，但很多器官和組織發生缺陷，如心腦血管、中樞神經、骨骼、肌肉和免疫系統。細胞增殖依賴于細胞內Ca2+濃度，細胞內Ca2+濃度在細胞凋亡中起著重要的作用。TRPC1敲除誘導細胞周期停留在G0/G1期[4]。TRPC1可以促進神經元突觸的生長，對神經元有保護作用[5]。TRPC1與很多神經系統疾病相關，如帕金森病和神經源性炎癥[6-7]。TRPC1蛋白分布于哺乳動物顳葉結構，且神經元選擇性地表達TRPC1，表明其可能有助于神經元存活[8]。然而，TRPC1缺失是否影響小鼠海馬神經細胞存活尚未見報道。本研究通過多種方法對神經細胞進行染色，并檢測促凋亡蛋白C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)和cleaved caspase-3的表達水平來研究TRPC1缺失對小鼠神經細胞生存的影響。

材　料　和　方　法

6月齡野生對照(129SvEv)小鼠及TRPC1基因敲除小鼠(Trpc1-/-小鼠)，野生對照小鼠從北京維通利華實驗動物技術有限公司購買，Trpc1-/-小鼠由美國國家環境衛生科學研究院Lutz Birnbaumer教授饋贈。

2主要試劑與儀器

神經元特異性標志物NeuN、CHOP、cleaved caspase-3 I抗均購自CST；β-actin I抗購自Santa Cruz；引物購自生工生物工程股份有限公司；PrimeScriptTMRT Master Mix和 SYBR? Premix Ex TaqTM購自TaKaRa；尼氏染色液購自碧云天公司；DeadEndTMFluorometric TUNEL System購自Promega；激光共聚焦顯微鏡為Leica TCS SP5；普通顯微鏡為Olympus BX60；熒光顯微鏡為Olympus ⅠX 51。

3主要方法

3.1免疫熒光用3%的水合氯醛麻醉小鼠，心臟灌注后于4%多聚甲醛固定24 h，30%蔗糖中脫水48 h直到組織沉到底部，OCT包埋后于切片機中切片(15 μm)。冰凍切片于0.3% Triton X-100室溫孵育15 min，3% BSA封閉30 min，Ⅰ抗中過夜，Ⅱ抗孵育1 h，DAPI室溫孵育后加抗熒光淬滅劑封片。激光共聚焦顯微鏡下觀察和采集圖片，用Image J軟件統計陽性神經細胞數量。

3.2尼氏染色冰凍切片于蒸餾水中漂洗2 min，尼氏染色液染色10 min,染色溫度為50 ℃。蒸餾水洗滌2次，95%乙醇中分色20 s，無水乙醇脫水10 min，二甲苯透明后用中性樹脂封片。在普通顯微鏡Olympus BX60下觀察組織。

3.3TUNEL染色石蠟切片，56℃烘箱中放置1 h熔蠟，二甲苯脫蠟5 min 3次，乙醇梯度脫水，用蛋白酶K通透組織切片，加平衡緩沖液后蓋上塑料蓋玻片，加入孵育緩沖液(內含平衡緩沖液，核苷混合物和rTdT酶)，蓋上塑料蓋玻片，并于37°C孵育1 h，避免光照。移除塑料蓋玻片，將載玻片浸入2×SSC，1×PBS洗5 min 3次后加DAPI，抗熒光淬滅劑封片后，用熒光顯微鏡在藍光下檢測定位凋亡細胞的綠色熒光(熒光素-12-dUTP)。

3.4Western blot檢測凋亡相關蛋白取25 μg 蛋白經10% SDS-PAGE分離。將凝膠上的蛋白轉移至PVDF 膜，以5%脫脂奶粉封閉2 h，Ⅰ抗中4 ℃過夜，TBST漂洗PVDF 膜10 min 3次，取出PVDF膜加入Ⅱ抗(辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠Ⅱ抗1∶3 000， 羊抗兔Ⅱ抗1∶3 000)，37 ℃孵育1 h，TBST 洗膜后曝光。

為測試用戶操作軟件的性能，在泳池環境下進行測試。圖5是泳池環境下的ROV，圖6是自動檢測界面，圖7是主操作界面。

4統計學處理

實驗結果用均數±標準差(mean±SD)表示，應用Graph Pad Prism 6.0軟件對組間差異進行t檢驗分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結　　果

1TRPC1缺失導致海馬NeuN陽性神經細胞數量減少

免疫熒光染色發現，Trpc1-/-小鼠CA1、CA3和齒狀回(dentate gyrus, DG)區神經細胞較野生型小鼠顯著減少(P<0.05)，見圖1。

2TRPC1缺失誘導神經元顯著減少

居氏染色結果提示：和野生型小鼠相比，Trpc1-/-小鼠的CA1、CA3和DG區的神經元減少，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

3TRPC1缺失誘導海馬神經細胞凋亡顯著增加

為了確定TRPC1缺失是否誘導神經細胞凋亡，我們對小鼠海馬進行TUNEL染色。藍色熒光代表細胞核，綠色熒光代表凋亡細胞，統計結果顯示，Trpc1-/-小鼠的CA1、CA3和DG區神經細胞凋亡顯著增加(P<0.05),見圖3。

4TRPC1缺失誘導凋亡蛋白活化

促凋亡蛋白CHOP和凋亡相關蛋白cleaved caspase-3在Trpc1-/-小鼠海馬中的水平顯著增加(P<0.05)，見圖4。

Figure 1.TRPC1 depletion causes neuronal loss. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsWT.

圖1NeuN染色檢測神經細胞數量

Figure 2.TRPC1 depletion reduced the number of neurons. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsWT.

圖2尼氏染色檢測神經細胞數量

Figure 3.The effects of TRPC1 depletion on apoptosis in hippocampus. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsWT.

圖3TUNEL染色檢測神經細胞凋亡的變化

Figure 4.The effects of TRPC1 depletion on the levels of CHOP and cleaved caspase-3. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsWT.

圖4Western blot分析促凋亡蛋白CHOP及cleaved caspase-3水平

討　　論

內質網是儲存Ca2+的重要細胞器，內質網對維持細胞內Ca2+穩態起重要作用。內質網Ca2+穩態主要受2方面的影響：Ca2+誘發性鈣釋放 (calcium-induced calcium release, CICR)和鈣庫操縱性鈣內流(store-operated calcium entry, SOCE)。CICR誘導Ca2+從鈣庫釋放到胞漿；細胞內Ca2+的水平發生變化時，尤其是內質網內Ca2+的濃度下降時，間質相互作用分子1(stromal interaction molecule 1, STIM1)被激活并轉移到質膜上，與TRPC1結合激活鈣庫操縱性鈣通道(store-operated Ca2+channels, SOCC)，產生SOCE促進Ca2+內流，從而增加內質網Ca2+的濃度[9-10]。細胞內Ca2+水平的失衡是誘發細胞凋亡相關信號轉導的刺激因子。Ca2+誘導細胞凋亡的調節機制有：(1)調節線粒體滲透性而參與細胞凋亡[11]，激活哺乳動物線粒體的膜通道PTP，使得相對分子量低的分子通透性突然增大，釋放一些小分子如細胞色素C、Ca2+、凋亡誘導因子等，這些物質可以直接或間接引起細胞凋亡;(2)Ca2+可調節磷脂酶活性，磷脂酶的激活與Ca2+啟動的細胞凋亡有關[12]。

細胞凋亡是細胞在一定的生理或病理條件下遵循自己的生命程序，自己結束生命的過程，最后細胞脫落離體或裂解成若干凋亡小體被其它細胞吞噬[12]。本研究發現TRPC1基因敲除小鼠的神經細胞數量較野生型小鼠顯著減少，促凋亡蛋白CHOP和激活的caspase-3水平均顯著升高，提示TRPC1缺失可導致神經細胞凋亡。TRPC1敲除可直接或間接破壞線粒體，導致內質網Ca2+消耗和激活未折疊蛋白應答(unfolded protein response, UPR)，內質網Ca2+消耗導致內質網Ca2+平衡被破壞，最終導致內質網應激[13]。UPR的活化可幫助機體抵抗內質網應激，但持續性的未折疊蛋白應答導致內質網的生理機制不能恢復正常，最終觸發細胞程序性死亡[14]。Casapse-3是執行凋亡的關鍵分子之一，通過蛋白酶解加工分解成有活性的片段p12和p17。研究表明內質網應激時，促凋亡蛋白CHOP的表達水平增加并介導細胞程序性死亡[15]。因此TRPC1缺失導致小鼠腦神經細胞丟失可能是通過內質網應激導致促凋亡蛋白CHOP的表達水平增加導致的。

綜上所述，本研究通過多種染色方法證實TRPC1缺失可導致小鼠海馬神經細胞丟失，其機制可能是由于TRPC1缺失，導致內質網鈣紊亂，激發內質網應激，引起促凋亡因子CHOP表達上調及凋亡蛋白caspase-3激活，最終使神經細胞凋亡。

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(責任編輯： 林白霜， 余小慧)

Effect of TRPC1 depletion on survival of cerebral nerve cells

XING Ren-zhong1, LIU Jian-jun2, XU Hua1, YANG Xi-fei2

(1CollegeofPharmacy,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;2KeyLaboratoryofModernToxicologyofShenzhen,ShenzhenCenterforDiseaseControlandPrevention,Shenzhen518055,China.E-mail:huax_mail@126.com;E-mail:xifeiyang@gmail.com)

AIM: To study the effect of transient receptor potential channel 1 (TRPC1) on the survival of hippocampal neurons in mice.METHODS:TRPC1 knockout mice and the control mice (6 months old) were used in this study. Immunofluorescence staining of neuron-specific marker NeuN, Nissl staining and TUNEL staining were performed to measure the changes of the neurons in hippocampal CA1, CA3 and dentate gyrus (DG). Western blot analysis was used to detect the levels of pro-apoptotic protein C/EBP homologous protein (CHOP) and cleaved caspase-3.RESULTS: Immunofluorescence staining and Nissl staining showed that the number of neuronal cells was significantly decreased in hippocampal CA1, CA3 and DG ofTRPC1 knockout mice compared with the control mice. TUNEL staining showed that the apoptosis neuronal cell number of the above areas inTRPC1 knockout mice was significantly increased compared with the control mice. The results of Western blot revealed that the levels of CHOP and cleaved caspase-3 were significantly increased in the hippocampus ofTRPC1 knockout mice relative to the control mice. CONCLUSION: The depletion of TRPC1 induces neuronal loss through a mechanism of TRPC1-mediated apoptosis.

Transient receptor potential channel 1; Neuron; C/EBP homologous protein; Caspase-3

1000- 4718(2016)04- 0686- 05

2015- 11- 20

2016- 02- 26

廣東省自然科學基金資助項目(No. 2014A030313715);深圳市科技研發基金基礎研究項目(No. JCYJ20130329103949650)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.04.017

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△通迅作者 許華 Tel: 020-38375022; E-mail: huax_mail@126.com; 楊細飛 Tel: 0755-25601914; E-mail: xifeiyang@gmail.com