MicroRNA-429靶向抑制occludin及對糖尿病小鼠腸上皮屏障功能的影響*

盧錫基，　于　濤，　夏忠勝，　單體棟，　歐陽慧，　許稷豪，　陳其奎

(中山大學孫逸仙紀念醫院消化內科，廣東 廣州 510120)

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MicroRNA-429靶向抑制occludin及對糖尿病小鼠腸上皮屏障功能的影響*

盧錫基，于濤，夏忠勝△，單體棟，歐陽慧，許稷豪，陳其奎

(中山大學孫逸仙紀念醫院消化內科，廣東 廣州 510120)

目的： 探討microRNA-429(miR-429)在體內對糖尿病(DM)小鼠腸上皮細胞(IECs)內閉合蛋白(occludin,Ocln)表達及腸上皮屏障功能的影響。方法: 構建糖尿病小鼠模型(腹腔內注射鏈脲佐菌素)；通過尾靜脈注射antagomiRNA-429抑制DM小鼠IECs內miR-429的表達；real-time PCR檢測miR-429和Ocln mRNA的表達變化；Western blotting及免疫組化檢測Ocln蛋白表達變化；氣相色譜法檢測小鼠尿液乳果糖/甘露醇比值；顯色基質鱟試劑法檢測小鼠血漿LPS濃度。結果: 尾靜脈注射antagomiRNA-429能顯著抑制DM小鼠IECs內miR-429的表達，注射后6 d恢復至正常小鼠IECs表達水平。抑制DM小鼠IECs內miR-429表達后，Ocln表達顯著提高(P<0.05)，小鼠尿液乳果糖/甘露醇比值及血漿LPS水平均明顯下降(P<0.05)。結論: AntagomiRNA-429能有效抑制DM小鼠IECs內miR-429的表達, 進而使小鼠IECs內Ocln的表達升高，從而使腸上皮屏障功能部分恢復。

糖尿病； MicroRNA-429； 閉合蛋白； 腸上皮屏障功能

MicroRNA(miRNA)是一類內源性非編碼小RNA分子，長度約為19～25個核苷酸，在生物體內主要參與轉錄后基因表達調控，從而參與生長發育、增殖分化與凋亡等一系列生命活動[1]。閉合蛋白(occludin,Ocln)是細胞間緊密連接的重要組成部分，其在緊密連接的結構和功能維持中均起著重要作用[2- 3]。我們過去研究發現[4]，糖尿病(diabetes mellitus，DM)小鼠腸上皮細胞(intestinal epithelial cells，IECs)內Ocln表達明顯低于正常小鼠，但其具體調節機制尚不明確。以往有研究發現，在炎癥性腸病也存在Ocln表達降低及腸上皮屏障功能障礙，而miRNA在其中起著重要調控作用[5- 6]。miRNA-429是miR-200家族的一個成員，其在細胞增殖、凋亡和腫瘤形成等過程中起著重要作用[7- 8]，但其在糖尿病腸病中的作用尚不清楚。本研究利用特異性miRNA抑制劑antagomiRNA-429降低miRNA-429的表達，觀察其對Ocln表達及腸上皮屏障功能的影響。

材　料　和　方　法

1動物

SPF級C57BL/6J小鼠32只，雌雄各半，6～8周齡，18～20 g，由中山大學實驗動物中心提供。IECs從小鼠小腸中分離提取。

2主要試劑

鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)及乳果糖、甘露醇購自Sigma；EDTA和DTT購自上海碧云天生物技術有限公司；Ocln、β-actin兔抗多克隆抗體及HRP標記山羊抗兔IgG(H+L)均購自CST；TRIzol?試劑盒購自Life Technology；miRNA專用逆轉錄試劑盒購自Clontech Laboratories;mRNA逆轉錄試劑盒和real-time PCR試劑盒購自TaKaRa；ECL試劑盒購自Santa Cruz；免疫組織化學試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司；顯色基質鱟試劑盒購自廈門鱟試劑實驗廠有限公司；其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純。AntagomiRNA-429由上海吉瑪制藥技術有限公司設計合成；miRNA逆轉錄及PCR所用引物由Clontech Laboratories設計合成，其余引物由上海生工生物工程技術服務有限公司根據設計合成；PCR擴增儀采用Bio-Rad的CFX96實時熒光定量PCR儀。

3主要方法

3.1DM小鼠模型的構建將32只C57BL/6J小鼠隨機分成2組，一組為DM組(26只)，另一組為正常對照(normal)組(6只)。DM組小鼠給予腹腔內注射STZ(70 mg/kg)，1天1次，連續注射5 d，normal組給予相同體積的0.1 mol/L檸檬酸緩沖液腹腔內注射。1周后測尾靜脈血隨機血糖，連續3次測量(每天1次，連續3 d)隨機血糖值大于16.7 mmol/L者為DM造模成功，造模成功率為92.3%(24/26，其中2只血糖值在12.0～16.7 mmol/L之間，未達到DM模型的標準)。

3.2DM小鼠尾靜脈注射antagomiRNA-429及分組在DM小鼠造模成功后第8周時，將上述DM組小鼠隨機分成2組，一組為antagomiRNA-429組(18只)，另一組為DM-NS組(6只)。 AntagomiRNA-429組：給予尾靜脈注射antagomiRNA-429(80 mg/kg)，1天1次，連續注射3 d，注射后第2、4、6天分別取6只小鼠作進一步研究；DM-NS組：給予尾靜脈注射生理鹽水0.2 mL，1天1次，連續注射3 d。另外，normal組小鼠不做任何處理。

3.3小鼠IECs的分離提取上述各組小鼠眼眶取全血，斷頸處死后，開腹并分離完整小腸(從幽門至回盲部)，沿縱軸切開小腸，留取1 cm空腸腸段用于下一步制備石蠟切片，余下腸組織用預冷的PBS清洗3遍，加入分離液I(PBS+30 mmol/L EDTA+1.5 mmol/L DTT)中，冰上放置20 min，之后將整段小腸轉移至分離液II(PBS+30 mmol/L EDTA)中，37 ℃孵育10 min，然后劇烈搖晃30 s，去除腸段，將剩余液體以2 500 r/min離心5 min，去上清，沉淀物即為分離的腸上皮隱窩和絨毛組織，收集沉淀物并置于-80 ℃以作進一步研究。

3.4腸黏膜組織學檢查取上述各組小鼠的小腸組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋并制備組織切片。切片組織常規脫蠟、水化，過氧化物酶阻斷劑避光孵育10 min，非免疫山羊血清封閉20 min，Ocln抗體(1∶250)4 ℃孵育過夜，Ⅱ抗室溫孵育1 h，鏈霉素抗生物素-過氧化物酶孵育10 min，DAB顯色5 min，PBS終止顯色，蘇木素復染30 s，脫水、封片后置于顯微鏡下觀察。

3.5Real-time PCR采用TRIzol?試劑盒分離純化上述各組IECs的總RNA，分光光度法測定計算提取的總RNA含量及濃度。各取0.5 μg總RNA，分別參照miRNA專用逆轉錄試劑盒和mRNA逆轉錄試劑盒實驗操作說明進行相應real-time PCR。然后進行real-time PCR擴增， PCR條件為：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共40個循環，樣本目的基因的相對表達率采用ΔΔCt方法計算，miR-429的表達以U6為內參照，Ocln的表達以18S rRNA為內參照。miR-429順義引物序列為5’-TAATACTGTCTGGTAATGCCG-3’，反義通用引物包含在miRNA專用逆轉錄試劑盒中；U6順義引物序列為5’-ACGCAAATTCGTGAAGCGTT-3’，反義通用引物包含在miRNA專用逆轉錄試劑盒中；Ocln上游引物為5’-CCTCCAATGGCAAAGTGAAT-3’,下游引物為5’-CTCCCCACCTGTCGTGTAGT-3’；18S rRNA上游引物為5’-GCTAGGAATAATGGAATAGG-3’,下游引物物 5’-ACT TTCGTTCTTGAGGAATG-3’。

3.6Western blotting每組各取總蛋白40 μg在12%的分離膠中進行SDS-PAGE分離，然后在冰上以200 mA恒流轉膜2 h，繼而用5%脫脂牛奶封閉2 h，加入相應Ⅰ抗(Ocln，1∶1 000；β-actin，1∶5 000),4 ℃孵育過夜，TBST洗膜10 min 3次，用過氧化物酶(HRP)標記的Ⅱ抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min 3次，曝光、顯影與定影。

3.7血漿LPS濃度測定將上述各組小鼠所取的全血置于含抗凝劑的離心管中，充分混勻后以3 000 r/min離心10 min，取血漿，參照顯色基質鱟試劑盒操作說明進行血漿LPS濃度測定。

3.824 h尿液乳果糖/甘露醇比值(lactulose/mannitol ratio, L∶M ratio)上述各組小鼠給予胃內灌注乳果糖(每只10 mg)和甘露醇(每只5 mg)，收集24 h尿液，用GC-9A氣相色譜儀檢測乳果糖及甘露醇濃度并計算其比值。

4統計學處理

用SPSS 19.0統計軟件進行分析。數據均采用均數±標準差(mean±SD)表示，兩組間均數比較采用獨立樣本的t檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，各組均數間的兩兩比較用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結　　果

1DM小鼠IECs高表達miR-429

DM小鼠IECs內miR-429的表達顯著高于正常小鼠IECs的表達(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.miR-429 expression in IECs from normal and DM mice. Mean±SD.n=6.#P<0.05vsnormal group.

圖1正常和DM小鼠IECs中miR-429的表達情況

2注射antagomiRNA-429后DM小鼠IECs中miR-429表達逐步降低

如圖2所示，經尾靜脈注射antagomiRNA-429后，DM小鼠IECs內miR-429的表達逐步降低(P<0.05)，并在注射后的第6天接近正常小鼠水平，因此我們選定這一天的小鼠來進行腸上皮組織提取用作下一步實驗。

Figure 2.The expression of miR-429 in IECs of DM mice after injection of antagomiRNA-429. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsDM-NS group;#P<0.05vsnormal group.

圖2經尾靜脈注射antagomir-429后DM小鼠IECs中miR-429的表達

3注射antagomiRNA-429后DM小鼠IECs中Ocln表達明顯升高

經尾靜脈注射antagomiRNA-429后第6天，antagomiRNA-429組小鼠IECs內Ocln的mRNA和蛋白表達量均明顯高于DM-NS組，差異具有統計學意義(P<0.05)。另外，Ocln主要表達在小鼠IECs的細胞膜上，尤其集中于腸腔面細胞連接處，而且antagomiRNA-429組小鼠IECs上的Ocln表達明顯高于DM-NS組,見圖3。

4注射antagomiRNA-429后DM小鼠血漿LPS濃度及尿液乳果糖/甘露醇比值均明顯降低

DM小鼠血漿LPS濃度遠高于正常小鼠。經尾靜脈注射antagomiRNA-429后第6天，antagomiRNA-429組小鼠血漿LPS濃度明顯低于DM-NS組(P<0.05)。DM小鼠尿液乳果糖/甘露醇比值顯著高于正常小鼠。經尾靜脈注射antagomiRNA-429后第6天，antagomiRNA-429組小鼠尿液乳果糖/甘露醇比值明顯低于DM-NS組，差異具有統計學意義(P<0.05),見圖4。

討　　論

閉合蛋白是細胞間緊密連接的重要組成部分，其在緊密連接的結構和功能維持中均起著重要作用。過去關于Ocln在腸屏障功能中作用的研究主要集中在腸道炎性疾病。Burewer等[9]的研究表明，在腸道炎性疾病中促炎因子IFN-γ和TNF-α可促使Ocln從胞膜轉移至胞質中并促進腸上皮細胞凋亡，從而使腸上皮細胞間緊密連接受損，破壞腸上皮屏障。王愛麗等[10]的研究發現，在大鼠腸道缺血再灌注損傷模型中，腸組織Ocln蛋白表達明顯降低，腸黏膜通透性增加。另外，Schumann等[11]報道了在難治性乳糜瀉的病人中也存在腸上皮細胞間緊密連接受損、腸上皮屏障功能障礙。在我們過去的研究中發現[4]，在DM小鼠中也存在腸上皮細胞內Ocln表達下降，腸上皮緊密連接受損，以及腸屏障功能障礙，但其調節因素尚待進一步研究。

Figure 3.The expression and distribution of Ocln in IECs of DM mice after injection of antagomiRNA-429 (immunohistochemistry,×400). Mean±SD.n=6.*P<0.05vsDM-NS group；#P<0.05vsnormal group.

圖3注射antagomiRNA-429后DM小鼠IECs中Ocln的表達及分布變化

Figure 4.The plasma LPS concentration (A) and 24 h urinary lactulose/mannitol ratio (B) of DM mice after injection of antagomiRNA-429. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsDM-NS group;#P<0.05vsnormal group.

圖4注射antagomiRNA-429后DM小鼠血漿LPS濃度及尿液乳果糖/甘露醇比值的變化

在本研究中，我們發現DM小鼠IECs中miR-429的表達較正常小鼠顯著升高，而且經生物信息學預測，Ocln可能為miR-429的調控靶點，為了進一步研究DM小鼠IECs中上調的miR-429與Ocln的表達及腸屏障功能的的關系，根據文獻[12]的方法我們構建了一種經特殊化學修飾的miR-429的拮抗劑——antagomiRNA-429，經尾靜脈注射antagomiRNA-429后DM小鼠IECs中miR-429的表達明顯下調，并且在注射后第6天恢復至正常小鼠的水平。在注射后第6天，DM小鼠IECs中Ocln的mRNA和蛋白表達均明顯升高，提示DM小鼠中miR-429表達上調可抑制Ocln的表達。

LPS普遍存在于革蘭氏陰性菌的菌壁中，在細菌受損或死亡時被釋放出來。眾所周知，人和動物腸道中均存在大量的細菌，這些細菌在受損或死亡時也會釋放出大量的LPS，在正常狀態下受制于腸屏障作用，僅有極少量LPS能透過腸上皮入血，而腸上皮細胞間緊密連接在此起著十分重要的作用。病理狀態下，腸上皮細胞間緊密連接受損導致腸屏障功能障礙，腸腔中的LPS經腸上皮細胞間隙大量入血，引起內毒素血癥，造成全身各器官組織損害。在過去的研究中[4]，我們發現DM小鼠腸道中需氧菌與厭氧菌的數量與正常小鼠并無顯著差異，因此，血漿LPS濃度可作為反映腸屏障功能改變的一個可靠指標。另外，在腸道中甘露醇是經細胞途徑吸收，而乳果糖是經細胞間途徑吸收，即通過細胞間緊密連接被動吸收，兩者均不易代謝而經腎臟排出。正常情況下乳果糖只有少量吸收入血，而在腸上皮細胞間緊密連接受損時，乳果糖大量吸收入血并從腎臟排出，而甘露醇的吸收基本不受影響，因此測定小鼠尿液中乳果糖/甘露醇比值是檢測小鼠腸道通透性的一個常用而可靠的指標。在本研究中，我們發現DM小鼠尿液乳果糖/甘露醇比值和血漿LPS濃度均顯著高于正常小鼠，而且經注射antagomiRNA-429后，DM小鼠中這2個指標均明顯降低，但仍高于正常小鼠水平，提示其腸屏障功能得以部分恢復，同時，這也反映了miR-429的高表達是造成DM小鼠腸屏障功能障礙的一個重要原因。

值得注意的是，盡管應用antagomiRNA-429抑制DM小鼠IECs內miR-429表達后，Ocln表達明顯升高，但其水平仍低于正常水平(P<0.05)，提示其表達還受到其它因素的調節，如炎癥因子、其它microRNA等，據我們所知，過去在這方面的研究主要集中在炎癥性腸病、腸易激綜合征、酒精性肝病等方面[9, 13-14]，而在糖尿病腸病中的研究少之又少。另一方面，雖然應用antagomiRNA-429后DM小鼠尿液乳果糖/甘露醇比值以及血漿LPS水平均明顯降低了，但仍明顯高于正常小鼠的水平，提示腸屏障功能并未完全恢復，究其原因，一方面可能是Ocln的表達同時還受到一些其它因素的影響，另一方面，其它緊密連接相關蛋白如ZO-1、Claudins、JAM等的表達也可能發生變化，從而影響腸屏障功能，因此，這方面的變化及其機制尚需進一步探索。

綜上所述，本研究首先發現了DM小鼠IECs內miR-429表達上調，并在體內應用antagomiRNA-429有效降低其表達水平, 進而使小鼠IECs內Ocln的表達升高，腸上皮屏障功能得到部分恢復，證實miR-429表達上調與DM小鼠腸上皮屏障功能障礙密切相關。

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(責任編輯： 盧萍， 羅森)

Effect of targeted inhibition of occludin by microRNA-429 on intestinal epithelial barrier function in diabetic mouse

LU Xi-ji, YU Tao, XIA Zhong-sheng△, SHAN Ti-dong, OUYANG Hui, XU Ji-hao, CHEN Qi-kui

(DepartmentofGastroenterology,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China.E-mail:xiazhsh@163.com)

AIM: To investigate the effect of microRNA-429 (miR-429) on the expression of occludin (Ocln) in intestinal epithelial cells (IECs) and intestinal epithelial barrier function in diabetic mice. METHODS: Diabetes mellitus mouse model was induced by intraperitoneal injection of streptozocin. The expression of miR-429 in IECs of diabetic mice was inhibited by antagomiRNA-429 injected via tail vein. The expression of miR-429 and mRNA expression of Ocln were detected by real-time PCR. The protein expression of Ocln was determined by Western blotting and immunohistochemistry. The urinary lactulose/mannitol ratio was measured by gas chromatography. The plasma LPS concentrations in the mice were measured by chromogenic end-point TAL kit. RESULTS: The results of real-time PCR confirmed that the expression of miR-429 in IECs of diabetic mice was remarkably inhibited by tail-vein administration of antagomiRNA-429, and resumed to similar level of normal mice on the 6th day after the administration. After suppressing the level of miR-429, the expression of Ocln in IECs of diabetic mice increased significantly (P<0.05), while the urinary lactulose/mannitol ratio and the plasma LPS concentration decreased obviously (P<0.05). CONCLUSION: AntagomiRNA-429 effectively suppresses miR-429 expression in IECs of diabetic mice, and then enhances the expression of Ocln and partially resumes the intestinal epithelial barrier function.

Diabetes mellitus; microRNA-429; Occludin; Intestinal epithelial barrier function

1000- 4718(2016)04- 0696- 05

2015- 11- 09

2016- 01- 20

國家自然科學基金資助項目(No. 81370475)

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A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.04.019

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