胰島素抵抗小鼠血清微小RNA的芯片及信息學分析*

徐志偉，　王文棟，　常曉彤

(河北北方學院醫學檢驗學院生化教研室，河北 張家口 075000)

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胰島素抵抗小鼠血清微小RNA的芯片及信息學分析*

徐志偉，王文棟，常曉彤△

(河北北方學院醫學檢驗學院生化教研室，河北 張家口 075000)

目的： 探討胰島素抵抗小鼠血清水平微小RNA(microRNAs)變化圖譜及相關microRNAs的可能作用機制。方法: 以高脂飼料喂養昆明小鼠，制備胰島素抵抗模型；以微陣列芯片技術分析胰島素抵抗小鼠及正常小鼠血清水平microRNAs變化圖譜并以實時熒光定量PCR進行驗證；以miRanda數據庫對差異microRNAs進行靶點基因預測；以miRBase數據庫獲得與胰島素抵抗相關的microRNAs序列；基于microRNAs序列，應用STRING在線分析工具(http://string.embl.de/)預測蛋白質相互作用關系。結果: 胰島素抵抗小鼠血清中miR-125、miR-126、miR-143、miR-30a、miR-199a、miR-127、miR-184、miR-30e、miR-134、miR-195、miR-206、miR-429、miR-212、miR-362、miR-382、miR-154和miR-466h表達顯著上調，miR-211、miR-504、miR-877和miR-1930顯著下調。與胰島素抵抗密切相關的miR-143可以結合脂肪量及肥胖相關蛋白(FTO)的3’-UTR，并且FTO與Rpgrip1l、Tmem18、Mc4r、Npy、Hhex、Tcf712、Cdkal1、Slc30a8、Igf2bp2和 Thada相互作用。結論: 在高脂飲食誘導的胰島素抵抗小鼠血清中有21種microRNAs相比正常小鼠出現了顯著變化，表達顯著上調的有17個。應用在線分析工具發現與胰島素抵抗密切相關的miR-143可以調節FTO蛋白表達，并且FTO與另外10種與糖尿病發生發展相關的蛋白相互作用，這將有助于對胰島素抵抗機制的全面了解。

胰島素抵抗； 微小RNA； 芯片； 信息學

胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是機體靶組織對胰島素反應低下的一種病理狀態，它與高胰島素血癥、糖耐量異常、脂代謝紊亂、高血壓和冠心病等疾病相關，是這些疾病的病理學基礎。編碼胰島素級聯信號中相關蛋白的基因多態性、基因失調、轉錄后修飾及相關蛋白質合成的調節參與了IR的發生[1]。

微小RNA(microRNAs)作為一類廣泛參與多種生理及病理過程的小分子非編碼RNA，通過結合mRNA 3’端非翻譯區(3’-untranslated region,3’-UTR)在轉錄后水平抑制蛋白的合成，是基因表達調控的重要成分，其顯著特點是具有高度的保守性、時序性和組織特異性。研究顯示，microRNAs與IR的發生密切相關，一些小組對胰島素作用的主要靶組織如肝臟、骨骼肌和脂肪組織中microRNAs變化圖譜進行了廣泛研究。Gallagher等[2]通過基因芯片技術發現2型糖尿病患者骨骼肌中有11個microRNAs異常表達;Ling等[3]在IR的3T3-L1脂肪細胞中發現表達水平降低50%以上的microRNAs共29個。

2008年以來，一系列研究報告了血漿或血清中microRNAs的穩定存在，并且表明，血漿或血清中microRNAs改變可以反映機體組織的生理或病理性改變[4]。多項研究均顯示了2型糖尿病患者血清或血漿microRNAs譜顯著不同于健康對照組[5-7]。但是，這些文獻沒有明確2型糖尿病患者是胰島素抵抗還是胰島功能低下，患病時間多長，也無法排除潛在的并發癥。為此，我們以高脂喂食的小鼠胰島素抵抗模型為研究對象，用微陣列芯片法分析了單純胰島素抵抗的小鼠血清microRNAs變化圖譜，并對顯著改變的microRNAs進行了生物信息學分析。

材　料　和　方　法

1動物和主要試劑

健康4周齡雄性昆明小鼠，體重(20±2)g，由首都醫科大學提供，生產許可證號為SCXK(京2014-0004)。

葡萄糖測定試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司)；胰島素ELISA測定試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司)； RNeasy Mini Kit、RNase-free DNase I、miScript Reverse Transcription反轉錄試劑盒和mi-Script SYBR Green PCR試劑盒(QIAGEN)； Flash-Tag? Biotin HSR RNA Labeling Kit、GeneChip WT Terminal Labeling Kit and Control Kit 和GeneChip Hybridization, Wash and Stain Kit(Affymetrix)。

2方法

2.1胰島素抵抗小鼠模型的建立實驗小鼠以高脂飼料(每100 g基礎飼料加入奶粉10 g，豬油10 g，白糖10 g，雞蛋1/3個，新鮮黃豆芽250 g)飼養3月后，按穩態模型評價法計算胰島素抵抗指數(homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR)，以HOMA-IR>2.15的小鼠為胰島素抵抗實驗動物[8]。以正常飼料喂養3個月的小鼠(n=10)作為正常對照小鼠，與胰島素抵抗模型小鼠(n=10)分別采集血清，進行microRNAs的芯片和信息學分析。

2.2血液收集及空腹血糖和血清胰島素水平的測定各實驗組小鼠空腹8 h后， 斷尾法采集小鼠尾血，離心(1 088×g/min，5 min)制備血清，用于血糖測定或-80 ℃保存用于胰島素測定及microRNAs分析。血糖測定用葡萄糖氧化酶法試劑盒，20 μL血清加3 mL 酶酚混合試劑，37 ℃保溫15 min, 以722分光光度計在505 nm處測定吸光度，按公式計算血糖濃度。胰島素測定采用小鼠胰島素酶聯免疫分析試劑盒，按試劑盒說明進行，分別在空白孔、標準孔、樣品孔加樣50 μL，37 ℃溫育30 min，洗滌拍干后，加入酶標液50 μL，空白孔除外，37 ℃溫育30 min，洗滌拍干。每孔加入顯色劑A、B各50 μL，37 ℃避光顯色10 min，每孔加終止液50 μL，酶標儀450 nm波長測定各孔的吸光度。

2.3采用Turner的穩態模型(HOMA-IR)[9]評價胰島素抵抗HOMA-IR=空腹血糖(mmol/L)×空腹血清水平胰島素(mIU/L)/22.5。

2.4血清microRNAs 芯片分析血清樣本送北京康普森生物技術有限公司對血清中microRNA進行芯片分析。(1)采用TRIzol法提取血清水平總RNA，并進一步對總RNA 進行過柱純化；(2)微量分光光度計檢測RNA的濃度和純度，1.5% 的甲醛變性凝膠檢測總RNA完整性；(3)Poly(A)加尾； (4)Flash Tag Biotin HSR 連接；(5)生物素標記；(6)芯片雜交(芯片規格為Affymetrix GeneChip miRNA 3.0 Array)；(7)芯片洗脫和掃描(GeneChip Scanner 3000 7G)；(8)應用GCOS 1.4軟件及miRNAQC tool進行數據處理和分析。

2.5實時熒光定量PCR驗證芯片結果針對芯片結果中顯著上調的mmu-miR-143和顯著下調的mmu-miR-877，應用miScript Reverse Transcription反轉錄試劑盒將其反轉錄為cDNA，37 ℃ 1 h, 95 ℃ 5 min, 應用miScript SYBR Green PCR 試劑盒在7300定量PCR儀(Applied Biosystem)檢測，每個樣本設3個復孔，所有反應重復3次。以Primer 5.0軟件設計引物，由上海生工生物工程有限公司合成。miR-30a的上游引物序列為5’-AGCCGTGTAAACATCCTCGAC-3’，下游引物序列為5’-CGCAGGGTCCGAGGTATTC-3’； miR-125的上游引物序列為5’-AGCGTCCCTGAGACCCTTTA-3’，下游引物序列為5’-CGCAGGGTCCGAGGTATTC-3’； miR-126的上游引物序列為5’-AGCGGGCATTATTACTTTTGGT-3’， 下游引物序列為5’-CGCAGGGTCCGAGGTATTC-3’； miR-143的上游引物序列為5’-TGAGATGAAGCACTGTAGCTC-3’, 下游引物序列為5’-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3’；miR-199a的上游引物序列為5’-AGCACCCAGTGTTCAGACTACCT-3’，下游引物序列為5’-CGCAGGGTCCGAGGTATTC-3’；miR-877的上游引物序列為5’-ACCGTAGAGGAGATGGCG-3’, 下游引物序列為5’-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3’；以U6作為內參照，其上游引物序列為5’-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3’， 下游引物序列為5’-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。反應條件為95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，40個循環。按照公式2-ΔΔCt計算microRNAs相對表達量。

2.6相關microRNAs的生物信息學分析應用miRanda(http://www.microrna.org/)數據庫對差異microRNAs進行靶點基因預測，選取每條 microRNA 相對的3′-UTR中排名前10位的基因作為候選靶點基因[10]，利用miRBase數據庫(http://www.mirbase.org/index.shtml)獲得相關microRNAs序列[11]。應用STRING在線分析工具(http://string.embl.de/)預測蛋白質相互作用關系[12]。

3統計學處理

應用微陣列數據顯著差異分析軟件(Significance Analysis of Microarray, SAM；http://www-stat.stanford.edu/～tibs/SAM/)配對分析兩種組織間的microRNAs 表達差異, 中位假基因檢出率(false disco-very rate, FDR)<0.05為有顯著差異。

結　　果

1正常和胰島素抵抗小鼠血清水平microRNAs 差異分析

芯片分析結果表明，與正常對照小鼠相比，胰島素抵抗小鼠血清水平有21個microRNAs 表達呈顯著差異，其中表達顯著上調者17個(表1)，顯著下調者4個(表2)。

表1胰島素抵抗小鼠血清中表達顯著上調的microRNAs

Table 1.Significantly up-regulated microRNAs in the serum of mice with insulin resistance (IR)

MicroRNAsExpressionquantityinIRmice Expressionquantityinnormalmicemmu-miR-466h4.085642.04419mmu-miR-30a3.671671.50237mmu-miR-1268.011443.92011mmu-miR-125a8.089223.67056mmu-miR-1438.648684.16767mmu-miR-1543.749911.35067mmu-miR-3824.576512.02187mmu-miR-3624.183501.46703mmu-miR-2124.551091.70931mmu-miR-4293.938741.04031mmu-miR-2066.085743.09831mmu-miR-1956.070512.94784mmu-miR-1346.255083.06701mmu-miR-30e7.382293.65052mmu-miR-1845.801861.41851mmu-miR-1277.203372.78526mmu-miR-199a6.992972.56691

表2胰島素抵抗小鼠血清中表達顯著下調的microRNAs

Table 2.Significantly down-regulated microRNAs in the serum of mice with insulin resistance (IR)

MicroRNAsExpressionquantityinIRmice Expressionquantityinnormalmicemmu-miR-5043.232687.33194mmu-miR-8772.894666.17390mmu-miR-19301.458993.68222mmu-miR-2114.434519.54351

2實時熒光定量PCR結果

進一步使用實時熒光定量PCR對與胰島素抵抗相關的血清水平miR-30a、miR-125、miR-126、miR-143、miR-199a及miR-877進行驗證。胰島素抵抗組miR-30a、miR-125、miR-126、miR-143和miR-199a的相對表達量分別為2.57±0.46、2.18±0.40、2.22±0.51、2.78±0.43和2.82±0.58，與健康組相比均顯著上調;miR-877的相對表達量為0.42±0.08，與健康組相比顯著下調。各種microRNAs實時熒光定量分析結果與芯片分析結果一致，見圖1。

Figure 1.Real-time PCR results of miR-30a, miR-125, miR-126, miR-143, miR-199a and miR-877 expression in the serum of mice.IR: insulin resistance. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsnormal (N).

圖1小鼠血清miR-30a、miR-125、miR-126、miR-143、miR-199a、miR-877表達量的實時熒光定量PCR驗證結果

3相關靶點基因預測

采用miRanda數據庫對差異表達microRNAs進行靶基因預測，結果見表3。由于目前已經確定的microRNAs靶基因數量有限，mmu-miR-126、mmu-miR-125a、mmu-miR-127、mmu-miR-199a和mmu-miR-362 未預測到其靶基因。

4MicroRNAs序列

應用miRBase數據庫獲取相關microRNAs序列，見表4。

5MicroRNAs調節蛋白及蛋白相互作用的預測

應用在線分析工具STRING發現miR-143可以結合脂肪量及肥胖相關蛋白(fat mass and obesity-associated protein，FTO)的3’-UTR，FTO是一個與脂肪量和肥胖相關的酶[13]，它與另外10個蛋白Rpgrip1l、Tmem18、Mc4r、Npy、Hhex、Tcf712、Cdkal1、Slc30a8、Igf2bp2和Thada相關，這些蛋白增加了糖尿病發生和發展的風險。以FTO為中心預測的這些蛋白的相互作用關系見圖2。

表3　差異表達microRNAs的主要靶基因

表4血清胰島素抵抗相關microRNAs的序列

Table 4.Sequences of serum microRNAs associated with insulin resistance

MicroRNAsSequences(5’-3’)mmu-miR-466hUGUGUGCAUGUGCUUGUGUGUAmmu-miR-30aUGUAAACAUCCUCGACUGGAAGmmu-miR-126CAUUAUUACUUUUGGUACGCGmmu-miR-125aUCCCUGAGACCCUUUAACCUGUGAmmu-miR-143GGUGCAGUGCUGCAUCUCUGGUmmu-miR-154AAUCAUACACGGUUGACCUAUUmmu-miR-382AAGUUGUUCGUGGUGGAUUCGmmu-miR-362AAUCCUUGGAACCUAGGUGUGAGUmmu-miR-212ACCUUGGCUCUAGACUGCUUACUmmu-miR-429UAAUACUGUCUGGUAAAACCGUmmu-miR-206UGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGGmmu-miR-195UAGCAGCACAGAAAUAUUGGCmmu-miR-134UGUGACUGGUUGACCAGAGGGGmmu-miR-30eUGUAAACAUCCUUGACUGGAAGmmu-miR-184UGGACGGAGAACUGAUAAGGGUmmu-miR-127CUGAAGCUCAGAGGGCUCUGAUmmu-miR-199aCCCAGUGUUCAGACUACCUGUUCmmu-miR-504AGACCCUGGUCUGCACUCUAUCmmu-miR-877GUAGAGGAGAUGGCGCAGGGmmu-miR-1930ACCUCCAUAGUACCUGCAGCGUmmu-miR-211UUCCCUUUGUCAUCCUUUGCCU

討　　論

Chen等[5]通過比較健康個體和糖尿病患者，發現糖尿病患者血清存在42種表達有差異的microRNAs。Zampetaki 等[7]在一個大型前瞻性研究中，基于比較受試者的血漿microRNAs，發現糖尿病患者有13種microRNAs 的表達與健康人不同。我們以Affymetrix的GeneChip miRNA 3.0 Array芯片分析顯示，胰島素抵抗小鼠血清中有21種microRNAs 顯著不同于正常對照小鼠，其中17種顯著上調，4種顯著下調。在顯著差異的21種microRNAs中，沒有紅細胞特有的miR-16 和 miR-451[14]，提示本研究中小鼠血清21種顯著差異的microRNAs 沒有受到溶血的影響。

Figure 2.FTO interaction network

圖2FTO及相關蛋白的相互作用

目前，與胰島素抵抗相關的microRNAs 已報道多種，主要基于對某組織的研究結果，與肝臟胰島素抵抗相關的有miR-29、miR-96、miR-33a/b、miR-181a、miR-122、miR-125、miR-126、miR-143、miR-802，與脂肪組織相關的有miR-93、miR-143、miR-221和miR- 223，與骨骼肌相關的有miR-135[15-16]。在2型糖尿病患者血漿的miR-199a[16]、miR-9、miR-29a、miR-30d、miR34a、miR-124a、miR-146a[6]、miR-28-3p[7]也顯著上調，miR-15a、miR-29b和miR-223下調[7]。

本研究中，未發現miR-9、miR-29、miR-30d、miR-122、miR-96、miR-181a、miR34a、miR-124a、miR-146a、miR-28-3p、miR-802和miR-135在胰島素抵抗小鼠血清中存在顯著差異，但是，本研究中miR-125、miR-126、miR-143、miR-30a和miR-199a 顯著上調。另外12種顯著上調的和4種顯著下調的microRNAs 未見與胰島素抵抗相關的報道，原因不清，或許與研究對象、臨床患者的其它并發癥、胰島素抵抗的病理學機制及病程的不同有關。

關于microRNAs引起胰島素抵抗的作用機制，相關報道有限。有文獻報道，miR-126通過下調胰島素受體底物1(insulin receptor substrate-1，IRS-1)蛋白表達誘導胰島素抵抗，IRS-1將胰島素信號從胰島素受體傳至細胞內的磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)，是胰島素信號傳導通路上的關鍵分子[16]。miR-199a可以結合廣泛分布于脂肪細胞和肌肉細胞的胰島素敏感的葡萄糖轉運體4(glucose transporter 4，GLUT4)的3’-UTR，降低GLUT4表達，參與了胰島素抵抗[17]。

miR-143是與胰島素抵抗關系密切的micro-RNAs之一，在高脂飲食的肥胖小鼠腸系膜和肝臟高表達，與體重及腸系膜脂肪重量相關，利用轉基因技術將miR-143過表達，小鼠表現為糖耐量異常和胰島素抵抗，進一步的研究指出 miR-143通過作用于IRS-1-PI3K-PKB/Akt信號通路中的某些分子，參與小鼠肝細胞的胰島素抵抗[18-20]。在我們的研究中，應用在線分析工具STRING發現miR-143可以結合FTO的3’-UTR。FTO蛋白是一種核酸修復酶，有研究發現FTO在骨骼肌等外周組織高表達[21]，可以通過多種途徑參與肥胖及2型糖尿病等相關疾病的發生[22-23]。以FTO為中心預測了它與另外10個與糖尿病發生和發展相關的蛋白Rpgrip1l、Tmem 18、Mc4r、Npy、Hhex、Tcf712、Cdkal1、Slc30a8、Igf2bp2和 Thada的相互作用，對這些蛋白的研究將有助于胰島素抵抗機制的全面了解。

本文基于miRanda數據庫對另外一些差異表達microRNAs的靶基因預測表明這些microRNAs也存在多個靶基因位點。多靶位點存在有助于一個microRNA經濟地調控多個基因的表達[24]。

總之，本研究以微陣列芯片方法表明，在高脂飲食誘導的胰島素抵抗小鼠血清中有21種microRNAs相比正常小鼠出現了顯著變化，17種顯著上調，4種顯著下調。其中，有報道與胰島素抵抗相關的microRNAs包括miR-125、miR-126、miR-143、miR-30a和miR-199a。應用miRBase 數據庫獲取了相關microRNAs的序列；基于這些microRNAs的序列，應用在線分析工具發現與胰島素抵抗密切相關的miR-143可以結合FTO，并且預測了FTO與另外10種相關蛋白的相互作用，這將有助于對胰島素抵抗機制的全面了解。

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(責任編輯： 盧萍， 羅森)

Chip and informatic analysis of serum microRNA levels in insulin-resis-tant mice

XU Zhi-wei, WANG Wen-dong, CHANG Xiao-tong

(DepartmentofBiochemistry,CollegeofLabMedicine,NorthUniversityofHebei,Zhangjiakou075000,China.E-mail:changxt1212@vip.sina.com)

AIM: To study the microRNA profiling in the serum of insulin-resistant mice and the mechanism of insulin resistance induced by related microRNAs. METHODS: A high-fat diet was used to induce insulin resistance model in KM mice. The microRNA profiling in serum of insulin-resistant and normal mice was analyzed by microarray chip and were validated by real-time PCR. miRanda data base was used to forecast target genes. miRBase was used to obtain the sequences of related microRNAs, based on which protein interactions were predicted using the online analytical tool STRING. RESULTS: In serum of insulin-resistant mice, the expression of miR-125, miR-126, miR-143, miR-30a, miR-199a, miR-127, miR-184, miR-30e, miR-134, miR-195, miR-206, miR-429, miR-212, miR-362, miR-382, miR-154 and miR-466h was significantly up-regulated. miR-211， miR-504， miR-877 and miR-1930 were significantly down-regulated. miR-143 associated with insulin resistance was able to bind to 3’-UTR of fat mass and obesity-associated protein (FTO), and FTO was found to interact with Rpgrip1l, Tmem18, Mc4r, Npy, Hhex, Tcf712, Cdkal1, Slc30a8, Igf2bp2 and Thada. CONCLUSION: Twenty-one microRNAs in the serum of insulin-resistant mice induced by a high-fat diet are significantly different from those of normal mice, in which 17 kinds were significantly up-regulated. miR-143 closely related to insulin resistance is able to regulate FTO protein expression, which interacts with other 10 proteins associated with the occurrence and development of diabetes. The results are also useful for further study of the molecular mechanisms in insulin resistance.

Insulin resistance; MicroRNAs; Chip; Informatics

1000- 4718(2016)04- 0738- 07

2015- 08- 07

2016- 02- 29

張家口市科技局項目(No. 12110065G-5);河北省教育廳項目(No.QN2016175)

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R363.1+4

A

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