AFT024-SCF細胞系的構建及其生物學功能鑒定*

李　陳，　陸　英，　楊　丹，　汪　穎，　薛　淼，　張祥忠△

(1中山大學附屬第三醫院血液內科，廣東 廣州 510630； 2安徽大學，安徽 合肥 230000)

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AFT024-SCF細胞系的構建及其生物學功能鑒定*

李陳1，陸英1，楊丹1，汪穎2，薛淼1，張祥忠1△

(1中山大學附屬第三醫院血液內科，廣東 廣州 510630；2安徽大學，安徽 合肥 230000)

目的： 構建AFT024-SCF和HPC-Lhx2細胞系，并用HPC-Lhx2細胞系鑒定AFT024-SCF細胞系的生物學功能。方法: 采用逆轉錄病毒感染法構建干細胞因子(stem cell factor, SCF)依賴的永生化造血干/祖細胞(hematopoietic stem/progenitor cell, HPC)-Lhx2細胞系和小鼠胎肝基質細胞系AFT024-SCF及其不含目的基因的對照組細胞系AFT024-GFP。采用real-time PCR法及Western blot法鑒定此AFT024-SCF細胞系中SCF的表達。ELISA法鑒定AFT024-SCF上清液中SCF的表達。收集AFT024-SCF及AFT024-GFP細胞培養上清液并以1∶10與IMDM基礎培養基混合備用。以AFT024-SCF組上清液為實驗組，AFT024-GFP組上清液為內源性陰性對照組，無任何添加的IMDM基礎培養基為外源性陰性對照組，添加重組SCF的IMDM培養基為陽性對照組，分別與HPC-Lhx2 細胞系共培養72 h。MTT法檢測各組HPC-Lhx2細胞增殖活性，集落形成實驗鑒定HPC-Lhx2細胞系擴增后的細胞干性。結果: 構建的AFT024-SCF細胞系表達SCF;HPC-Lhx2細胞系體外培養72 h后，外源性及內源性陰性對照組未能維持HPC-Lhx2細胞增殖;而陽性對照組及實驗組均可促進HPC-Lhx2細胞增殖;陽性對照組及實驗組細胞均有集落形成單位，且差異無統計學意義，陰性對照組無集落形成單位。結論: 成功構建表達SCF的AFT024-SCF細胞系，其培養上清液能夠替代重組SCF用于HPC-Lhx2細胞系的體外擴增。

AFT024-SCF細胞系; 干細胞因子； 造血干/祖細胞； HPC-Lhx2細胞系

造血干細胞(hematopoietic stem cells, HSCs)是一群具有自我更新和定向分化潛能的多能干細胞，HSC移植已被廣泛地應用于血液系統惡性腫瘤、骨髓衰竭性疾病及一些先天性疾病等的臨床治療[1]。進行體外擴增培養HSC是目前重要的基礎研究熱點之一[2]。大量實驗數據表明，造血干/祖細胞(hematopoietic stem/progenitor cell, HPC)的體外擴增主要依賴細胞因子[3]。而在這些細胞因子中，干細胞因子(stem cell factor, SCF)起著至關重要的作用。目前體外培養HSC的所有細胞因子組合幾乎都包含SCF[4]。SCF是迄今為止發現的作用于HSC最早期階段的細胞因子。SCF能通過與c-Kit結合向細胞內傳遞信號，啟動早期HPC的分裂和增殖，使細胞進入細胞周期，開始擴增[5]。另外，SCF還可以與其它細胞因子協同作用促進造血各系前體細胞的增殖與分化[6]。因此，研究優化HSC體外擴增體系,細胞因子SCF必不可少。

AFT024是一種來源于小鼠胎肝的基質細胞系，與HSC共培養時能夠在體外較長時間維持HSC干性[7]，說明其在HSC的體外干性維持中發揮著一定的作用。AFT024能夠體外維持小鼠HSC干性達 4～7周之久，并且此體外培養的HSC在移植后能夠重建受體小鼠的造血系統，與未經體外培養的新鮮HSC移植效果相似[8]。基于以上理論，我們利用實驗室現有條件，以小鼠細胞系為模型，將小鼠SCF基因導入AFT024中，構建出可分泌SCF的AFT024-SCF細胞系。Lhx2基因為LIM同源框基因家族的一員，在小鼠多能干細胞或骨髓中過表達Lhx2基因可建立SCF依賴的永生化細胞系HPC-Lhx2， HPC-Lhx2細胞系生物學特性與HSC十分相似，是體外研究HSC生物學特性較理想的細胞模型[9]。因此，本實驗中我們建立HPC-Lhx2細胞系，并收集AFT024-SCF細胞系上清液用于培養HPC-Lhx2，觀察后者擴增情況，以評估新構建的AFT024-SCF細胞系生物學功能。并為后續建立和優化體外擴增HSC的體系奠定基礎。

材　料　和　方　法

1細胞系及主要試劑

1.1動物C57BL/6小鼠，6～8周齡，購自北京維通利華公司。

1.2細胞、菌株及質粒AFT024細胞系購自ATCC；兔抗小鼠多克隆抗體、羊抗兔IgG購自Santa Cruz；ExTaq熱啟動DNA聚合酶、限制性內切酶均購自TaKaRa；連接酶和質粒小量提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；Reverse Transciptase、TRIzol試劑均購自Invitrogen；重組小鼠SCF、IL-6均購自PeproTech；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、2-巰基乙醇(MTG)購自Gibco；高糖DMEM、IMDM、含丙酮酸鈉的高糖DMEM、MTG、青/鏈霉素(P/S)混合液、胰酶均購自Life Technologies。小鼠集落形成單位(colony forming unit, CFU)半固體培養基購自Stem Cell。MTT試劑盒購自碧云天公司。SCF/MGF ELISA試劑盒購自CUSABIO。

2方法

2.1pMYs-Lhx2-GFP、pMYs-SCF-GFP載體的構建由于小鼠SCF、Lhx2分別高表達于小鼠肺、胚胎組織中。故我們分離出小鼠肺、胚胎組織，以TRIzol法提取其RNA并逆轉錄后獲得SCF及Lhx2的cDNA模板。PCR擴增獲得帶有酶切序列的目的基因片段，將PCR產物和逆轉錄病毒載體pMYs-IRES-GFP分別雙酶切后進行連接，轉化DH5α感受態細胞，最后提取質粒進行測序鑒定。

2.2AFT024-SCF細胞系構建Plat-E細胞包裝病毒，收集處于對數生長期的AFT024細胞，按每孔3.5×104個接種于6孔板中，培養24 h進行病毒感染。感染后繼續培養12 h更換新鮮培養基。24 h后進行二次感染。

2.3Real-time PCR檢測SCF mRNA的表達水平細胞二次感染48 h后，熒光顯微鏡下觀察GFP陽性細胞比例。收集106個AFT024-GFP及AFT024-SCF細胞分別置于TRIzol中裂解并提取總RNA，經逆轉錄合成cDNA。Real-time PCR檢測SCF mRNA的相對表達量。反應條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s，共40個循環。依據公式2-ΔΔCt計算出SCF的相對表達量，其中GAPDH作為內參照。具體引物序列見表1。

表1　引物序列

2.4Western blot檢測SCF蛋白表達水平收集AFT024-GFP及AFT024-SCF細胞，細胞裂解液中裂解并提取上清液，加SDS上樣緩沖液98 ℃煮樣變性以制備蛋白。上樣后經SDS-PAGE分離，接著轉移至PVDF膜。將目的條帶置于含5%BSA的TBST溶液中室溫封閉1 h。棄去封閉液后分別加入SCF(1∶1 000)和GAPDH(1∶5 000)Ⅰ抗， 4 ℃孵育12 h。TBST溶液洗滌3次，加入Ⅱ抗(1∶5 000)室溫孵育90 min，TBST溶液洗滌3次后，X光片壓片、顯影、定影。最后分光光度儀分析蛋白含量。

2.5ELISA實驗測定AFT024-SCF上清中SCF濃度收集AFT024-SCF及AFT024細胞約80%～90% 密度時的上清液，準備未曾使用的新鮮AFT024培養基作為空白對照。分別設空白對照組(AFT024培養基稀釋1×104倍)，陰性對照組(AFT024上清液稀釋1×104倍)，陽性對照組(添加1 mg/L SCF 的AFT024培養基稀釋1×104倍),實驗組(AFT024-SCF上清液稀釋1×104倍)。按CUASIBIO SCF/MGF ELISA試劑盒操作說明進行檢測，最終分別測定各組在450 nm波長處的吸光度(A)值，從而獲得各組的SCF濃度。

2.6建立HPC-Lhx2細胞系方法參照Pinto等[10]實驗中HPC-Lhx2細胞系的構建方法。將5-氟尿嘧啶注入C57BL/6小鼠腹腔內，富集小鼠骨髓HPC。3 d后處死小鼠，收集HPC按每孔5×106個接種于6孔板，使用IMDM基礎培養基(IMDM+10% FBS+1.5×10-4mol/L MTG )+100 μg/L SCF+10 μg/L IL-6預刺激24 h。Plat-E細胞包裝病毒，獲得Lhx2組及GFP對照組逆轉錄病毒上清。將細胞按每孔2×106個加入6孔板進行病毒感染，后吸去病毒上清并添加新鮮預熱培養基(IMDM +5% FBS+1.5×10-4mol/L MTG +100 μg/L SCF)接著培養24 h，重復感染1次。二次感染后，細胞繼續培養6 周。

2.7不同培養基培養HPC-Lhx2細胞系將AFT024-SCF及AFT024-GFP接種于100 mm盤，待細胞密度至80%～90% 時收集上清液。將所得上清液分別與IMDM基礎培養基以1∶10混合。收集培養的HPC-Lhx2細胞，以1×108/L分別重懸于4組培養基培養(IMDM基礎培養基、IMDM基礎培養基+100 μg/L SCF、IMDM基礎培養基+ AFT024-GFP上清、IDMI基礎培養基+ AFT024-SCF上清)。將4組細胞混懸液分別置于96 孔板和24 孔板培養。96 孔板每組5 個重復孔，每孔加入200 μL細胞懸液，即每孔2×104個細胞，培養72 h后評估細胞增殖活性。24孔板每組3 個復孔，每孔加入2 mL細胞混懸液，即每孔2×105個細胞，培養72 h后收集細胞并進行細胞計數。

2.8MTT法評估細胞增殖活性96孔板細胞體外培養72 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，孵育4 h后離心棄上清液。接著每孔加入200 μL DMSO，后用酶標儀測定490 nm波長處的A值。

2.9集落形成實驗評估擴增HPC-Lhx2細胞干性24孔板細胞收集計數后以3×107/L重懸。重懸后細胞每孔用1 mL注射器取100 μL，即約3 000個細胞置于1 mL CFU半固體培養基中，渦旋振蕩器振蕩混勻后置于35 mm盤中培養7～14 d后觀察集落形成情況，進行總集落的計數及各系集落計數。

3統計學處理

用SPSS 20.0及GraphPad 5.0對數據進行統計學處理，計量資料用均數±標準差(mean±SD)表示，兩組獨立樣本比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni法，以P<0.05為差異有統計學意義。

結　　果

1pMYs-SCF-IRES-GFP和pMYs-Lhx2-IRES-GFP逆轉錄病毒載體的構建

pMYs-SCF-IRES-GFP載體經EcoR I和XhoI酶切，pMYs-Lhx2-IRES-GFP載體經EcoR I和BamH I酶切后，瓊脂糖凝膠電泳顯示載體中重組目的片段被分離，且片段大小與基因大小符合。SCF大小為822 bp，Lhx2大小為1 098 bp，見圖1。挑選質粒測序完全匹配，實驗結果表明逆轉錄載體構建成功。

Figure 1.Constructed retrovirus vectors identified by double enzyme digestion. 1: marker (2 000 bp); 2: pMYs-SCF-IRES-EGFP plasmid was digested byEcoR I andXhoI; 3: pMYs-Lhx2-IRES-GFP plasmid was digested byEcoR I andBamH I.

圖1逆轉錄病毒載體的雙酶切鑒定

2AFT024-SCF細胞系建立及其上清液中SCF檢測

pMYs-SCF-IRES-GFP逆轉錄病毒載體含有綠色熒光報告基因GFP，可用以觀察、評估感染效率。熒光倒置顯微鏡觀察感染24 h后的細胞，可以觀察到綠色熒光。感染48 h時GFP表達最理想，為100%。帶有目的基因載體組和空載對照組GFP感染率沒有明顯差異。以real-time PCR法檢測SCF在AFT024細胞系中的mRNA表達，結果表明AFT024-SCF中SCF的表達量明顯比對照組AT024-GFP組高(P<0.01)。以Western blot法檢測SCF在AFT024-SCF細胞系中的蛋白表達, 結果顯示只在AFT024-SCF細胞中檢測到SCF。以ELISA實驗檢測AFT024-SCF上清中SCF的蛋白表達，減去空白孔A值后可見實驗組與陽性對照組A值接近，陰性對照組A值極低，可忽略不計。測得陽性對照組SCF濃度約為(99.49±6.93) ng/L， 實驗組SCF濃度約為(101.50±6.18) ng/L，兩組差異無統計學意義。ELISA實驗結果證明AFT024-SCF能夠分泌SCF至上清液中，見圖2。

Figure 2.Construction and identification of AFT024-SCF cell line(×100).Mean±SD.n=3.**P<0.01vsAFT024-GFP group.

圖2AFT024-SCF細胞系構建及鑒定

3HPC-Lhx2細胞系的建立

pMYs-Lhx2-IRES-GFP逆轉錄病毒載體同樣含有GFP，感染細胞48 h后用熒光倒置顯微鏡觀察可見部分細胞發綠色熒光。Lhx2組和GFP對照組的GFP感染率沒有明顯差異。經過體外培養6 周，GFP對照組只有貼壁細胞生長，HPC-Lhx2組仍然有大量懸浮生長的血細胞，表明HPC-Lhx2細胞系建立成功，見圖3。

Figure 3.Construction of SCF-dependent HPC-Lhx2 cell line (×100). A: enriched bone marrow (BM) cells infected with GFP (white light); B: enriched BM cells infected with GFP (green light); C: enriched BM cells infected with Lhx2 (white light); D: enriched BM cells infected with Lhx2 (green light); E: BM-GFP cells were failed cultured for 6 weeksinvitro(white light); F: HPC-Lhx2 cells were successfully cultured for 6 weeksinvitro(white light).

圖3構建依賴SCF的HPC-Lhx2細胞系

4MTT法測定體外培養HPC-Lhx2的細胞增殖活力，集落形成實驗鑒定所擴增HPC-Lhx2細胞的干性

陽性對照組及AFT024-SCF上清培養組與IMDM對照組的MTT結果比較均有差異(P<0.05)，而AFT024-GFP上清培養組與IMDM對照組的MTT結果比較無顯著差異,見圖4。陽性對照組及實驗組培養基培養72 h的HPC-Lhx2均能形成克隆，陽性對照組共約90個，實驗組共約86個,以粒細胞-巨噬細胞集落占大多數，且2組各系集落數差異均無統計學意義,兩組陰性對照均無克隆形成,見圖5、表2。實驗結果表明以1∶10稀釋AFT024-SCF上清配制的培養基完全可以代替IMDM添加100 μg/L SCF的培養基。

討　　論

1構建的AFT024-SCF細胞系能夠表達SCF

在小鼠造血發育過程中，造血生成的位置是不斷變化的，由最初的卵黃囊(yolk sac, YS)造血，到主動脈-中腎-性腺區(aorta-gonad-mesonephros region，

Figure 4.The proliferation of HPC-Lhx2 cells in different medium. Negative control: IMDM basic medium; positive control: IMDM basic medium with 100 μg/L SCF; AFT024-GFP(1∶10): IMDM basic medium with 10% AFT024-GFP supernatant; AFT024-SCF(1∶10): IMDM basic medium with 10% AFT024-SCF supernatant.Mean±SD.n=3.**P<0.01vsnegative control).

圖4HPC-Lhx2細胞在不同培養基中的增殖情況

AGM)造血，再到胎肝造血以及出生后的骨髓造血[11]。胎肝中的HSC大量擴增以提供足夠數量的HSC儲備。但在此時期之前的AGM區及之后的骨髓中HSC通常情況下均處于一個休眠狀態。因此要研究HSC擴增，我們聚焦于胎肝期HSC。胎肝期HSC的擴增可能受兩方面因素影響，即HSC本身的細胞自主機制及胎肝微環境細胞的非自主機制。而研究表明促進其自我更新及擴增的分子信號主要可能源于胎肝微環境[12]。有學者將胎肝微環境中的基質細胞分離出來建立成基質細胞系并進行體外擴增HSC實驗，結果發現分離出的200多種基質細胞系中，命名為AFT024的細胞系體外維持小鼠HSC的能力最強。其能夠體外維持HSC達 4～7 周之久，在移植后其仍然能夠重建受體造血系統，并且與未經培養的新鮮HSC移植效果相似[8]。目前研究表明，AFT024細胞系用于體外擴增HSC主要有以下優點：(1)能夠為HSC的自我更新和定向分化提供均衡的細胞微環境；(2)在不依賴其它微環境因素情況下，來自AFT024的單獨信號已經足以體外維持HSC干性一段時間；(3)這種維持HSC干性的機制具有進化保守性，不僅可以體外維持鼠的HSC干性較長時間，還能體外維持人的HSC干性[13-14]。綜上所述，AFT024是體內外擴增HSC微環境中一個重要的細胞組成部分，目前，對于HSC維持其干細胞特性的機制以及造血微環境對HSC的影響仍有待進一步研究，而小鼠胎肝基質細胞AFT024細胞系正是研究后者比較理想的實驗材料之一。據文獻[15]報道，將SCF導入小鼠骨髓基質細胞，可在骨髓基質細胞及其上清液中檢測到SCF表達，且其上清液可協同GM-CSF刺激骨髓細胞集落生長，證明其具有生物學活性。目前并未有將SCF導入AFT024細胞系的報道，而AFT024作為具有相似于骨髓基質細胞的細胞系，構建AFT024-SCF對于體外培養HSC有著一定意義。因此，本實驗以上述文獻報道為理論基礎，將SCF導入AFT024，構建成為新的AFT024-SCF細胞系。用real-time PCR和Western blot分別在mRNA及蛋白水平證明此細胞系可表達SCF基因。并用ELISA實驗證明AFT024-SCF可分泌SCF至上清液中。為今后進一步研究基質細胞與細胞因子對于HSC體外干性維持的作用提供了較好的實驗材料，避免了長期培養時外源性添加SCF所造成的SCF濃度的較大幅度波動。

Figure 5.The morphology of CFU of HPC-Lhx2 cells in different medium(×50). A: granulocyte colony of AFT024-SCF group; B: macrophage colony of AFT024-SCF group ; C: granulocyte-macrophage colony of AFT024-SCF group; D: granulocyte colony of control group; E: macrophage colony of control group ; F: granulocyte-macrophage colony of control group.

圖5不同培養基培養的HPC-Lhx2形成的CFU形態無明顯差異

表2培養后的HPC-Lhx2在CFU實驗中形成的克隆數

Table 2.Colony numbers formed by cultured HPC-Lhx2 cells in colony forming experiment (Mean±SD.n=3)

GroupGMGMPositivecontrol3.33±0.336.33±0.3377.33±3.18AFT024-SCF(1∶10)3.67±0.336.00±0.5778.00±2.08AFT024-GFP(1∶10)000Negativecontrol000

G: granulocyte colony; M: macrophage colony; GM: granulocyte-macrophage colony.

2采用HPC-Lhx2細胞系證明了AFT024-SCF所分泌上清液中含有生物活性的SCF

HPC-Lhx2是一種SCF依賴的造血干/祖細胞系，生物學特性與正常的HSC相似。HPC-Lhx2細胞系能夠在SCF存在的情況下持續擴增，并且培養7 個月以上不發生明顯分化。在基質細胞的支持下可形成鵝卵石區域，具有長期培養起始細胞(long-term culture-initiating cells，LTC-IC)的特點[10]。研究表明使用特定細胞因子及細胞因子組合的體外培養體系培養HPC-Lhx2細胞系與培養HSC效果相似[16]。鑒于它易于獲得及培養，可以作為HSC的細胞模型用于基礎實驗研究。我們利用構建的HPC-Lhx2細胞系鑒定AFT024-SCF的上清液中是否具有類似SCF作用的生物活性物質。收集AFT024-SCF及AFT024-GFP細胞培養上清液并以1∶10與IMDM基礎培養基混合備用。以AFT024-SCF組上清液為實驗組，AFT024-GFP組上清液為內源性陰性對照組，無任何添加的IMDM基礎培養基為外源性陰性對照組，添加重組SCF的IMDM培養基為陽性對照組，分別與HPC-Lhx2 細胞系培養72 h。結果顯示：外源性及內源性陰性對照組未能維持HPC-Lhx2細胞增殖，而陽性對照組及實驗組均可促進HPC-Lhx2細胞增殖。且集落形成實驗中培養72 h的實驗組HPC-Lhx2所形成的各系克隆數與陽性對照組相似，差異無統計學意義，而2組陰性對照均無克隆形成。由此我們認為AFT024-SCF上清液可以替代昂貴的商業化基因工程重組SCF。這為體外擴增HSC、研究其功能及調控機制提供了非常好的實驗支持材料。另外，結果顯示實驗組較陽性對照組擴增效果稍優,而我們陽性對照組所添加的SCF濃度100 μg/L是據文獻報道所使用的擴增HPC-Lhx2較為理想的濃度[9],這可能是其中SCF濃度更為合適，或者是AFT024-SCF細胞生成的其它物質與SCF產生了協同作用。現在已有實驗提示AFT024細胞的Dlk/pref-1基因表達產物對維持擴增HSC具有重要影響[17]。后續我們將檢測AFT024-SCF上清液的SCF蛋白含量及分析其它細胞因子組成以進一步闡明其維持擴增HSC的機制，并可進行AFT024-SCF與HSC共培養實驗，觀察基質細胞系與細胞因子共同作用是否更有利于HSC的體外培養。

綜上所述，本研究采用逆轉錄病毒感染技術，成功建立了小鼠HPC-Lhx2細胞系和AFT024-SCF細胞系。以HPC-Lhx2細胞系作為HSC細胞模型，我們證實了AFT024-SCF細胞系不僅能夠表達SCF，而且還可能分泌釋放有生物學活性的SCF到培養上清液中。這為后續體外擴增HSC及HSC功能和調控機制的研究奠定了實驗基礎。

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(責任編輯： 林白霜， 余小慧)

AFT024-SCF construction and functional identification

LI Chen1, LU Ying1, YANG Dan1, WANG Ying2, XUE Miao1, ZHANG Xiang-zhong1

(1DepartmentofHematology,TheThirdAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China;2AnhuiUniversity,Hefei230000,China.E-mail:bradzxz@126.com)

AIM: To construct AFT024-SCF cell line and HPC-Lhx2 cell line for confirming the biological function of AFT024-SCF.METHODS: The HPC-Lhx2 cell line, AFT024-SCF cell line and AFT024-GFP cell line were constructed by retro-viral infection. The expression of stem cell factor(SCF) in AFT024-SCF cells was detected by real-time PCR and Western blot. SCF in the supernatant of AFT024-SCF was detected with ELISA. The supernatant of AFT024-SCF and AFT024-GFP were collected and then diluted (1∶10) with basic IMDM medium. So we made 4 culture medium: AFT024-SCF medium was used for experiment group, AFT024-GFP medium was used for endogenous negative control, IMDM basic medium was used for exogenous negative control, and IMDM basic medium with SCF was used for positive control. SCF-dependent HPC-Lhx2 cell line was cultured in these 4 different medium for 72 h. According to MTT method and colony forming experiment, the biological function of AFT024-SCF was confirmed by the proliferation ability of SCF-dependent HPC-Lhx2 cell line.RESULTS: SCF was highly expressed in AFT024-SCF cells. After cultured for 72 h, neither IMDM basic medium nor GFP-AFT024 medium support HPC-Lhx2 cell line proliferation. However, AFT024-SCF medium supported HPC-Lhx2 cell line expansion as well as the positive control medium.CONCLUSION: AFT024-SCF cells express SCF successfully and recombinant SCF can be replaced by the supernatant of AFT024-SCF culture medium for expanding HPC-Lhx2 cell lineinvitro.

AFT024-SCF cell line; Stem cell factor; Hematopoietic stem/progenitor cells; HPC-Lhx2 cell line

1000- 4718(2016)04- 0745- 07

2015- 06- 30

2016- 02- 04

廣東省自然科學基金資助項目(No.S2013010016559； No.2014A030313138)

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R551

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.04.027

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