Notch3信號通路介導SAHA誘導的小細胞肺癌H446細胞凋亡*

陳紅蓮， 劉 輝， 楊旭光， 袁 磊

(漯河醫學高等專科學校，河南 漯河 462002)

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Notch3信號通路介導SAHA誘導的小細胞肺癌H446細胞凋亡*

陳紅蓮， 劉 輝， 楊旭光， 袁 磊△

(漯河醫學高等?？茖W校，河南 漯河 462002)

目的： 觀察辛二酰苯胺異羥肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid， SAHA)對人小細胞肺癌H446細胞凋亡的影響，并探討其分子機制。方法: 選取人小細胞肺癌H446細胞作為研究對象，采用CCK-8法檢測SAHA的細胞毒作用并測定IC50，采用流式細胞術檢測細胞凋亡，轉染N3ICD真核表達質粒構建高表達N3ICD的H446細胞系，采用RT-PCR法檢測Notch3的mRNA水平，采用Western blot法檢測Notch3、N3ICD、Puma和cleaved caspase-3的蛋白水平。結果: SAHA可顯著降低H446細胞存活率且呈劑量依賴性(P<0.05)，SAHA作用48 h的IC50為1.91 μmol/L；SAHA可誘導H446細胞凋亡且具有劑量依賴性(P<0.05)；H446細胞中Notch3基因表達呈陰性，SAHA可使H446細胞Notch3基因恢復表達并激活Notch3信號通路(P<0.05)；沉默Notch3基因可抑制SAHA對H446細胞的促凋亡作用(P<0.05)；N3ICD高表達使H446細胞中Puma和cleaved caspase-3蛋白水平升高(P<0.01)。結論: 在體外SAHA可激活人小細胞肺癌H446細胞Notch3信號通路，上調Puma蛋白表達水平，誘導H446細胞凋亡。

辛二酰苯胺異羥肟酸； 小細胞肺癌； Notch3； 細胞凋亡； H446細胞

近年來，肺癌的發病率和病死率一直位居全球首位。在我國，肺癌的發病率和病死率一直處于上升趨勢，目前在男性惡性腫瘤中占第一位，在女性中占第二位，已成為我國第一大癌癥[1]。小細胞肺癌(small-cell lung cancer，SCLC)約占全部肺癌發生率的15%，盡管SCLC對初始化療的敏感性高，但復發率高且二線治療有效率低，患者預后較差[2]。組蛋白去乙?；敢种苿?histone deacetylase inhibitor，HDACi)是近年來出現的一種新型抗腫瘤藥物，因其抑瘤效果好、毒副作用少，受到國內外的廣泛關注。研究表明HDACi在體外可通過阻滯細胞周期和誘導細胞凋亡發揮抗腫瘤作用[3-4]。辛二酰苯胺異羥肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA)，又稱伏立諾他，是第2代羥肟酸類的HDACi，目前已經進入III期臨床實驗[5]。然而目前關于SAHA對SCLC的抗腫瘤作用的研究較少[6-7]，SAHA對SCLC的治療作用還有待進一步實驗證實。因此本研究在體外觀察了SAHA對人小細胞肺癌H446細胞凋亡的影響并探究其分子機制，旨在初步探討SAHA應用于治療SCLC的潛在價值。

材 料 和 方 法

1 材料

人小細胞肺癌H446細胞購自中國科學院細胞庫；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和RPMI-1640培養基購自HyClone；SAHA購自Sigma；TRIzol試劑、RIPA裂解液、CCK-8試劑盒、Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒和ECL化學發光試劑盒購自碧云天；脂質體Lipofectamine 2000購自Invitrogen；RT-PCR試劑盒和PCR引物購自大連寶生物公司；無內毒素質粒提取試劑盒購自北京康為世紀公司；Notch3干擾質粒(pRS-shNotch3)和空載體(pRS)購自OriGene；人Notch3胞內段(Notch3 intracellular domain，N3ICD)真核表達質粒(hN3ICD-pCDF1-MCS2-EF1-copGFP)和空質粒(pCDF1-MCS2-EF1-copGFP)購自Addgene；抗Notch3、Puma、cleaved caspase-3和β-actin抗體購自Cell Signaling Technology。

2 方法

2.1 細胞培養 人小細胞肺癌H446細胞在含10% FBS的RPMI-1640培養液中，于37 ℃、5% CO2培養箱中進行培養。當細胞融合度達到80%時，以0.25%的胰蛋白酶消化，按1∶3的比例傳代。

2.2 SAHA工作液的配制 SAHA用DMSO配制成10 mmol/L的儲備液，分裝后于-20 ℃保存。使用時用含1% FBS的RPMI-1640培養液進行稀釋，配制成所需SAHA濃度的工作液。

2.3 CCK-8實驗檢測細胞活力 取對數生長期的H446細胞，制成密度為1×108/L的細胞懸液，以每孔100 μL接種于96孔板，于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養24 h。吸去原培養液，各孔分別加入200 μL含有不同濃度SAHA的工作液(0.1 μmol/L、0.2 μmol/L、0.4 μmol/L、0.8 μmol/L、1.6 μmol/L、3.2 μmol/L和6.4 μmol/L)，每組設5個復孔，同時設調零孔和對照孔(0.1% DMSO)，于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養48 h。每孔加入20 μL CCK-8溶液，37 ℃培養1 h，用酶標儀檢測各孔450 nm波長吸光度A值。細胞存活率=加藥孔A值/對照孔A值×100%。采用SPSS 16.0軟件Probit回歸模型計算SAHA對細胞的半數抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。

2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 取對數生長期的H446細胞，制成密度為1×109/L的細胞懸液，以每孔2 mL接種于6孔板，于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養24 h。吸去原培養液，各孔分別加入2 mL含有不同濃度SAHA的工作液(0.5 μmol/L、1 μmol/L和2 μmol/L)，同時設對照組(0.1% DMSO)，每組設3個復孔，繼續培養48 h。收集各孔細胞，用預冷的PBS洗滌細胞1次，用預冷的結合緩沖液重懸細胞，加入Annexin V-FITC輕輕混勻后于室溫避光孵育15 min。1 000 r/min離心5 min，棄上清，重懸細胞于預冷的結合緩沖液中，加入PI染色液輕輕混勻后于4 ℃避光保存，立即用流式細胞儀分析檢測。

2.5 RT-PCR檢測Notch3的mRNA表達 參照TRIzol說明書抽提上述各組細胞總RNA，取2 μg總RNA進行反轉錄，反轉錄條件：42 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min，所得反轉錄反應液于-20 ℃凍存備用。取2 μL上述反轉錄反應液進行PCR，PCR反應條件為94 ℃ 1 min;94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環。引物采用Primer Premier 5.0軟件設計，經PubMed BLAST驗證。Notch3的上游引物為5′-CCC-AGGGTGTCTTCCAGATT-3′，下游引物為5′-ATGTCCTGGTGCAGTCTCTC-3′，PCR產物為409 bp；GAPDH的上游引物為5′-CCTGACCTGCCGTCTAGAAA-3′，下游引物為5′-TACTCCTTGGAGGCCATGTG-3′，PCR產物為276 bp。PCR產物采用瓊脂糖凝膠電泳成像，使用ImageJ軟件進行條帶灰度值分析。

2.6 質粒轉染 將Notch3干擾質粒、人N3ICD表達質粒和空質粒分別轉染H446細胞；轉染方法參照Lipofectamine 2000操作說明書進行，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養48 h，得到4組細胞：shControl組為轉染pRS質粒的H448細胞；shNotch3組為轉染pRS-shNotch3質粒的H446細胞；control組為轉染pCDF1-MCS2-EF1-copGFP質粒的H448細胞;N3ICD組為轉染hN3ICD-pCDF1-MCS2-EF1-copGFP質粒的H446細胞。

2.7 Western blot法檢測蛋白水平 用RIPA裂解各組細胞提取總蛋白，用紫外分光光度法測定蛋白質濃度，然后進行SDS-PAGE電泳并轉移至PVDF膜，用封閉液(5% BSA/TBST)封閉1 h，加入Notch3、Puma、cleaved caspase-3和β-actin的I抗(均1∶1 000稀釋)，4 °C孵育過夜，TBST洗膜3次，加入II抗(1∶1 000稀釋)室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，加入ECL進行發光反應，暗室X膠片顯影，拍照后使用ImageJ軟件進行灰度分析，β-actin蛋白條帶為內參照。

3 統計學處理

采用SPSS 16.0分析數據，實驗數據用均數±標準差(mean±SD)表示。兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Bonferroni校正的t檢驗進行各組均數間的兩兩比較。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 SAHA抑制H446細胞活力

CCK-8實驗結果顯示，自0.2 μmol/L開始，隨著SAHA濃度逐漸升高，H446細胞存活率逐漸降低(P<0.05)，當SAHA濃度達到6.4 μmol/L時H446細胞存活率降至最低(P<0.05)，這表明SAHA對H446細胞生長的抑制作用具有劑量依賴性。SAHA作用48 h的IC50為1.91 μmol/L，見圖1。

Figure 1.The effect of SAHA on the viability of H446 cells. Mean±SD.n=5.*P<0.05vs0 μmol/L.

圖1 SAHA對H446細胞存活率的影響

2 SAHA促進H446細胞凋亡

流式細胞術檢測結果顯示，按照各不同濃度SAHA 組(0 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L和2 μmol/L)，H446細胞的凋亡率依次升高(P<0.05)；2 μmol/L SAHA組的H446細胞凋亡率最高(P<0.05)。這表明SAHA促進H446細胞凋亡且具有劑量依賴性，見圖2。

Figure 2.The effect of SAHA on the apoptosis of H446 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L.

圖2 SAHA對H446細胞凋亡的影響

3 SAHA促進H446細胞中Notch3和N3ICD蛋白表達

Western blot實驗結果顯示，對照組H446細胞中的Notch3和N3ICD蛋白呈陰性表達；然而經不同濃度SAHA作用48 h后，H446細胞中Notch3和N3ICD的蛋白表達均呈陽性，且隨著SAHA濃度的增加兩者的表達水平依次升高(P<0.05)，2 μmol/L SAHA組H446細胞中Notch3和N3ICD的蛋白表達水平最高(P<0.05)。這表明SAHA可激活H446細胞Notch3信號通路，見圖3。

4 SAHA促進H446細胞中Notch3 mRNA表達

RT-PCR實驗結果顯示，對照組H446細胞中Notch3和N3ICD的mRNA表達呈陰性；經不同濃度SAHA作用48 h后，H446細胞中Notch3的mRNA表達均呈陽性，且隨著SAHA濃度的增加而依次升高(P<0.05)，2 μmol/L SAHA組H446細胞中Notch3的mRNA表達水平最高(P<0.05)。這表明SAHA可恢復H446細胞Notch3基因的表達，見圖4。

Figure 3.The effect of SAHA on the protein levels of Notch3 and N3ICD in the H446 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L.

圖3 SAHA對H446細胞中Notch3和N3ICD蛋白水平的影響

Figure 4.The effect of SAHA on the mRNA level of Notch3 in the H446 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L.

圖4 SAHA對H446細胞中Notch3 mRNA水平的影響

5 沉默Notch3對細胞凋亡的影響

流式細胞術檢測結果顯示， shNotch3組的H446細胞凋亡率與對照組相比差異無統計學顯著性；shControl+SAHA組的H446細胞凋亡率與對照組相比明顯升高(P<0.05)；與shControl+SAHA組相比，shNotch3+SAHA組H446細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，此2組中SAHA的終濃度均為1 μmol/L。這表明沉默Notch3基因可抑制SAHA對H446細胞的促凋亡作用，見圖5。

Figure 5.The effect ofNotch3 silencing on the apoptosis of H446 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs shControl group;#P<0.05vsshControl+SAHA group.

圖5 沉默Notch3對H446細胞凋亡的影響

6 N3ICD高表達對H446細胞中Puma和cleaved caspase-3蛋白水平的影響

Western blot實驗的結果顯示，與對照組相比，N3ICD組H446細胞中促凋亡蛋白Puma的表達水平明顯升高(P<0.05)；同時凋亡執行蛋白caspase-3被活化，cleaved caspase-3蛋白水平較對照組顯著升高(P<0.05)。這表明Notch信號通路可通過Puma促進H446細胞凋亡,見圖6。

討 論

臨床上一般按生物學行為和臨床病程將肺癌分為SCLC和非小細胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)。SCLC患者在就診時常常已經處于播散狀態。SCLC對化療敏感性高，一線化療后局限期SCLC化療有效率可達70%以上，廣泛期SCLC也達60%以上。盡管SCLC的一線治療效果明顯，但大多數SCLC患者仍會復發，預后差，局限期SCLC患者的中位生存期只有14～20個月，廣泛期SCLC患者更是低至9～11個月。對于早期復發的SCLC患者，由于化療耐藥目前尚缺乏有效的二線治療藥物，二線治療的有效率不足10%[2]。因此在一線和二線治療之間使用安全高效的化療藥物或靶向藥物進行維持治療，以延長SCLC患者的生存期，是值得探索的臨床治療模式。

Figure 6.The effect of N3ICD on the protein levels of Puma and cleaved caspase-3 in the H446 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖6 N3ICD過表達對H446細胞Puma和cleaved caspase-3蛋白水平的影響

在本研究中，CCK-8法檢測細胞活力和流式細胞術的分析結果表明，SAHA對人小細胞肺癌H446細胞具有顯著的抑制作用且呈劑量依賴性。SAHA可誘導H446細胞中Notch3和N3ICD蛋白的表達以及Nocth3的mRNA表達，這表明SAHA可激活H446細胞中Notch3信號通路。為探究Notch3信號通路是否參與了SAHA所誘導的H446細胞凋亡，我們首先采用shRNA技術沉默Notch3基因，結果顯示抑制Notch3表達可抑制SAHA誘導的H446細胞凋亡，隨后我們又將人N3ICD真核高表達質粒轉染至H446細胞，結果發現N3ICD高表達可使H446細胞中的Puma和cleaved caspase-3蛋白水平顯著升高，這表明SAHA可通過激活Notch3信號通路上調Puma促進H446凋亡。本研究結果為SAHA應用于臨床治療SCLC患者提供了一定的理論依據，但由于本研究僅采用了一種人SCLC細胞系，具有一定的局限性，也未探究SAHA與其它化療藥物聯用的有效性和安全性。因此SAHA對其它SCLC細胞的抑瘤作用以及SAHA與其它化療藥物的聯合使用將是本研究團隊下一步擬探究的問題。

SAHA在體外已證實對多種惡性腫瘤具有較好的抗腫瘤效果，包括肺癌[6-7]、乳腺癌[8]、神經母細胞瘤[9]、膽管癌[10]和口腔癌[11]。Bruzzese等[6]的研究發現，SAHA可誘導人小細胞肺癌H209和H526細胞凋亡，這可能與其提高細胞中ROS水平有關；同時還發現SAHA可使小細胞肺癌H209和H526細胞阻滯于G1期。最新的一項研究表明，SAHA可通過促進Noxa和/或Bim基因表達誘導多種SCLC細胞凋亡[7]。以上研究結果表明， SAHA對SCLC的抑制作用可能與其誘導的細胞周期阻滯和細胞凋亡有關，但具體的分子機制尚需進一步研究。

Notch3信號通路在肺癌中似乎扮演著雙重角色。一些研究表明，Notch3信號通路可促進NSCLC細胞增殖、侵襲和腫瘤干細胞富積[12-14]。但也有研究發現，Notch3可抑制NSCLC細胞增殖和淋巴結轉移[15]。Hassan等[16]研究發現，在受檢的6個NSCLC細胞系中Notch3蛋白表達均呈陽性，28例NSCLC病理組織中Notch3蛋白陽性率接近80%；與之相反，在受檢的5個SCLC細胞系中除H69AR和SBC-3以外其余3個SCLC細胞系的Notch3蛋白表達呈陰性，12例SCLC病理組織中Notch3蛋白表達均為陰性；在NSCLC細胞系A549和H2170細胞以及SCLC細胞系H69AR中沉默Notch3基因可抑制細胞增殖和侵襲并誘導細胞凋亡；與之相反，高表達N3ICD可抑制SCLC細胞系H1688細胞增殖和侵襲并誘導其凋亡。這些研究結果表明，Notch3信號通路究竟是發揮促癌作用還是抗癌作用取決于細胞類型，Notch3信號通路對SCLC的抑制作用尚需更多實驗證實。

綜上所述，本研究表明，SAHA在體外可激活人小細胞肺癌H446細胞Notch3信號通路，進而上調Puma蛋白表達，最終導致H446細胞凋亡。這加深了對SAHA抑瘤作用的認識，然而SAHA在體內是否也通過該機制發揮作用尚待進一步闡明。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Notch3 pathway mediates SAHA-induced apoptosis in human small-cell lung cancer H446 cells

CHEN Hong-lian, LIU Hui, YANG Xu-guang, YUAN Lei

(LuoheMedicalCollege,Luohe462002,China.E-mail:fzyx_yl@163.com)

AIM: To investigate the effect of suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA) on the apoptosis of human small-cell lung cancer H446 cells and its possible mechanism. METHODS: H446 cells were incubated in the medium containing SAHA. CCK-8 assay was used to detect the anti-tumor effect of SAHA on the H446 cells, and IC50values of SAHA were calculated. Flow cytometry was used to analyze the apoptosis. AfterNotch3 gene was silenced, the pro-apopto-tic effect of SAHA on the H446 cells was inhibited (P<0.05). Eukaryotic expression plasmid containingN3ICDwas transfected into the H446 cells, so that N3ICD was expressed in the H446 cells. The mRNA expression of Notch3 was measured by RT-PCR. The protein levels of Notch3, N3ICD, Puma and cleaved caspase-3 were determined by Western blot. RESULTS: SAHA remarkably reduced the cell viability in a dose-dependent manner (P<0.05), and the IC50value of SAHA was 1.91 μmol/L. SAHA induced apoptosis in a dose-dependent manner (P<0.05). The expression ofNotch3 gene was negative in the H446 cells, SAHA reactivatedNotch3 gene and Notch3 pathway in a dose-dependent manner (P<0.05).Notch3 knockdown inhibited apoptosis induced by SAHA (P<0.05). Over-expression of N3ICD up-regulated the protein levels of Puma and cleaved caspase-3.CONCLUSION: SAHA induces apoptosis in human small-cell lung cancer H446 cells by activating Notch3 pathway and up-regulating the protein level of Puma.

Suberoylanilide hydroxamic acid; Small-cell lung cancer; Notch3; Apoptosis; H446 cells

雜志網址： http://www.cjpp.net

1000- 4718(2016)09- 1556- 06

2016- 04- 19

2016- 06- 20

河南省科技廳科技發展計劃項目(No.142102310203)；漯河醫學高等?？茖W校自然科學研究計劃項目(No.2013-S-LMC04)

△通訊作者 Tel： 0395-2969424； E-mail： fzyx_yl@163.com

R734.2; R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.09.004