CD147單抗介導的基因治療納米顆粒的肺癌細胞靶向性研究*

吳飛龍， 孔慶磊， 蔡松旺， 葉志強△

(中山大學附屬第三醫院 1急診科， 2心胸外科， 廣東 廣州 510630)

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CD147單抗介導的基因治療納米顆粒的肺癌細胞靶向性研究*

吳飛龍1， 孔慶磊1， 蔡松旺2， 葉志強1△

(中山大學附屬第三醫院1急診科，2心胸外科， 廣東 廣州 510630)

目的： 本研究采用靶向CD147的單克隆抗體對納米基因載體顆粒進行靶向修飾后，進行針對肺癌細胞的蛋白激酶Cε(protein kinase Cε，PKCε)小干擾RNA基因治療，觀察其對肺癌細胞增殖和遷移能力的抑制效果。方法: 制作可靶向CD147蛋白的磁性納米基因載體。激光掃描共聚焦顯微鏡觀察肺癌細胞CD147表達量。分別設立CP組、CN組和LP組復合物，按每6孔板孔質粒總量250 ng進行細胞轉染。另設CD147靶向載體對照CA組和未轉染細胞的對照(control)組。激光掃描共聚焦顯微鏡觀察納米造影劑的細胞內吞效果。實時熒光定量PCR檢測PKCε的mRNA表達。Western blot法檢測PKCε、Ki67、MMP3、Wnt1和GAPDH的蛋白表達。平板克隆形成實驗檢測細胞的增殖能力。Transwell法檢測細胞的遷移能力。結果: 免疫熒光法染色觀察證實，人肺癌A549細胞的胞膜高表達CD147蛋白。CP組細胞中siRNA高效進入A549細胞，質粒內吞效率大于CN組和LP組。CP組、CN組、LP組和CA組的A549細胞中PKCε的mRNA相對表達量分別為control組的(9.76±0.18)%、(98.51±0.32)%、(99.17±0.16)%和(99.68±0.11)%，CP組與control組間的差異有統計學顯著性(P<0.05)，CN組、LP組與control組間的差異無統計學顯著性。CP組PKCε、Ki-67、MMP3及Wnt1蛋白的表達量明顯降低，CN組和LP組與對照組之間的蛋白表達量的差異無統計學顯著性。CP組的克隆形成數量明顯少于control組，差異具有統計學顯著性(P<0.05)。CN組、LP組和CA組的有效克隆數量與control組相比差異沒有統計學顯著性。CP組的過膜細胞數量明顯少于control組，差異具有統計學顯著性(P<0.05)。CN組、LP組和CA組的數量與control組相比差異沒有統計學顯著性。結論: 靶向CD147修飾的納米基因載體，可以對肺癌細胞進行高效的PKCε-siRNA基因治療，實現對肺癌細胞增殖和遷移能力的高效抑制。

CD147； 納米載體； 基因治療； 蛋白激酶Cε

納米基因載體是可以結合目的基因、組成1～1 000 nm大小的納米級基因遞送系統。納米基因載體在遞送治療基因的過程中，可以避免基因損耗，增加病灶位置基因濃度，并促進細胞內吞，提高治療基因的生物利用率，經過配體、抗體等表面修飾的納米載體可與目的器官和目的細胞表面的特異性受體或特異性抗原結合，實現在特定部位的濃集及高效釋放，進一步提高基因傳遞的效率[1-2]。CD147是一種在肺癌、泌尿系腫瘤、乳腺癌等多種惡性腫瘤中高表達的跨膜糖蛋白，適合作為納米載體識別腫瘤細胞的靶向位點[3-5]。本研究采用CD147單抗，對納米載體顆粒進行靶向化修飾，使其具備肺癌細胞特異性識別功能，進而采用該納米載體負載本課題組前期報道的蛋白激酶Cε(protein kinase Cε，PKCε)小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)對肺癌細胞進行基因治療，并研究其起效機制[6]。同時，對該納米載體與通用的新型脂質體載體LipofectamineTM3000[7-8]的基因治療效果進行了比較。本研究采用靶向CD147的單克隆抗體對納米基因載體顆粒進行靶向修飾后，進行針對肺癌細胞的蛋白激酶PKCε-siRNA基因治療，觀察其對肺癌細胞增殖和遷移能力的抑制效果，并初步探討其起效的分子生物學機制。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

人肺癌細胞株A549購自ATCC，由華南師范大學分子生物學實驗室保存；紅色熒光染料四乙基羅丹明(rhodamine)標記的羊抗兔-IgG抗體、兔抗人CD147單克隆抗體(CD147-Ab)及其同型對照抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；免疫熒光染色試劑盒購自廣州安邦生物科技有限公司；PKCε-siRNA和陰性對照siRNA (negative control siRNA， NC-siRNA)購自Santa Cruz。紅色核酸熒光染料GelRed購自Biotium[9]；TANBead?USPIO-101納米級顆粒購自Advanced Nanotech；LipofectamineTM3000轉染試劑購自Invitrogen；熒光染料Hoechst 33342購自成都麥卡希化工有限公司。

2 方法

2.1 納米顆粒靶向CD147蛋白識別功能的添加 按照產品說明書要求，將CD147單克隆抗體配制為1 g/L溶液，與濃度為15 g/L的TANBead?USPIO-101納米顆粒混懸液等體積混懸重懸于含有5 g/L[1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)]碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)的三蒸水中。4 ℃條件下振蕩8 h。于磁性分離器中收集含有磁性成分USPIO的納米顆粒，制成可靶向CD147蛋白的CD147-Ab-TANBead?USPIO-101磁性納米基因載體[10]。

2.2 肺癌細胞CD147表達量的鑒定 復蘇人肺癌A549細胞株，常規條件培養于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱中。PBS沖洗細胞3次后，4%中性甲醛固定液固定細胞。使用免疫熒光染色試劑盒，以CD147單抗或其同型抗體為 I 抗，RIB200標記的羊抗兔-IgG抗體，進行免疫熒光染色。免疫熒光染色后，藍色熒光染料Hoechst 33342避光孵育0.5 h染色細胞核。Olympus FV1200激光掃描共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscope，CLSM)觀察染色結果。

2.3 基因載體與質粒的復合 分別按照載體說明書，采用靶向修飾的CD147-Ab-TANBead?USPIO-101、未靶向修飾的TANBead?USPIO-101 和脂質體載體LipofectamineTM3000復合PKCε-siRNA，作為CP(CD147 targeted-PKCε-siRNA)組、CN(CD147-non-targeted-PKCε-siRNA)組和LP(LipofectamineTM3000-PKCε-siRNA)組復合物用于細胞轉染。另設不復合質粒的靶向修飾的空載體CD147-Ab-TANBead?USPIO-101對照CA(CD147-Ab-TANBead?USPIO-101)組和未轉染細胞對照(control)組。

2.4 細胞培養和分組轉染 A549細胞培養于6孔板上，待細胞融合度達70%時，分為如上CP組、CN組、LP組、CA組或control組分別按照說明操作步驟進行轉染。轉染條件為LipofectamineTM3000說明書推薦質粒用量的1/30，每6孔板孔采用含250 ng質粒的載體-siRNA復合物與細胞共孵育轉染。

2.5 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察納米造影劑的細胞內吞效果 采用紅色核酸熒光染料GelRed對載體-siRNA復合物進行染色后轉染3 h，4%中性甲醛固定液固定細胞，Hoechst 33342避光孵育0.5 h染色細胞核。激光掃描共聚焦顯微鏡觀察。所有實驗重復3次。

2.6 實時熒光定量PCR檢測PKCε的mRNA表達 TRIzol法提取各組總細胞RNA，逆轉錄合成cDNA。PKCε的上游引物為5’-ATGGTAGTGTTCAATGGCCTTCT-3’，下游引物為5’-TCAGGGCATCAGGTCTTCAC-3’；內參照GAPDH的上游引物為5’-TTGCATGCGACATAAGGTGTGA-3’，下游引物為5’-CTGGGAGATCTAGCAATGCATG-3’。PCR反應條件為95 ℃ 35 s；95 ℃ 7 s、55 ℃ 32 s，62個循環，循環延伸末端收集熒光信號[6]。Real-time PCR數值分析采用2-ΔΔCt分析法。所有實驗重復3次。

2.7 細胞功能蛋白表達鑒定 siRNA轉染肺癌細胞48 h。收集細胞后提取蛋白，按照常規方法進行Western blot實驗,檢測 PKCε、Ki67、MMP3、Wnt1和GAPDH的蛋白水平。

2.8 平板克隆形成實驗檢測增殖能力 分別取5組轉染后細胞制備單細胞懸液，測定細胞密度后，分別取500個細胞，分別接種于6孔板中,每組細胞設3個復孔。于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱中培養14 d，PBS沖洗3次后，4%中性甲醛固定液固定細胞，結晶紫染色。光鏡下觀察每孔形成的細胞克隆數。設定每克隆的細胞數大于50個計作1個有效克隆。每組實驗重復3次。

2.9 Transwell法檢測細胞的遷移能力 取Transwell小室，每室中加入50 μL預稀釋的Matrigel膠，37 ℃靜置2 h凝固后用于實驗。分別取5組轉染后細胞制備單細胞懸液并測定細胞密度，分別取等量轉染后細胞接種入Transwell上室。下室中加入含胎牛血清培養基500 μL。37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱中培養24 h。取出小室，去除小室底膜上面的細胞后，4%中性甲醛固定液固定小室底膜下面細胞。結晶紫染色，光鏡下計數穿過小室底膜的細胞數量。每組實驗重復3次。

3 統計學處理

采用SPSS 13.0 統計學軟件分析數據。實驗數據以均數±標準差(mean±SD)表示，多組數據比較采用單因素方差分析，各組均數間的兩兩比較采用SNK法。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 人肺癌A549細胞CD147表達的免疫熒光觀察

免疫熒光法染色觀察發現，采用CD147單抗作為 I 抗的A549細胞膜上出現RIB200免疫熒光標記的紅色熒光染色，而使用同型對照抗體作為 I 抗的細胞膜上沒有出現紅色熒光染色，說明人肺癌A549細胞的胞膜高表達CD147蛋白。所以可以嘗試在納米基因載體上連接CD147抗體后，實現對A549細胞進行識別，見圖1。

Figure 1.The images of A549 cells with-CD147 immunofluorescence staining (laser confocal microscope, ×1 000). A: stained with an anti-CD147 antibody; B: using the same type of control antibody.

圖1 A549細胞的CD147免疫熒光染色結果

2 納米基因載體的細胞內吞效果

如圖2所示，免疫熒光實驗觀察發現，在經過設定較低的載體-siRNA復合物用量轉染后，CP組腫瘤細胞中可以觀察明顯的大量紅色核酸熒光染料GelRed發出的紅色熒光，CN組和LP組僅可見極少的微弱紅色熒光，CA組和control組未見紅色熒光，說明CP組細胞中siRNA通過載體的介導，高效進入A549細胞，質粒內吞效率大于CN組和LP組。

3 5組細胞PKCε的mRNA表達

CP組、CN組、LP組和CA組的A549細胞中PKCε的mRNA相對表達量分別為control組的(9.76±0.18)%、(98.51±0.32)%、(99.17±0.16)%和(99.68±0.11)%，CP組與control組的差異有統計學顯著性(P<0.05)，CN組、LP組、CA組與control組的差異無統計學顯著性。這說明在LipofectamineTM3000說明書推薦質粒用量的1/30進行轉染時，僅有CD147靶向化的納米載體可以實現siRNA對PKCε基因的明顯沉默效果。

Figure 2.The effects of the gene vectors in 4 groups on the endocytosis of A549 cells (laser confocal microscope, ×1 000).

圖2 4組基因載體對A549細胞內吞效果的觀察

4 5組細胞PKCε、Ki67、MMP3和Wnt1的蛋白表達

由圖3可見，在LipofectamineTM3000說明書推薦質粒用量的1/30進行轉染時，僅有CP組PKCε、Ki-67、MMP3及Wnt1蛋白的表達量明顯降低，CN組、LP組和CA組與對照組之間的蛋白表達量差異無統計學顯著性。Western blot實驗檢測的結果與前述RT-qPCR實驗結果一致，說明CD147靶向化的納米載體可以實現較高的siRNA抑制PKCε蛋白表達的效果，且同時對Ki-67、MMP9、Wnt1等功能蛋白的表達產生抑制。

5 5組細胞增殖能力的檢測

培養14 d后，分別計數5組細胞的有效克隆數量。發現CP組的克隆數量明顯少于control組，差異具有統計學顯著性(P<0.05)。而CN組、LP組和CA組的有效克隆數量與control組相比差異沒有統計學顯著性，見圖4。

6 5組細胞細胞遷移能力的比較

Transwell小室培養24 h后，計數5組過膜細胞的數量，發現CP組的數量明顯少于control組，差異具有統計學顯著性(P<0.05)。而CN組、LP組和CA組的數量與control組相比差異沒有統計學顯著性，見圖5。

Figure 3.The protein expression levels in the A549 cells of 4 groups detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖3 4組A549細胞中蛋白表達水平的Western blot實驗檢測

Figure 4.Comparison of the colony formation abilities of A549 cells in 5 groups. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖4 5組細胞克隆形成能力的比較

Figure 5.Comparison of the invasion abilities of A549 cells in 5 groups. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖5 5組細胞遷移能力的比較

討 論

本研究首先合成了一種CD147靶向的磁性納米基因載體CD147-Ab-TANBead?USPIO-101，并包裹PKCε-siRNA，實現對肺癌細胞A549的基因治療。磁性納米載體是一類粒徑在納米尺度的，由磁性金屬及金屬氧化物等原料組成的納米載體，可用于包裹核酸進行基因治療。在本研究中，我們采用了被證明具有確切基因負載傳輸效果的TANBead?USPIO-101納米級顆粒進行治療質粒負載[11-12]。在治療基因方面，采用了研究團隊前期研究中采用的可抑制細胞蛋白激酶Cε表達的商品化PKCε-siRNA。蛋白激酶Cε是蛋白激酶C的重要亞型之一，與腫瘤的增殖轉移關系密切。在我們的前期研究中已證實，利用該手段對蛋白激酶Cε表達進行抑制可以通過NF-κB、AKT等信號通路對腫瘤細胞進行基因治療[6]。磁性納米載體復合核酸后，可以通過靜電作用結合形成緊密的納米顆粒，可以有效地阻止核酸酶與核酸的接觸，并通過構象變異，發揮酶切保護效果。在納米載體表面進行適當的配體或抗體靶向化修飾，可以有效提高特定部位納米復合物聚集的能力，進而實現提高負載的治療基因的生物利用率的目的。在納米載體傳遞系統的設計中，靶向修飾位點的選擇非常重要。CD147是一種定位于19p13.3的跨膜糖蛋白，為免疫球蛋白超家族成員，其蛋白結構包括細胞外2個免疫球蛋白區、跨膜區和胞內區，其胞外區具有誘導臨近的成纖維細胞分泌MMP等功能[13]。目前已經證實，在肺癌、乳腺癌、結直腸癌、膠質瘤等腫瘤細胞中，CD147在細胞膜上的表達量均明顯升高，適合作為納米載體靶向識別上述腫瘤細胞的位點[14-15]。在本研究中，我們選用了在肺癌等腫瘤細胞表面特異性高表達的CD147作為靶點，對磁性納米載體進行CD147抗體靶向修飾，期望使其具備肺癌細胞主動靶向功能[16]。

本研究進而通過免疫熒光法對肺癌A549細胞表面CD147的表達進行了進一步證明。通過免疫熒光染色發現，采用CD147單抗作為Ⅰ抗進行染色后A549細胞膜上出現免疫熒光標記的紅色熒光染色，而相對的同型對照抗體不能實現熒光染色，證明與國際上的報道相似，本研究采用的A549細胞膜上確實高表達CD147，且可以通過CD147單抗進行A549細胞靶向。同時，我們以常用的脂質體載體，和未經靶向化修飾的磁性納米載體，對經過靶向化修飾的納米載體的siRNA傳輸效率進行了研究。為對不同載體轉染效率的差異進行比較，本研究采用了通用脂質體載體LipofectamineTM3000推薦質粒量的1/30進行轉染后，通過共聚焦顯微鏡直觀觀察發現，僅有CD147靶向化的納米載體轉染的A549細胞中可以觀察到明顯的核酸熒光染料聚集，而其它載體組僅可見極少的微弱紅色熒光，說明本研究采用的CD147-Ab-TANBead?USPIO-101納米載體可以在極低的質粒濃度下，實現明顯優于LipofectamineTM3000的體外轉染效果。

經過如上研究證明了CD147-Ab-TANBead?USPIO-101納米載體轉運質粒進入細胞的效率后，我們對納米復合物進行基因治療的效果進行了研究。在RT-qPCR實驗和Western blot實驗中發現，靶向化的納米復合物可以有效降低PKCε的表達水平，并抑制肺癌A549細胞的增殖和遷移。對其分子生物學機制進行考察后發現，Ki-67、MMP3及Wnt1蛋白的表達量與PKCε的表達量變化呈正相關。Ki67和MMP3分別是Wnt信號通路中與細胞增殖和遷移轉移密切相關的功能蛋白[17-19]，Wnt1蛋白是Wnt信號通路的關鍵蛋白[20-21]。國際上有類似研究表明，PKCε在腫瘤中的活化和功能與Wnt信號通路密切相關[22-23]。在研究中，我們同時采用了等量不復合質粒的，單純CD147靶向化的納米載體對細胞進行干預，發現沒有對細胞功能蛋白表達及遷移轉移能力產生影響，說明本研究采用的納米載體在實現有效轉染和基因治療的劑量下，本身并不能產生對細胞生物學功能的影響。前述研究結果說明，Ki-67、MMP3可能參與了CD147-Ab-TANBead?USPIO-101納米載體負載的PKCε-siRNA對肺癌A549細胞的增殖和遷移的抑制，這種抑制功能可能是通過wnt信號通路實現的。

綜上所述，靶向CD147修飾的納米基因復合物負載PKCε-siRNA后，可以對肺癌細胞進行高效的基因治療，實現對肺癌細胞增殖和遷移能力的高效抑制。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

CD147 monoclonal antibody-mediated nanoparticles for gene therapy to target lung cancer cells

WU Fei-long1, KONG Qing-lei1, CAI Song-wang2, YE Zhi-qiang1

(1DepartmentofEmergency,2DepartmentofCardiothoracicSurgery,TheThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:zqye@163.com)

AIM: In this study, CD147 antibody was used to carry out targeted modification of nanoparticles for protein kinase Cε (PKCε)-siRNA gene therapy to target lung cancer cells. The inhibitory effects of the nanoparticles on the proliferation and invasion of the lung cancer cells were observed. METHODS: The magnetic nanoparticles targeting CD147 protein were assembled as gene vector. The expression of CD147 in the lung cancer cells was observed under laser scanning confocal microscope. The cells were divided into CP group, CN group and LP group as the experimental groups. Targeted nanoparticles were used as CA group. Non-transfected cells were used as control group. The cell transfection was carried out with 250 ng plasmids/well in 6-well plate. The effect of nanocontrast agent on the cell endocytosis was observed under laser scanning confocal microscope. The mRNA expression of PKCε was detected by RT-qPCR. The protein expression of Ki67, MMP3, PKCε, Wnt1 and GAPDH was determined by Western blot. The cell proliferation ability was detected with colony formation assay. The cell invasion ability was detected by Transwell method. RESULTS: The expression of CD147 protein in the human lung cancer A549 cells was confirmed by immunofluorescence staining. The endocytosis of siRNA into the A549 cells in CP group was observed with the highest efficiency as compared with CN group and LP group. The relative mRNA expression of PKCε in the A549 cells of CP group, CN group, LP group and CA group were (9.76±0.18)%, (98.51±0.32)%, (99.17±0.16)% and (99.68±0.11)%， respectively. The difference between CP group and control group was statistically significant (P<0.05). No significant difference among CN group, LP group and control group was observed. The protein expression of PKCε, Ki-67, MMP3 and Wnt1 in CP group was significantly reduced, and the protein expression levels among CN group， LP group and control group had no significant difference. The colony number in CP group was significantly smaller than that in control group (P<0.05). The effective colony numbers in CN group, LP group and CA group had no significant difference as compared with control group. The number of the invading cells in CP group was significantly less than that in control group (P<0.05). The numbers of the invading cells in CN group, LP group and CA group had no significant difference as compared with control group. CONCLUSION: Nanogene vector targeting CD147 can carry PKCε-siRNA to conduct gene therapy efficiently on the lung cancer cells to achieve effective inhibitory effects on the proliferation and invasion of the lung cancer cells.

CD147; Nanocarriers; Gene therapy; Protein kinase Cε

雜志網址： http://www.cjpp.net

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2016- 06- 21

2016- 08- 16

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△通訊作者 Tel： 020-85253333； E-mail： zqye@163.com

R730.23

A

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