Fas過表達(dá)逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞順鉑耐藥*

陳 剛， 申屠楊萍

(1武警浙江總隊嘉興醫(yī)院腫瘤科, 浙江 嘉興 314000； 2溫州醫(yī)科大學(xué)機能實驗教學(xué)中心, 浙江 溫州 325000)

?

Fas過表達(dá)逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞順鉑耐藥*

陳 剛1△， 申屠楊萍2

(1武警浙江總隊嘉興醫(yī)院腫瘤科, 浙江 嘉興 314000；2溫州醫(yī)科大學(xué)機能實驗教學(xué)中心, 浙江 溫州 325000)

目的： 探究Fas在胃癌細(xì)胞順鉑耐藥中的作用及可能的作用機制。方法: Western blot及RT-qPCR檢測胃癌細(xì)胞株SGC-7901及胃癌耐藥細(xì)胞株SGC-7901/DDP中Fas的表達(dá)情況。構(gòu)建Fas過表達(dá)腺病毒載體,上調(diào)胃癌耐藥細(xì)胞株SGC-7901/DDP中Fas的表達(dá)，CCK-8檢測細(xì)胞活力,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡,Western blot法檢測Fas、P38/p-P38、JNK/p-JNK、cleaved caspase-8/caspase-8和cleaved caspase-3/caspase-3蛋白水平。結(jié)果: 耐藥細(xì)胞株SGC7901/DDP中Fas的mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯低于親本細(xì)胞株；并且在親本細(xì)胞株SGC7901中，F(xiàn)as的蛋白表達(dá)水平隨著順鉑的濃度增加不斷降低。過表達(dá)Fas可抑制胃癌耐藥細(xì)胞SGC7901/DDP的細(xì)胞活力，并誘導(dǎo)其凋亡；同時上調(diào)p-P38、p-JNK、cleaved caspase-8和cleaved caspase-3的蛋白水平。結(jié)論: 胃癌順鉑耐藥細(xì)胞中過表達(dá)Fas可恢復(fù)細(xì)胞對順鉑的敏感性，促進細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞生長，其機制可能與JNK和P38 MAPK信號通路的激活有關(guān)。

Fas； 胃癌； 順鉑耐藥； 細(xì)胞凋亡

胃癌是消化系統(tǒng)常見腫瘤之一，目前放、化療仍然是胃癌的主要治療方法。順鉑是第一個被發(fā)現(xiàn)的鉑類抗腫瘤藥物，可直接作用于DNA，引發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡，被廣泛應(yīng)用于胃癌的治療[1]。但是，隨著化療藥物的大量應(yīng)用，腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)的耐藥性成為影響化療療效的主要因素。因此，有關(guān)逆轉(zhuǎn)腫瘤化療耐藥的研究具有重要的臨床意義。

研究表明腫瘤化療耐藥產(chǎn)生的機制可能有以下幾個方面[2-7]：(1) 包括P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)在內(nèi)的ABC型膜載體介導(dǎo)的抗腫瘤藥物主動外排作用增強；(2) 多藥耐藥基因表達(dá)異常；(3) DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)失調(diào)；(4) 細(xì)胞凋亡通路被阻礙。Fas是屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員的一種跨膜蛋白，它與FasL結(jié)合可以啟動凋亡信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)引起細(xì)胞凋亡，在腫瘤監(jiān)視過程中發(fā)揮重要作用。大量研究發(fā)現(xiàn)，在包括胃癌[8]、直腸癌[9]、乳腺癌[10]、肺癌[11]等多種實體腫瘤中都出現(xiàn)Fas的低表達(dá)或表達(dá)缺失，表明Fas在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用；同時有研究表明，TNF-α可通過NF-κB通路上調(diào)Fas的表達(dá)，進而提高順鉑對成神經(jīng)細(xì)胞瘤的治療效果[12]，提示Fas在腫瘤化療耐藥中可能也發(fā)揮一定的作用。但是Fas在胃癌化療耐藥中的作用并沒有明確的闡釋。本文通過構(gòu)建Fas過表達(dá)載體，系統(tǒng)研究了Fas在胃癌細(xì)胞順鉑耐藥中的作用及其相關(guān)機制。

材 料 和 方 法

1 材料

胃癌細(xì)胞株SGC-7901和胃癌耐藥細(xì)胞株SGC-7901/DDP均購買于中科院上海細(xì)胞庫；Ad-Fas腺病毒及病毒載體購買于上海和元生物有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購買于上海士鋒生物科技有限公司；CCK-8細(xì)胞計數(shù)試劑盒購買于廣州賴德生物技術(shù)有限公司；FBS胎牛血清購買于Gibco；乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測試劑盒購買于江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；Annexin V-FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購買于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；TRIzol和引物購買于Invitrogen；抗p-JNK/JNK、p-P38/P38抗體購買于Santa Cruz；抗cleaved caspase-3/caspase-3、cleaved caspase-8/caspase-8、β-actin抗體和HRP標(biāo)記抗兔II抗購買于江蘇碧云天生物技術(shù)研究所。

2 實驗方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將胃癌細(xì)胞株SGC-7901和胃癌耐藥細(xì)胞株SGC-7901/DDP培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基(含1.5 mmol/L L-谷氨酰胺、100 mL/L胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)，并將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。每隔1 d 換液1次，細(xì)胞生長達(dá)90%融合后可用0.25%胰酶消化后按1∶3的比例傳代。

2.2 實時熒光定量PCR檢測mRNA的表達(dá) 細(xì)胞總RNA的抽提采用TRIzol一步法(參照操作手冊)。取2 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄至終體積為20 μL，采用SYBR Green實時熒光定量PCR方法檢測mRNA的表達(dá)。用于定量多聚酶鏈反應(yīng)的Fas正向引物為5’-GGACATGGCTTAGAAGTG-3’，反向引物為5’-GGTTGGAGATTCATGAGAACC-3’；β-actin的正向引物為5’-AGCGGGAAATCGTGCGTG-3’，反向引物為5’-CAGGGTACATGGTGGTGCC-3’。qPCR反應(yīng)體系包括為1 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，10 μL SYBR Green PCR Master Mix和500 nmol/L正、反向引物。采用MyiQ單色實時PCR檢測系統(tǒng)(Bio-Rad)，95 ℃ 30 min; 95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s,循環(huán)40次。β-actin作為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法分析基因的相對表達(dá)量。

2.3 細(xì)胞對順鉑的敏感性檢測 首先，采用CCK-8的方法檢測胃癌細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度。將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞以1×108/L密度接種于96孔板中，待細(xì)胞長至90%融合進行同步化處理并加入終濃度分別為0、0.25、0.5、1、2、4、8和16 mg/L的順鉑，繼續(xù)培養(yǎng)48 h時，加入CCK-8 100 μL孵育2 h，測定450 nm波長處的吸光度值，計算細(xì)胞的生存率。其次，采用臺盼藍(lán)染色后血球計數(shù)板計數(shù)活細(xì)胞數(shù)量。取上述順鉑處理的細(xì)胞，胰酶消化后，冷PBS重懸2次，制備單個細(xì)胞懸液，適當(dāng)稀釋后，向細(xì)胞懸液中加入0.4%臺盼藍(lán)溶液，使臺盼藍(lán)終濃度為0.04%，倒置顯微鏡下用血球計數(shù)板計數(shù)無染色的活細(xì)胞數(shù)量(死細(xì)胞被染成淡藍(lán)色)。

2.4 乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性的測定 采用乳酸脫氫酶(LDH)相對活性變化檢測細(xì)胞毒性。將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞以1×108/L密度接種于96孔板中，待細(xì)胞長至90%融合進行同步化處理并加入終濃度分別為0、0.25、0.5、1、2、4、8和16 mg/L的順鉑，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。按照CytoTox 96?分析試劑盒實驗說明書定量地測量LDH在細(xì)胞裂解后的釋放量。記錄酶標(biāo)儀下測定490 nm波長處的吸光度(A)值。LDH活性(%)=(處理組A值-空白對照A值)/(對照組A值-空白對照A值)× 100%。

2.5 Ad-Fas腺病毒載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染 腺病毒載體的構(gòu)建參照文獻(xiàn)報道的方法[13]。Ad-Fas的制備按照 AdMax (Microbix)和pSilencerTMadeno 1.0-CMV System (Ambion)的說明書進行。線性化重組腺病毒質(zhì)粒用HEK293A細(xì)胞進行包裝及擴增，經(jīng)CsCl純化后，用含10%甘油的Tris緩沖液(20 mmol/L)進行透析，于-80 ℃保存。Ad-LacZ作為對照，用Western blot法檢測胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染Ad-Fas腺病毒48 h后Fas的表達(dá)。

2.6 細(xì)胞凋亡的檢測 流式細(xì)胞術(shù)(Annexin V/PI雙染色法)檢測細(xì)胞凋亡，將各組細(xì)胞消化后1 000×g離心5 min，加入binding buffer重懸細(xì)胞。先加入Annexin V-FITC混勻后，室溫避光靜置10 min，后加PI染液，室溫下避光染色10 min，上機檢測，激發(fā)波長Ex=488 nm；發(fā)射波長Em=530 nm。

2.7 Western blot實驗 收集各實驗組蛋白樣品并用BCA試劑盒進行蛋白定量，調(diào)整各組上樣量后加入上樣緩沖液，98 ℃水浴變性5 min。8% SDS-PAGE電泳后電轉(zhuǎn)至PVDF膜(約90 min)，依照試劑盒說明用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入P38/p-P38、JNK/p-JNK、caspase-8/cleaved caspase-8、caspase-3/cleaved caspase-3及β-actin單克隆抗體，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌5 min 3次，分別加入抗HRP標(biāo)記的II抗，室溫孵育1.5 h，TBST洗滌10 min 3次。于暗室中將PVDF膜的蛋白面浸入HRP-ECL發(fā)光液中激發(fā)熒光，壓X片、顯影并定影。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

將數(shù)據(jù)錄入SPSS 13.0標(biāo)準(zhǔn)版統(tǒng)計軟件包行數(shù)據(jù)分析，所有實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，計量資料兩組之間的比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，各組均數(shù)間的兩兩比較用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Fas的表達(dá)與胃癌細(xì)胞順鉑耐藥之間的關(guān)系

我們首先檢測了胃癌順鉑耐藥細(xì)胞株SGC7901/DDP及其對照親本細(xì)胞株SGC7901的IC50[SGC7901/DDP：(5.51±0.23) mg/L;SGC7901：(0.62±0.02) mg/L]，結(jié)果證明SGC7901/DDP對順鉑的耐藥性明顯增強。同時我們同時檢測了這2株細(xì)胞Fas的mRNA及蛋白表達(dá)情況，耐藥細(xì)胞株SGC7901/DDP中Fas的mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯低于親本細(xì)胞株；在親本細(xì)胞株SGC7901中，F(xiàn)as的蛋白表達(dá)水平隨著順鉑的濃度增加不斷降低。該結(jié)果提示Fas的表達(dá)可能與胃癌順鉑耐藥之間存在相關(guān)關(guān)系。并且，在親本細(xì)胞株SGC7901中，不同濃度順鉑處理細(xì)胞后，LDH活性沒有明顯變化，見圖1。

Figure 1.The relationship between Fas expression and cisplatin resistance in the stomach cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsSGC7901;#P<0.05vs0 mg/L group.

圖1 Fas的表達(dá)與胃癌細(xì)胞順鉑耐藥之間的關(guān)系

2 Fas過表達(dá)對耐藥細(xì)胞株SGC7901/DDP順鉑敏感性的影響

為進一步證明Fas的表達(dá)與胃癌順鉑耐藥之間的相互關(guān)系，我們在耐藥細(xì)胞株SGC7901/DDP中過表達(dá)Fas，并檢測其對順鉑耐藥性的變化，CCK-8實驗的結(jié)果顯示，SGC7901/DDP細(xì)胞過表達(dá)Fas后對順鉑的敏感性明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.Overexpression of Fas increased the sensitivity of the SGC-7901/DDP cells to cisplatin. Ctrl: control. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsCtrl.

圖2 過表達(dá)Fas可提高耐藥細(xì)胞SGC7901/DDP對順鉑的敏感性

3 Fas過表達(dá)對細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

接著我們觀察了Fas過表達(dá)對細(xì)胞活力的影響，結(jié)果顯示，在SGC7901/DDP中過表達(dá)Fas之后，細(xì)胞活力明顯降低(P<0.05)。細(xì)胞的凋亡情況檢測則發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)as過表達(dá)之后，耐藥細(xì)胞的凋亡明顯增加(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.The effects of Fas overexpression on the viability (A) and apoptosis (B) of the SGC7901/DDP cells. Ctrl: control. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsCtrl.

圖3 SGC7901/DDP細(xì)胞過表達(dá)Fas后的細(xì)胞活力和凋亡情況

4 Fas過表達(dá)對凋亡信號通路的影響

Western blot法檢測結(jié)果顯示SGC7901/DDP細(xì)胞過表達(dá)Fas之后，p-P38和p-JNK蛋白水平明顯增加(P<0.05)，而P38和JNK的表達(dá)無明顯變化，提示P38/JNK凋亡信號通路被激活。

除此之外，我們還檢測了caspase家族凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在SGC7901/DDP中過表達(dá)Fas之后激活型caspase-8和激活型caspase-3的蛋白水平增加，提示過表達(dá)Fas可誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞中caspase家族凋亡相關(guān)蛋白的活化(P<0.05)，見圖4。

Figure 4.The effect of Fas on apoptosis-related pathway in the SGC7901/DDP cells. Ctrl: control. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsctrl.

圖4 Fas過表達(dá)對凋亡信號通路的影響

討 論

細(xì)胞增殖與凋亡的失平衡被認(rèn)為是腫瘤化療耐藥發(fā)生的一個重要原因。在參與調(diào)控細(xì)胞凋亡的眾多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，F(xiàn)as/FasL通路是重要凋亡信號通路之一，參與腫瘤發(fā)生和發(fā)展[14]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌順鉑耐藥細(xì)胞株中Fas mRNA和蛋白的表達(dá)水平均顯著增加，提示Fas可能參與調(diào)控胃癌順鉑耐藥現(xiàn)象的發(fā)生。通過構(gòu)建Fas過表達(dá)載體，我們發(fā)現(xiàn)在胃癌順鉑耐藥細(xì)胞SGC7901/DDP中過表達(dá)Fas可提高細(xì)胞對順鉑的敏感性。因此我們認(rèn)為，F(xiàn)as可逆轉(zhuǎn)胃癌順鉑耐藥。

為進一步了解Fas逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥的作用機制，我們檢測了耐藥細(xì)胞SGC7901/DDP過表達(dá)Fas后，細(xì)胞的活力及凋亡水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Fas可促進SGC7901/DDP的凋亡，同時抑制細(xì)胞生長。由此我們認(rèn)為Fas逆轉(zhuǎn)胃癌順鉑耐藥可能是通過抑制耐藥細(xì)胞生長和周期轉(zhuǎn)換，同時促進耐藥細(xì)胞凋亡來實現(xiàn)的。細(xì)胞凋亡是一個涉及多條信號通路、調(diào)控精細(xì)復(fù)雜的過程。Fas作為公認(rèn)的凋亡受體蛋白，不僅可通過與FasL結(jié)合，激活死亡受體通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；還可以激活JNK和P38 MAPK等促凋亡信號通路，使細(xì)胞對caspase介導(dǎo)的凋亡敏感性增加[15-17]。實驗中我們發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)as過表達(dá)可促進耐藥細(xì)胞中JNK及P38的磷酸化，激活JNK和P38信號通路；同時死亡蛋白酶caspase家族中2個關(guān)鍵的蛋白分子caspase-8和caspase-3被激活。Fas逆轉(zhuǎn)胃癌順鉑耐藥可能與凋亡信號通路的激活有關(guān)，但是除JNK和P38MAPK信號通路之外，是否還有其它通路的參與及其具體的調(diào)控機制還有待進一步的研究。

綜上所述，胃癌順鉑耐藥細(xì)胞中過表達(dá)Fas可恢復(fù)細(xì)胞對順鉑的敏感性，促進細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞生長，其機制可能與JNK和P38 MAPK信號通路的激活有關(guān)。

[1] Ashraf N, Hoffe S, Kim R. Adjuvant treatment for gastric cancer: chemotherapy versus radiation[J]. Oncologist, 2013, 18(9):1013-1021.

[2] Galluzzi L, Senovilla L, Vitale I, et al. Molecular mechanisms of cisplatin resistance[J]. Oncogene, 2012, 31(15):1869-1883.

[3] Wen X, Buckley B, McCandlish E, et al. Transgenic expression of the human MRP2 transporter reduces cisplatin accumulation and nephrotoxicity inMrp2-Null mice[J]. Am J Pathol, 2014, 184(5):1299-1308.

[4] Juliachs M, Munoz C, Moutinho CA, et al. The PDGFRβ-AKT pathway contributes to CDDP-acquired resistance in testicular germ cell tumors[J]. Clin Cancer Res, 2014, 20(3):658-667.

[5] Marshall EA, Ng KW, Anderson C, et al. Gene expression analysis of microtubule affinity-regulating kinase 2 in non-small cell lung cancer[J]. Genom Data, 2015, 6:145-148.

[6] Ali AY, Kim JY, Pelletier JF, et al. Akt confers cisplatin chemoresistance in human gynecological carcinoma cells by modulating PPM1D stability[J]. Mol Carcinog, 2015, 54(11):1301-1314.

[7] Afonso J, Santos LL, Miranda-Gon?alves V, et al. CD147 and MCT1-potential partners in bladder cancer aggressiveness and cisplatin resistance[J]. Mol Carcinog, 2015, 54(11):1451-1466.

[8] Gryko M, Guzińska-Ustymowicz K, Pryczynicz A, et al. Correlation between Fas and FasL protein expression in normal gastric mucosa and gastric cancer[J]. Folia Histochem Cytobiol, 2011, 49(1):142-147.

[9] Mo JS, Alam KJ, Kang IH, et al. MicroRNA 196B regulates FAS-mediated apoptosis in colorectal cancer cells[J]. Oncotarget, 2015, 6(5):2843-2855.

[10]Horton JK, Siamakpour-Reihani S, Lee CT, et al. FAS death receptor: a breast cancer subtype-specific radiation response biomarker and potential therapeutic target[J]. Radiat Res, 2015, 184(5):456-469.

[11]Siena L, Pace E, Ferraro M, et al. Gemcitabine sensitizes lung cancer cells to Fas/FasL system-mediated killing[J]. Immunology, 2014, 141(2):242-255.

[12]Galenkamp KM, Carriba P, Urresti J, et al. TNFα sensitizes neuroblastoma cells to FasL-, cisplatin- and etoposide-induced cell death by NF-κB-mediated expression of Fas[J]. Mol Cancer, 2015, 14:62.

[13]Wu W, Wang HD, Guo W, et al. Up-regulation of Fas reverses cisplatin resistance of human small cell lung cancer cells[J]. J Exp Clin Can-cer Res, 2010, 29:49.

[14]Jin Y, Yan EZ, Fan Y, et al. Sodium ferulate prevents amyloid-beta-induced neurotoxicity through suppression of p38 MAPK and upregulation of ERK-1/2 and Akt/protein kinase B in rat hippocampus[J]. Acta Pharmacol Sin, 2005, 26(8):943-951.

[15]Qi S, Fu W, Wang C, et al. BPA-induced apoptosis of rat Sertoli cells through Fas/FasL and JNKs/p38 MAPK pathways[J]. Reprod Toxicol, 2014, 50:108-116.

[16]Chen KC, Chang LS. Notexin upregulates Fas and FasL protein expression of human neuroblastoma SK-N-SH cells through p38 MAPK/ATF-2 and JNK/c-Jun pathways[J]. Toxicon, 2010, 55(4):754-761.

[17]Kober AM, Legewie S, Pforr C, et al. Caspase-8 activity has an essential role in CD95/Fas-mediated MAPK activation[J]. Cell Death Dis, 2011, 2:e212.

(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

△ 通訊作者 Tel: 020-38274637； E-mail: zslyjohn@163.com

Role of Fas overexperssion in reversing cisplatin resistance in stomach cancer cells

CHEN Gang1, SHEN-TU Yang-ping2

(1DepartmentofOncology,ArmedPoliceCorpsofZhejiangJiaxingHospital,Jiaxing314000,China;2FunctionLaboratoryCentre,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325000,China.E-mail:hg15868181011@163.com)

AIM: To study the effect of Fas on cisplatin resistance in stomach cancer cells and its possible mechanisms.METHODS: The expression of Fas at mRMA and protein levels in SGC-7901 cells and SGC-7901/DDP cells was determined by RT-qPCR and Western blot. Fas-containing adenovirus vector was transfected into the SGC-7901/DDP cells to upregulate Fas expression. The cell viability was detected by CCK-8 assay. The cell cycle and cell apoptosis were analyzed by flow cytometry. The protein levels of Fas, P38/p-P38, JNK/p-JNK, cleaved caspase-8/caspase-8 and cleaved caspase-3/caspase-3 were detected by Western blot.RESULTS: The expression of Fas at both mRNA and protein levels was significantly downregulated in the SGC-7901/DDP cells. Fas expression was decreased by cisplatin in a dose-dependent manner in the SGC-7901 cells. Overexpression of Fas suppressed the viability and induced apoptosis in the SGC-7901/DDP cells, and upregulated the protein levels of p-P38, p-JNK, cleaved caspase-8 and cleaved caspase-3.CONCLUSION: Overexpression of Fas increases the sensitivity of the SGC-7901/DDP cells to cisplatin, and inhibits the cell growth and promotes cell apoptosis. The mechanism may be related to the activation of JNK and P38 pathway.

Fas; Stomach cancer; Cisplatin resistance; Cell apoptosis

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net

1000- 4718(2016)09- 1568- 06

2015- 11- 18

2016- 06- 07

溫州市科技計劃項目(No.2012S0441； No.Y20130046； No.Y20140296)

△通訊作者 Tel: 0573-82824033; E-mail: hg15868181011@163.com

R735.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.09.006