土槿皮乙酸誘導腦膠質瘤細胞株U87阻滯于M期并發生凋亡*

何 露， 溫創宇， 王慧慧， 楊湘玲， 劉煥亮2, ， 李 中， 5△

(中山大學附屬第六醫院 1神經科， 2檢驗科， 3廣東省胃腸病學研究所，廣東 廣州 510655； 4中山大學中山醫學院廣東省腦功能與腦疾病重點實驗室，廣東 廣州 510080； 5中山大學深圳研究院，廣東 深圳518057)

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土槿皮乙酸誘導腦膠質瘤細胞株U87阻滯于M期并發生凋亡*

何 露1, 4， 溫創宇3， 王慧慧3， 楊湘玲3， 劉煥亮2, 3， 李 中1, 4， 5△

(中山大學附屬第六醫院1神經科，2檢驗科，3廣東省胃腸病學研究所，廣東 廣州 510655；4中山大學中山醫學院廣東省腦功能與腦疾病重點實驗室，廣東 廣州 510080；5中山大學深圳研究院，廣東 深圳518057)

目的： 通過研究土槿皮乙酸對腦膠質瘤細胞株U87增殖與凋亡的影響，探討土槿皮乙酸對腦膠質瘤的潛在應用價值。方法: 用不同濃度土槿皮乙酸處理U87細胞，并于不同時點觀察細胞形態改變；采用MTS法對U87細胞進行細胞活力測定；采用流式細胞術和Western blot法檢測土槿皮乙酸對細胞周期的影響；采用Anne-xin V/PI雙染流式細胞術檢測細胞凋亡；利用Western blot法檢測caspase通路相關蛋白(cleaved PARP、caspase-3、procaspase-9和caspase-8)的變化情況。結果: 土槿皮乙酸明顯抑制腦膠質瘤U87細胞的活力，能使細胞阻滯于M期，并通過caspase通路誘導細胞發生凋亡。結論: 土槿皮乙酸能使腦膠質瘤細胞株U87細胞阻滯于M期，并誘導其凋亡。

腦膠質瘤； 土槿皮乙酸； 細胞周期； 細胞活力； 細胞凋亡

腦膠質瘤是中樞神經系統(central nervous system，CNS)常見的發生于神經外胚層的惡性腫瘤，占顱內腫瘤的40%左右[1-2]。腦膠質瘤傳統的治療方案包括外科手術、放療和化療。由于腦膠質瘤具有強侵襲性的特征，手術過程中很難與正常腦組織區分，因此手術后的輔助性化療顯得非常重要。目前臨床上的一線化療藥物是替莫唑胺(temozolomide，TMZ)，該藥由于其口服給藥方便以及治療效果較好，在腦膠質瘤化療中占有重要的地位，然而其在用藥過程中可產生極大的耐藥復發問題及不良反應(如減少血小板及中性粒細胞、惡心、嘔吐和倦怠等)[3-5]，大大地影響了該藥治療效果，用于治療腦膠質瘤的新藥研究迫在眉睫。

土槿皮乙酸(pseudolaric acid B，PAB)是從來源于松科植物金錢松的根皮和近根樹皮的土槿皮提取的重要成分之一，分子式為C23H28O8[6]。土槿皮乙酸早期被人們用于抗真菌治療，近年來越來越多的研究表明土槿皮乙酸能夠有效殺傷包括人肝癌、胃癌、大腸癌、胰腺癌及大鼠惡性膠質瘤等多種腫瘤細胞的同時卻不損害正常細胞[6-7]。本研究以腦膠質瘤U87細胞株為研究模型，探討土槿皮乙酸對其增殖和凋亡的影響，進而探討土槿皮乙酸治療腦膠質瘤的潛在應用價值。

材 料 和 方 法

1 材料

腦膠質瘤U87細胞由本實驗室保存。DMEM培養基和胎牛血清為Gibco產品；土槿皮乙酸購自辰光生物有限公司；MTS試劑為Promega產品；碘化丙啶(propidium iodide，PI)購自BD。細胞凋亡雙染(Annexin V/PI)檢測試劑盒購自江蘇凱基生物科技發展有限公司；p-histone(Ser10)H3抗體購自Signalway Antibody；抗caspase-8、procaspase-3、cleaved caspase-3及PARP的抗體為CST產品；抗procaspase-9、β-actin抗體和HRP標記的Ⅱ抗為Proteintech Group產品。

2 主要方法

2.1 細胞培養 U87細胞用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM于37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養，實驗所用的細胞均處于對數生長期。

2.2 細胞活力檢測 用MTS法測細胞活力抑制情況，設空白對照組、對照組和實驗組；取對數生長期的U87細胞接種于96孔板，對照組和實驗組每孔接種100 μL細胞懸液，共5 000個細胞，空白對照組加入200 μL不含細胞的培養基，待細胞過夜貼壁后實驗組每孔再加入100 μL含土槿皮乙酸培養基，使加入終濃度為0.1、1、10及100 μmol/L，對照組加入100 μL含血清的培養基，空白對照組不加，每組6個重復孔。不同劑量的土槿皮乙酸作用72 h后于實驗各孔分別加MTS試劑40 μL，37 ℃繼續孵育4 h，于酶聯免疫檢測儀測定490 nm處各孔的吸光度(A)值。細胞活力(%)=(A實驗組-A空白對照組)/(A對照組-A空白對照組)，以濃度為橫坐標，細胞活力為縱坐標繪制土槿皮乙酸對U87細胞生長活力抑制率柱狀圖。

2.3 流式細胞術檢測細胞周期 取對數生長期細胞接種于6孔板，每孔接種2 mL細胞懸液，共5×105個細胞，待細胞過夜貼壁后實驗組加入終濃度為0.5、1及2 μmol/L土槿皮乙酸，對照組不加藥，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度細胞培養箱中培養，24 h后收集細胞并用75%乙醇于4 ℃固定過夜，過夜后離心去除固定液并用PBS清洗細胞2次，清洗后加入PI工作液500 μL，室溫避光孵育15 min后于流式細胞儀進行細胞周期檢測，細胞周期結果用BD FACSCanto II軟件進行分析。

2.4 Annexin V/PI雙標記法流式細胞術測定細胞凋亡 取對數生長期細胞接種于6孔板，每孔接種2 mL細胞懸液，共5×105個細胞，待細胞過夜貼壁后實驗組加入終濃度為0.5、1及2 μmol/L土槿皮乙酸，對照組不加藥，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度細胞培養箱中培養，72 h后收集細胞，經PBS清洗2次后加入500 μL binding buffer、5 μL Annexin V和5 μL PI。室溫避光孵育15 min后用流式細胞儀檢測細胞凋亡。在雙染流式細胞計數儀的散點圖上，取右下象限和右上象限的總和(即Annexin V陽性細胞群)計為凋亡細胞。實驗完全按照江蘇凱基生物科技發展有限公司提供的試劑說明書進行操作，實驗重復3次。

2.5 Western blot法檢測蛋白水平 不同濃度的土槿皮乙酸處理U87細胞后收集細胞，PBS清洗細胞3次，然后加入蛋白裂解液充分裂解細胞提取蛋白,并用BCA蛋白定量法測定蛋白濃度。用10%～15% SDS聚丙烯酰胺凝膠將蛋白進行電泳(100～130 V恒壓電泳約90 min)，蛋白分離后100 V恒壓轉膜約120 min，5%牛奶室溫封閉膜1 h，用相應的Ⅰ抗4 ℃孵育膜過夜，次日將膜清洗后加入HRP標記的Ⅱ抗室溫孵育1 h，洗滌后ECL發光液將膜顯色，暗房曝光，使用ImageJ軟件分析條帶灰度值。

3 統計學處理

數據采用均數±標準差(mean±SD)表示，用GraphPad Prism 6.01軟件對數據進行單因素方差分析，均數間兩兩比較用Tukey檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 PAB對U87細胞活力及細胞形態學的影響

PAB對U87細胞的生長有明顯抑制作用，用不同濃度PAB處理U87細胞，并在不同時點對細胞進行觀察拍照，當作用24 h時，1 μmol/L PAB可明顯抑制U87的細胞生長，并使細胞出現由多邊形變成圓形、發生空泡和胞膜破碎等具有死亡特征的形態學改變。隨著時間的推進，在低濃度組也可出現該現象(未呈現)。PAB處理細胞72 h后用MTS法檢測PAB對U87細胞活力的影響，結果顯示PAB能夠明顯抑制U87細胞活力(P<0.05)，經計算，PAB對U87細胞活力半數抑制率IC50是1.76 μmol/L,見圖1、2。

Figure 1.The effects of PAB on the morphological changes of U87 cells.

圖1 PAB對U87細胞形態的影響

2 PAB能使U87細胞阻滯于M期

用不同濃度PAB處理細胞24 h，當PAB濃度達1 μmol/L時，U87的G2/M期的比例要明顯高于對照組(圖3)，其中對照組G2/M比例為24%，而1 μmol/L PAB處理組G2/M比例則增加至35.83%，說明PAB能使U87阻滯于G2/M期，而該比例隨著PAB濃度的增加而增加，呈濃度依賴性。為了辨別清楚PAB阻滯U87于G2期還是M期，我們使用Western blot法檢測經PAB處理后U87細胞中M期標志性蛋白p-histone H3的變化，結果如圖4顯示，與對照組相比，PAB處理后的U87細胞的p-histone H3明顯上調(P<0.05)，說明PAB阻滯細胞于M期而非G2期。

Figure 2. The effects of PAB on the viability of U87 cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vs0 μmol/L.

圖2 PAB對U87細胞活力的影響

Figure 3. PAB induced G2/M phase arrest in the U87 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L.

圖3 PAB誘導U87阻滯于G2/M期

Figure 4. PAB up-regulated the protein levels of p-histone H3. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L.

圖4 PABs上調p-histone H3的蛋白表達水平

3 PAB對U87細胞凋亡的誘導

從圖1和圖3結果可以看出，隨著處理濃度的增加，PAB能夠誘導U87細胞死亡。為了探討PAB是否誘導U87細胞發生凋亡，我們采用Annexin V/PI雙染流式細胞術進行檢測。經不同濃度PAB處理72 h后，當PAB濃度達1 μmol/L時U87細胞的凋亡率明顯升高，其中對照組凋亡率為6.45%，而1 μmol/L PAB凋亡率則增加至25.55%，PAB誘導U87細胞凋亡作用呈劑量依賴性，表明PAB可以誘導U87細胞發生凋亡,見圖5。

4 PAB通過caspase通路誘導U87細胞發生凋亡

如圖6結果顯示，用不同濃度PAB處理細胞72 h，當濃度達1 μmol/L時，caspase家族相關蛋白caspase-3、caspase-9和caspase-8前體減少，caspase-3和caspase-8出現切割帶，且作為caspase的下游PARP也出現相應切割帶，該結果的變化呈現PAB濃度依賴性。以上結果說明，PAB可能是通過caspase通路誘導U87細胞發生凋亡。

Figure 5.PAB induced the apoptosis of U87 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L.

圖5 PAB誘導U87細胞發生凋亡

Figure 6. The effects of PAB on the protein levels of apoptosis-related proteins cleaved PARP, caspase-3, procaspase-9 and caspase-8 in the U87 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L.

圖6 PAB對U87凋亡相關蛋白cleaved PARP、caspase-3、procaspase-9和caspase-8表達的影響

討 論

本研究選取了腦膠質瘤細胞株U87為研究對象，探討PAB對U87增殖和凋亡的作用及其相關分子學機制。實驗結果表明，PAB能夠抑制U87細胞的活力，使細胞阻滯于M期，并誘導細胞發生凋亡。

實驗證實PAB能夠明顯抑制U87細胞活力；通過MTS法和鏡下觀察，我們可以發現隨著PAB濃度的增加，U87細胞的生長抑制率明顯增加。已有多篇文獻報道PAB能夠作用于腫瘤細胞微管蛋白，從而使細胞阻滯于M期[6,8-9]，為此，我們先用流式細胞術和Western blot法檢測PAB對U87細胞周期的影響，結果顯示PAB能夠使細胞阻滯于M期從而抑制細胞增殖。鏡下觀察發現高濃度或長時間的PAB的處理能誘導細胞死亡，細胞周期結果顯示高濃度PAB處理細胞時sub-G1的出現也證實了這一現象；細胞凋亡為藥物誘導細胞死亡一種常見方式，也有多篇文獻報道PAB使腫瘤細胞阻滯于M期后誘導細胞發生凋亡[10-11]。Annexin V/PI雙標記流式細胞術檢測結果顯示PAB的確能誘導細胞發生凋亡，由于凋亡發生時間較晚，有可能是發生在細胞周期阻滯之后。另外，Western blot實驗結果顯示PAB能夠使procaspase-3、procaspase-9和procaspase-8的表達下降，且呈濃度依賴性，另caspase-8、caspase-3和caspase-3的下游PARP也出現呈劑量依賴性的切割，表明PAB激活了caspase級聯通路。上述結果說明，PAB能夠抑制U87細胞活力，使細胞阻滯于M期，這可能與PAB作用于腫瘤M期細胞微管有關；由于腫瘤細胞增殖活躍，與正常細胞相比有更多的細胞處于M期，這也能部分解釋為什么PAB在一定濃度下能作用于腫瘤細胞卻不影響正常細胞，但是有關PAB對U87微管的作用本文并未涉及，仍需進一步探討；在PAB的作用下，U87會發生凋亡，其發生機制可能是通過caspase通路進行，盡管PAB誘導細胞發生凋亡時間較誘導細胞發生周期阻滯時間晚，但本文并未有直接證據說明兩者的前后關系，相關研究也需進一步進行；另外，目前PAB對各種腫瘤細胞均顯示出了很好的抗腫瘤性，但是PAB的抗腫瘤分子機制仍不是很清楚，而PAB抗腦膠質瘤的確切分子機制也是未來需進一步探討的課題。

總之，PAB能通過阻滯腦膠質瘤細胞于M期從而抑制細胞增殖，并誘導細胞發生凋亡，對腦膠質瘤具有重要的治療前景。

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(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Pseudolaric acid B induces glioblastoma cell line U87 mitotic arrest and apoptosis

HE Lu1, 4, WEN Chuang-yu3, WANG Hui-hui3, YANG Xiang-ling3,LIU Huan-liang2, 3, LI Zhong1, 4, 5

(1DepartmentofNeurology，2DepartmentofClinicalLaboratory，3GuangdongInstituteofGastroenterology,TheSixthAffi-liatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510655,China;4GuangdongProvincialKeyLaboratoryofBrainFunctionandDisease,ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China;5ShenzhenResearchInstituteofSunYat-senUnivesity,Shenzhen518057,China.E-mail:zslyjohn@163.com)

AIM: To investigate the effects of pseudolaric acid B on the growth and apoptosis of glioblastoma cell line U87. METHODS: The cell morphological changes were observed under inverted microscope. The cell viability was evaluated by MTS assay. The cell cycle was analyzed by flow cytometry and Western blot. The cell apoptosis was detected by flow cytometry. The changes of apoptosis-related proteins cleaved PARP, caspase-3, procaspase-9 and caspase-8 were determined by Western blot. RESULTS: Pseudolaric acid B inhibited the viability of U87 cells, arrested U87 cells in mitosis. Apoptosis of U87 cells was induced by pseudolaric acid B. The caspase pathway was activated. CONCLUSION: Pseudolaric acid B induces glioblastoma cell line U87 mitotic arrest and apoptosis.

Glioblastoma; Pseudolaric acid B; Cell cycle; Cell viability; Apoptosis

雜志網址： http://www.cjpp.net

1000- 4718(2016)09- 1574- 05

2016- 04- 05

2016- 05- 30

廣東省自然科學基金資助項目(No. 2015A030313128)；廣東省自然科學基金資助項目(No. 2014A030307025)；廣州市天河區科技計劃重點項目(No. 201404KW028)；深圳市科技計劃項目(No. JCYJ20150403151851068)

R739.4; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.09.007