過表達Rip2對人胰腺癌細胞Panc-1凋亡的影響*

楊文欣， 周 晗， 梁若龍， 胡巢鳳

(暨南大學醫學院病理生理學系，國家中醫藥管理局病理生理學實驗室，廣東 廣州 510632)

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過表達Rip2對人胰腺癌細胞Panc-1凋亡的影響*

楊文欣▲， 周 晗▲， 梁若龍， 胡巢鳳△

(暨南大學醫學院病理生理學系，國家中醫藥管理局病理生理學實驗室，廣東 廣州 510632)

目的： 觀察受體相互作用蛋白2(Rip2)對人胰腺癌細胞Panc-1凋亡的影響。方法：采用JetPRIME試劑分別將pEGFP-C2和pEGFP-Rip2質粒轉染入Panc-1細胞，實驗分為對照組、pEGFP-C2組和pEGFP-Rip2組。轉染后培養細胞48 h，采用流式細胞術檢測細胞凋亡率；Western blot檢測細胞Rip2水平及凋亡相關蛋白Bax、胞漿細胞色素c(Cyt-c)和Bcl-2蛋白表達；比色法檢測細胞caspase-3的活性。結果：轉染pEGFP-Rip2細胞Rip2蛋白表達明顯增加。流式細胞術檢測表明，pEGFP-Rip2組的細胞凋亡率明顯高于對照組和pEGFP-C2組。與對照組和pEGFP-C2組相比，pEGFP-Rip2組的Bax和胞漿Cyt-c蛋白表達明顯升高，而Bcl-2蛋白水平則顯著降低。并且，pEGFP-Rip2組細胞caspase-3活性明顯高于對照組和pEGFP-C2組。結論：過表達Rip2能誘導Panc-1細胞凋亡，其作用機制可能與Rip2上調Bax以及胞漿Cyt-c蛋白表達，下調Bcl-2蛋白水平，增加caspase-3活性，從而激活內源性凋亡途徑有關。

受體相互作用蛋白2； 細胞凋亡； Panc-1細胞

近年來的研究表明，NOD 樣受體(NOD-like receptors，NLRs)為胞漿內的模式識別受體，可識別微生物高度保守相似的結構，發揮獨特的天然免疫功能。NLRs主要有3個功能結構域組成：C末端是含有亮氨酸的重復序列，可識別病原相關分子模式；中間的核苷酸結合位點；N末端是能與下游銜接蛋白銜接的結構域[1-2]。受體相互作用蛋白2(receptor-interacting protein 2，Rip2)是部分NLRs家族成員(如NOD1和NOD2等)信號通路的下游銜接分子，可激活NF-κB，促進多種炎癥因子的產生[3-4]。McCarthy等[5]研究發現,過表達Rip2能誘導人乳腺癌細胞MCF-7凋亡，但其作用機制尚不清楚。近來有研究發現，Rip2對B 細胞性非霍奇金淋巴瘤(B-cell non-Hodgkin’s lymphoma，B-NHL)細胞株Ramos細胞和膠質母細胞瘤細胞株U87MG具有明顯的促增殖作用，在Ramos細胞中，Rip2通過非經典NF-κB通路的活化及可能協同經典NF-κB通路參與NF-κB介導的抗凋亡作用[6]。這表明Rip2的作用具有細胞特異性，對細胞的生存和凋亡起著雙向調控的作用。國內外對Rip2功能研究多集中在其介導的炎癥反應，對其在凋亡中的作用及機制鮮有報道。因此，本實驗主要研究過表達Rip2對人胰腺癌細胞Panc-1凋亡的影響，并進一步探討Rip2的作用機制，為臨床治療胰腺癌尋找新的靶點。

材 料 和 方 法

1 材料

人胰腺癌細胞Panc-1由中山大學中山醫學院惠贈；pEGFP-C2空質粒為本實驗室保存物品；pEGFP-Rip2重組質粒由本實驗室構建。RPMI-1640細胞培養基、PBS、青霉素和鏈霉素為含HyClone產品；細胞轉染試劑JetPRIME購自Polyplus；Annexin V-PE/7-AAD和caspase-3活性檢測試劑盒購自Biovision；Rip2多克隆抗體為Santa Cruz產品；Bax、Bcl-2、細胞色素c(cytochrome c，Cyt-c)和GAPDH抗體購自Cell Signaling Technology；胎牛血清購于Biological Industries；其它生化試劑為進口分裝或國產分析純產品。

2 方法

2.1 Panc-1細胞培養及質粒轉染 細胞采用10%胎牛血清的RPMI-1640細胞培養基培養，同時加入1×105U/L 青霉素和 100 mg/L 鏈霉素，在37 ℃、5% CO2培養箱中進行細胞培養。以每孔7×104細胞接種于24孔板中，培養過夜后進行質粒轉染。轉染時將質粒及轉染試劑JetPRIME加入培養板中，左右搖晃使其更加均勻，置于培養箱中培養6～8 h后換新鮮的完全培養基，再繼續培養48 h。實驗分對照(control)組: 培養細胞不做任何處理；pEGFP-C2組： pEGFP-C2空質粒轉染至細胞內； pEGFP-Rip2組：pEGFP-Rip2重組質粒轉染至細胞內。

2.2 流式細胞術檢測細胞凋亡 每孔加入不含EDTA的胰酶，消化后用EP管小心收集細胞，用PBS洗滌細胞2次。每管細胞加入200 μL 1×binding buffer重懸細胞，再在每管細胞重懸液中加入5 μL Annexin V-PE，混勻后于室溫下避光孵育15 min。之后每管加入5 μL 7-AAD吹打混勻后即可用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。為保證實驗結果準確，染色后4 h內用流式細胞儀檢測。

2.3 Western blot檢測蛋白表達 用含0.25% EDTA的胰酶消化細胞，收集Panc-1細胞，用預冷的PBS洗滌2次，加入100 g/L PMSF的細胞裂解液和1 μL PMSF蛋白酶抑制劑，吹打混勻，之后置于冰上孵育30 min，4 ℃ 12 000 r/min離心30 min，收集上清。此外，收集各組細胞于EP管中。每管加入胞漿蛋白提取試劑A 80 μL，混勻后孵育20 min。然后每管加入胞漿蛋白提取試劑B 5 μL，混勻后16 000 r/min離心5 min，上清為要提取的胞漿蛋白。BCA蛋白定量測定試劑盒檢測蛋白濃度。

用SDS-PAGE分離蛋白后，將蛋白通過電轉移的方式轉移至硝酸纖維薄膜上，再置于封閉液中進行封閉1 h, 用特異性抗體檢測Rip2、Bax和Bcl-2蛋白的表達，以GAPDH作為蛋白內參照。采用蛋白條帶灰度值來表示其相對表達量。

2.4 比色法測定caspase-3活性 收集各組細胞, 用PBS洗滌細胞1次，加入細胞裂解液重懸細胞，冰上孵育15 min，取少量樣品測蛋白濃度。將50 μL細胞重懸液轉移到96孔板中，每孔加入含10 mmol/L DTT的2 × reaction buffer 50 μL及1 mmol/L (DEVD-pNA)5 μL。混勻后37 ℃避光孵育2 h，在多功能酶標儀400/405 nm處測定各孔吸光度(absorbance，A)值，根據樣品蛋白濃度計算出每一樣品的A值，再將該A值與對照組A值相比計算出各組細胞caspase-3的相對活性。

3 統計學處理

數據采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析，計數資料用均數±標準差(mean±SD)表示。多組間比較用單因素方差分析(ono-way ANOVA)，組間均數兩兩比較采用Bonferroni檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 各組細胞形態變化

用倒置顯微鏡觀察各組細胞形態的變化。如圖1所示，轉染pEGFP-C2空質粒后48 h，細胞形態和大小與對照組類似，細胞呈多角形，未發現轉染前后細胞形態有明顯變化。轉染pEGFP-Rip2重組質粒后48 h，可見部分細胞形態從多角形變成細長形。

Figure 1.The changes of cellular morphology in different groups.

圖1 各組細胞形態的變化

2 Western blot檢測重組質粒轉染前及轉染后Rip2蛋白的表達

Western blot檢測細胞的Rip2蛋白的表達情況。結果發現與control組和pEGFP-C2組比較，pEGFP-Rip2重組質粒轉染Panc-1細胞48 h后Rip2蛋白的表達明顯增高，差異有統計學意義(P<0.01)；而control組與pEGFP-C2組相比，Rip2蛋白的表達差異無統計學意義。上述實驗證明pEGFP-Rip2重組質粒成功轉入Panc-1細胞并表達Rip2蛋白，見圖2。

Figure 2.The protein expression levels of Rip2 in the Panc-1 cells with different treatments. Mean±SD.n=3.##P<0.01vscontrol and pEGFP-C2 groups.

圖2 各組Panc-1細胞Rip2蛋白的表達水平比較

3 流式細胞術檢測各組的細胞凋亡率

Annexin-V/7-AAD雙染后，用流式細胞術檢測各組的細胞凋亡率。Q3區表示活細胞，Q1區是壞死細胞，Q4區為早期凋亡細胞，Q2區代表晚期凋亡細胞。實驗發現pEGFP-Rip2組的細胞凋亡率(Q2+Q4)明顯高于control組和pEGFP-C2組(P<0.01)；而control組與pEGFP-C2組比較，2組間細胞凋亡率的差異無統計學意義，見圖3。

4 Rip2對Panc-1細胞Bax和Bcl-2蛋白表達的影響

實驗結果如圖4所示，與control組和pEGFP-C2組比較，pEGFP-Rip2組細胞的Bax和胞漿Cyt-c蛋白表達明顯升高(P<0.01)；而control組和pEGFP-C2組比較，Bax和胞漿Cyt-c蛋白表達的差異無統計學意義。此外，pEGFP-Rip2組細胞的Bcl-2蛋白表達明顯低于control和pEGFP-C2組(P<0.01)；而control組和pEGFP-C2組比較，Bcl-2蛋白表達的差異無統計學意義。

5 Rip2增加Panc-1細胞caspase-3的活性

與control組和pEGFP-C2組比較，pEGFP-Rip2組細胞caspase-3的活性明顯增高(P<0.01)；而control組和pEGFP-C2組相比，caspase-3活性的差異無統計學意義，見圖5。

討 論

凋亡又稱細胞的程序性死亡，是在生理條件下發生的細胞死亡。細胞凋亡與機體的生、老、病、死息息相關，是機體維持內環境穩態的一個重要手段。當遇到各種刺激時機體啟動自殺保護措施，主動清除功能異常的、多余的或者是與機體不相適應的細胞，通過調節細胞增殖與死亡之間的平衡以達到調節機體內環境穩態的目的；一旦這種平衡被打破就會伴隨著各種疾病的發生。如凋亡受阻，某些細胞異常增殖，就會導致癌癥等疾病的發生；如凋亡過度，會導致神經退行性變等。

Figure 3.The effect of Rip2 overexpression on the apoptotic rate of Panc-1 cells. Mean±SD.n=3.##P<0.01vscontrol and pEGFP-C2 groups.

圖3 Rip2過表達對Panc-1細胞凋亡率的影響

Figure 4.The effect of Rip2 overexpression on the protein expression of Bax, cytoplasmic Cyt-c and Bcl-2 in the Panc-1 cells. Mean±SD.n=3.##P<0.01vscontrot and pEGFP-C2 groups.

圖4 Rip2過表達對Panc-1細胞Bax、胞漿Cyt-c和Bcl-2蛋白表達的影響

Figure 5.Rip2 overexpression enhanced caspase-3 activity in the Panc-1 cells. Mean±SD.n=3.##P<0.01vscontrol and pEGFP-C2 groups.

圖5 Rip2過表達促進Panc-1細胞caspase-3活性增強

Rip2屬于Rips家族的一員，大量文獻報道Rip2與固有免疫、適應性免疫和炎癥反應有密切關系，其中也有報道其與細胞凋亡和增殖有關[7]。但是Rip2在不同細胞中具有促凋亡和抗凋亡的不同效應，具有細胞特異性。因此，本實驗主要研究Rip2是否促進人胰腺癌細胞Panc-1凋亡以及其作用機制。本實驗采用了對細胞毒性小、操作簡單而且轉染效率高的陽離子聚合物JetPRIM試劑盒對Panc-1細胞進行瞬時轉染，轉染48 h后用Western blot檢測各組細胞Rip2蛋白表達情況。結果發現轉染pEGFP-Rip2重組質粒組的細胞Rip2蛋白表達明顯高于對照組和pEGFP-C2組；而對照組與pEGFP-C2組比較，細胞Rip2蛋白表達差異無統計學意義，說明pEGFP-Rip2質粒成功轉入Panc-1細胞。由于本實驗所用的質粒帶有綠色熒光蛋白，我們采用紅色熒光染料PE標記的Annexin V與7-AAD雙染進行流式術檢測各組細胞凋亡率。Annexin V-PE/7-AAD雙染時可用來區分存活的細胞、壞死細胞或早期和晚期凋亡細胞[8]。流式細胞術檢測結果顯示，轉染pEGFP-Rip2質粒組細胞凋亡率明顯高于對照組和pEGFP-C2組；而轉染空質粒pEGFP-C2組則對細胞凋亡率無明顯影響。以上實驗證明Rip2能誘導人胰腺癌細胞Panc-1凋亡。Bax和Bcl-2都屬于Bcl-2家族成員，家族成員分兩類，一類是具有抗凋亡作用的蛋白，如Bcl-2、Bcl-xL等，另外一類是具有促凋亡作用的蛋白，如Bax、Bak、Bid等。當Bcl-2等抗凋亡分子的作用受到促凋亡分子的抑制，導致胞漿中Bax等被激活并定位于線粒體膜上，線粒體膜電位降低，使線粒體膜通透性改變，釋放促凋亡物質，如Cyt-c，進而激活下游的細胞凋亡關鍵蛋白酶caspase-3，激活內源性凋亡途徑,導致細胞凋亡[9-11]。本實驗用Western blot法檢測各組細胞Bax和Bcl-2蛋白的表達，發現與對照組和pEGFP-C2組相比，在轉染pEGFP-Rip2重組質粒組的細胞中Bax和胞漿Cyt-c蛋白水平明顯增高；而Bcl-2蛋白水平顯著降低。同時，我們用比色法檢測了凋亡執行蛋白酶caspase-3的活性，實驗結果表明，轉染pEGFP-Rip2重組質粒組的caspase-3活性明顯高于對照組和pEGFP-C2組；而對照組和pEGFP-C2組相比，caspase-3的活性無統計學差異。

綜上所述，Rip2能夠誘導人胰腺癌細胞Panc-1凋亡；其作用機制可能與Rip2上調Bax和胞漿Cyt-c蛋白表達，下調Bcl-2蛋白表達，增加caspase-3活性，從而激活內源性凋亡途徑有關。隨著進一步探討Rip2的促凋亡作用機制，將為臨床治療胰腺癌及其它腫瘤尋找新的靶點。

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(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Effect of Rip2 overexpression on apoptosis in human pancreatic cancer cell line Panc-1

YANG Wen-xin, ZHOU Han, LIANG Ruo-long, HU Chao-feng

(DepartmentofPathophysiology,KeyLaboratoryofPathophysiology,StateAdministrationofTraditionalChineseMedicine，SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:thcf@jnu.edu.cn)

AIM: To observe the effect of receptor-interacting protein 2 (Rip2) overexpression on human pancreatic cancer cell line Panc-1. METHODS: pEGFP-C2 and pEGFP-Rip2 plasmids were respectively transfected into the Panc-1 cells using JetPRIME reagent. The cells were divided into control group, pEGFP-C2 group and pEGFP-Rip2 group. The apoptosis in the cells was detected 48 h after transfection by flow cytometry. Rip2 level and the expression of apoptosis-related proteins， Bax, cytoplasmic cytochrome c (Cyt-c) and Bcl-2， were analyzed by Western blot. The activity of caspase-3 was measured by colorimetric method. RESULTS: Rip2 protein expression significantly increased in the cells transfected with control and pEGFP-C2 plasmids. The apoptotic rate in pEGFP-Rip2 group was higher than that in control group and pEGFP-C2 group, whereas no significant difference of apoptotic rate was observed between control group and pEGFP-C2 group. The protein expression of Bax and cytoplasmic Cyt-c was remarkably increased and the protein expression of Bcl-2 was obviously decreased in pEGFP-Rip2 group as compared with control group and pEGFP-C2 group. The activity of caspase-3 in pEGFP-Rip2 group was obviously increased as compared with control group and pEGFP-C2 group. CONCLUSION: Overexpression of Rip2 is able to induce apoptosis in the Panc-1 cells， and the mechanism may be related to the up-regulation of Bax and cytoplasmic Cyt-c protein expression, down-regulation of Bcl-2 protein expression and enhancement of caspase-3 activity, thus activating intrinsic apoptotic pathway.

Receptor-interacting protein 2; Apoptosis; Panc-1 cells

雜志網址： http://www.cjpp.net

1000- 4718(2016)09- 1584- 05

2016- 05- 01

2016- 08- 24

廣東省自然科學基金資助項目(No. S2012010008161)

△通訊作者 Tel: 020-85228079； E-mail: thcf@jnu.edu.cn

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R730.23

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10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.09.009