Shp2在肺腺癌細胞A549中的抑癌作用及機制研究*

陸志偉， 程玉生， 趙春陽， 王寒黎

(皖南醫學院第一附屬醫院呼吸內科，安徽 蕪湖 241001)

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Shp2在肺腺癌細胞A549中的抑癌作用及機制研究*

陸志偉， 程玉生△， 趙春陽， 王寒黎

(皖南醫學院第一附屬醫院呼吸內科，安徽 蕪湖 241001)

目的： 探索Shp2在肺腺癌細胞A549中的抑癌作用及機制。方法: 應用CCK-8及EdU實驗檢測Shp2特異性抑制劑Phps-1抑制Shp2活性對A549細胞活力、增殖及對順鉑(DDP)耐藥情況的影響，Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率，Western blot法檢測caspase-3的17 kD片段(caspase-3-17p)、Bcl-2、Bax、p-STAT3/STAT3及p-ERK/ERK的蛋白水平。結果: Phps-1濃度為20 μmol/L、作用24 h對A549細胞活力的促進作用顯著，與對照組比較具有顯著性統計學差異(P<0.05)。Phps-1 20 μmol/L組的細胞增殖率為0.455±0.085，對照組為0.307±0.012。DDP 8 mg/L組及Phps-1 20 μmol/L聯合DDP 8 mg/L組的細胞凋亡率分別為13.01%±2.62%和3.67%±0.93%(P<0.05)。抑制Shp2活性能夠下調DDP誘導的促凋亡蛋白caspase-3-17p及Bax的蛋白水平，并上調p-STAT3及下調p-ERK蛋白水平。結論: Shp2在肺腺癌細胞A549中具有抑癌作用，抑制STAT3信號通路激活可能是Shp2發揮抑癌作用的重要分子機制。

Shp2； 肺癌； 細胞凋亡

蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2(Src homology-2 domain-containing phosphatase 2)是非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶(non-receptor protein tyrosine phosphatase，nRPTP)家族成員之一，由PTPN11基因編碼，是一種廣泛分布于機體細胞的磷酸酶，與蛋白激酶共同調控靶蛋白磷酸化水平，對細胞增殖、分化、凋亡及組織器官的發育發揮重要的調控作用[1]。目前研究發現Shp2與機體多種腫瘤的發生、發展密切相關，如血液系統惡性腫瘤[2]、乳腺癌[3]、肝癌[4-5]及胰腺癌[6]等。Shp2常被認為在腫瘤中發揮促癌作用，其蛋白水平高則提示腫瘤細胞早期發生遠處轉移及預后差，然而Shp2在肝癌細胞中卻扮演“雙重”角色，既可以發揮促癌作用，亦可發揮抑癌作用，其作用的發揮具有組織特異性[7]。Shp2在肺癌的發生、發展過程中被認為具有促癌作用[8-10]。然而，Shp2在肺癌細胞中是否具有抑癌作用目前尚未明了。本研究中我們將探討Shp2在肺腺癌A549細胞的抑癌作用及相關分子機制。

材 料 和 方 法

1 細胞

人肺腺癌細胞株A549購自ATCC，由皖南醫學院第一附屬醫院中心實驗室保存。

2 主要試劑

RPMI-1640培養基(Gibco)；胎牛血清(杭州四季青)；Shp2特異性抑制劑Phps-1、順鉑(cis-diamminedichloroplatinum，DDP)購自Sigma；CCK-8細胞活力檢測試劑盒(上海和元生物)；EdU檢測試劑盒(廣州銳博生物)； Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(BD)；RIPA蛋白裂解液(碧云天公司)；蛋白酶抑制劑(Roche)；抗caspase-3-17p、p-STAT3/STAT3及p-ERK/ERK抗體(CST)；抗Bcl-2及Bax抗體(Santa Cruz)；HRP標記的山羊抗小鼠、抗兔II抗(中杉金橋)；ECL發光底物(Pierce)。

3 主要方法

3.1 細胞培養 人肺腺癌細胞株A549培養條件為 37 °C、5% CO2、含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，每2～3 d傳代 1 次，收集對數生長期細胞用于后續實驗。

3.2 CCK-8實驗檢測細胞活力 收集A549細胞，計數后按照每孔2 000個細胞接種于96孔板，待細胞完全貼壁后，吸除舊培養基，加入含藥的完全培養基繼續培養，24 h后吸除含藥培養基，培養基與CCK-8試劑按10∶1的比例加入，繼續培養3 h后在酶標儀上用波長為450 nm讀取A值表示細胞活力大小。

3.3 EdU細胞增殖實驗 A549細胞計數后按照2×108/L接種于24孔板，待細胞貼壁后，藥物干預24 h后加入EdU，繼續培養2 h后吸除培養基，加入4%多聚甲醛固定細胞30 min，按照試劑盒操作說明加入染料，使用Hoechst 33342染核30 min，0.01 mol/L PBS液清洗10 min 2次，封片劑封片后于熒光顯微鏡下每組隨機拍攝8個視野，實驗重復3次，計數統計。細胞增殖率= EdU陽性細胞數/總細胞數。

3.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 A549經藥物干預24 h后，收集細胞于流式檢測試管中，調整細胞密度為1×105個左右，避光條件下依次加入Annexin V-FITC與PI試劑各5 μL孵育20 min后上機檢測。

3.5 Western blot檢測細胞蛋白水平 藥物干預后的A549細胞，吸出培養基，用PBS液洗滌3次，用胰酶或細胞刮收集細胞于10 mL離心管，1 500 r/min、 4 °C離心5 min，棄去上清，加入RIPA裂解液50～80 μL，冰上超聲振蕩1 min后冰上繼續靜置30 min，期間間斷振蕩2～3次。取等量細胞蛋白進行SDS-PAGE后轉至PVDF膜，電泳條件為5%濃縮膠恒壓70 V，10%分離膠恒壓120V，轉膜條件為350 mA恒流90 min。轉好的PVDF膜用5%的脫脂牛奶，室溫下脫色搖床振蕩封閉2 h。 I 抗稀釋濃度分別為caspase-3-17p(1∶1 000)、p-STAT3(Tyr705)(1∶1 000)/STAT3(1∶1 000)及p-ERK(1∶1 000)/ERK(1∶1 000)；Bcl-2(1∶500)及Bax(1∶500) 4 ℃孵育過夜；HRP標記的山羊抗小鼠、抗兔II抗稀釋比為1∶5 000。使用Bio-Rad公司掃描儀，Image Lab 4.1軟件分析條帶。

4 統計學處理

使用實驗數據用 SPSS 17.0 軟件進行統計分析。所有結果采用均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA), 用 SNK-q檢驗進行均數之間的兩兩比較, 以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 抑制Shp2活性可促進A549細胞增殖

不同濃度梯度的Shp2特異性抑制劑Phps-1分別作用于A549細胞24 h，結果顯示Phps-1在濃度為20 μmol/L時對A549細胞的活力促進最顯著，與對照組比較差異有統計學顯著性(P<0.05)。EdU檢測A549細胞的增殖結果示Phps-1在濃度為20 μmol/L時的作用效果最顯著，增殖率為0.455±0.085，對照組為0.307±0.012，差異有統計學顯著性(P<0.05),見圖1。

2 抑制Shp2活性促進A549細胞對順鉑發生耐藥，減少細胞凋亡

DDP(8 mg/L)組與Phps-1+DDP組兩者比較差異有統計顯著性(P<0.01)，結果提示抑制Shp2活性促進A549細胞對DDP產生耐藥現象。正常對照組、Phps-1組、DDP組及Phps-1+DDP組A549細胞24 h的凋亡率分別為1.78%±0.46%、1.53%±0.36%、13.01%±2.62%和3.67%±0.93%。DDP 組與Phps-1+DDP 組之間差異有統計學顯著性(P<0.01)，見圖2。結果提示抑制Shp2活性能夠減少順鉑誘導的A549細胞凋亡。

Figure 1. The effects of Phps-1 on viability and proliferation of A549 cells were determined by CCK-8 assay and EdU method after 24 h of treatment. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L.

圖1 抑制Shp2活性對A549細胞活力與增殖的影響

Figure 2. Inhibition of Shp2 activity promoted the drug resistance of A549 cells to DDP and decreased the apoptotic rate of A549 cells induced by DDP after 24 h of treatment. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsDDP.

圖2 Shp2活性抑制促進A549細胞對順鉑耐藥，減少順鉑誘導的細胞凋亡

3 各組凋亡相關蛋白水平的變化

Western blot實驗結果顯示，caspase-3的17 kD裂解片段的蛋白水平在DDP 組上調最明顯，而Phps-1+DDP組caspase-3 的17 kD裂解片段的蛋白水平較DDP組明顯下調，兩組之間差異具有統計學顯著性(P<0.05)。DDP組的促凋亡蛋白Bax水平明顯上調，而Phps-1+DDP處理組的Bax水平較前者明顯下調，兩組之間差異有統計學顯著性(P<0.05)。此外，抗凋亡蛋白Bcl-2在各組之間差異無統計學顯著性，然而Phps-1+DDP處理組的Bax/Bcl-2比值較DDP處理組要低，兩者間差異有統計學顯著性(P<0.05)，見圖3。

Figure 3. The protein levels of caspase-3-17p， Bax and Bcl-2 in the A549 cells after 24 h of treatment.Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

圖3 Shp2活性抑制對A549細胞caspase-3-17p、Bax和Bcl-2蛋白水平的影響

4 Shp2發揮抑癌作用的可能分子機制

Phps-1 對A549細胞p-ERK蛋白水平的影響呈時間依賴性，在120 min時p-ERK蛋白水平及p-ERK/ERK最低，提示Phps-1對A549細胞Shp2活性的抑制呈時間依賴性。抑制Shp2活性可促進STAT3蛋白的磷酸化水平，提示STAT3信號通路活化可能是Shp2發揮抑癌作用的分子機制之一,見圖4。

Figure 4.The protein levels of p-STAT3/STAT3 and p-ERK/ERK in the A549 cells treated with Phps-1 (20 μmol/L) at different in-tervals. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 min.

圖4 Phps-1抑制Shp2活性對A549細胞STAT3及 ERK信號通路的影響

討 論

細胞的正常生長、分化需受到蛋白酪氨酸激酶及磷酸酶的雙重調控，兩者正常情況下保持平衡，達到穩態。酪氨酸激酶獲得性功能突變或過度表達被認為是導致腫瘤發生的重要原因，而酪氨酸磷酸酶則具有相反的作用，常被認為發揮抑癌作用。但Shp2是酪氨酸磷酸酶中比較特殊的一種，它常作為癌癥發生信號通路中正調控介質[11]。如目前認為Shp2是生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)信號通路中間關鍵的正調控介質。獲得性突變的EGFR導致腫瘤細胞增殖失控是肺癌發生、發展重要因素之一，抑制Shp2的磷酸酶活性，導致Gab1蛋白磷酸化程度下降，使得EGFR通路信號傳導受阻從而抑制肺癌細胞生長[12]。Shp2自身獲得性功能突變也可以導致肺癌的發生[8]。對于非小細胞肺癌細胞株LXFA526L，抑制Shp2的活性導致腫瘤細胞增殖減少[13]。因此，Shp2被認為是肺癌發生、發展過程中重要的促癌磷酸酶。

Shp2不僅具有促癌作用，同時也具有抑癌作用。如在二乙基亞硝胺誘導肝癌發生過程中，抑制Shp2可明顯促進腫瘤的發生、發展[4]。在肺癌細胞中，Shp2是否具有抑癌作用目前未見研究報道。Phps-1是近年來合成的Shp2特異性抑制劑，對Shp2活化信號通路具有明顯抑制作用[14]。我們在本研究發現利用Shp2特異性抑制劑Phps-1抑制Shp2活性，促進肺腺癌細胞A549細胞活性與增殖，減少順鉑誘導的細胞凋亡，下調由順鉑誘導的凋亡蛋白Bax及caspase-3-17p的蛋白水平，提示Shp2在A549細胞中具有抑癌作用。

Shp2在腫瘤中作用的“雙面性”與細胞異質性密切相關，在不同細胞類型中發揮的作用截然不同[7]。目前認為Shp2作用的差異取決于Shp2參與的信號通路調控不同。抑制Shp2可以激活IL-6/STAT3信號通路促進腫瘤發生、發展，然而Shp2活性抑制也會抑制Ras/Raf/ERK與PI-3K/AKT/mTOR致癌信號通路活化[5]。此外，ERK信號通路抑制可作為觀察Phps-1對Shp2活性抑制的重要指標[14]。本研究中，我們發現在A549細胞中，Phps-1抑制Shp2活性可激活STAT3信號通路，而STAT3信號通路激活對腫瘤細胞發生、進展發揮重要的正調控作用[5]，因此我們推測在A549細胞中，Shp2發揮抑癌作用可能與STAT3信號通路有關。

綜上所述，Shp2在肺腺癌細胞A549中具有抑癌作用， Shp2抑制STAT3信號通路激活可能是其重要的分子機制。Shp2在腫瘤細胞中的調控機制異常復雜，與腫瘤細胞的異質性密切相關，在未來的研究工作中，我們將探索Shp2在不同類型突變肺癌細胞中的調控機制，為探索肺癌治療新的靶標奠定新的理論基礎。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Anticancer function of Shp2 in lung adenocarcinoma A549 cells and rela-ted molecular mechanisms

LU Zhi-wei, CHENG Yu-sheng, ZHAO Chun-yang, WANG Han-li

(DepartmentofRespiratoryMedicine,TheFirstAffiliatedHospitalofWannanMedicalCollege,Wuhu241001,China.E-mail:chengys1222@126.com)

AIM: To explore the anticancer function of Shp2 in lung adenocarcinoma A549 cells and the related molecular mechanisms. METHODS: The viability and proliferation of A549 cells treated with Shp2 specific inhibitor Phps-1 or cisplatin (DDP) were measured by CCK-8 assay and EdU assay. Annexin V-FITC/PI double staining was applied to detect apoptotic rate of A549 cells with different interventions. The protein levels of caspase-3-17p, Bcl-2, Bax, p-STAT3/STAT3 and p-ERK/ERK were determined by Western blot. RESULTS: Compared with control group, Phps-1 at the concentration of 20 μmol/L significantly increased the viability of A549 cells after 24 h of treatment (P<0.05). Meanwhile, the proliferation rate of A549 cells in Phps-1 20 μmol/L group was significant increased compared with control group (P<0.05). The apoptotic rate of A549 cells in DDP treatment group decreased from 13.01%±2.62% to 3.67%±0.93% after adding Phps-1 (P<0.05). Phps-1 down-regulated the protein levels of caspase-3-17p, Bax and p-ERK, but up-regulated p-STAT3. CONCLUSION: Shp2 is a tumor suppressor in A549 cells, which may be associated with the activation of STAT3 signal pathway.

Shp2; Lung cancer; Apoptosis

雜志網址： http://www.cjpp.net

1000- 4718(2016)09- 1589- 05

2016- 03- 28

2016- 05- 24

皖南醫學院引進人才基金資助項目(No. YR201107)；皖南醫學院中青年基金資助項目(No. WK2014F43)

△通訊作者 Tel: 0553-5739006； E-mail: chengys1222@126.com

R734.2； R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.09.010