WNT5B過表達對人乳腺癌MCF-7細胞活力及凋亡的影響

周凡涵， 厲紅元

(重慶醫科大學附屬第一醫院內分泌乳腺外科，重慶 400016)

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WNT5B過表達對人乳腺癌MCF-7細胞活力及凋亡的影響

周凡涵， 厲紅元△

(重慶醫科大學附屬第一醫院內分泌乳腺外科，重慶 400016)

目的： 檢測WNT5B在人正常乳腺上皮細胞和乳腺癌細胞株中的表達，及過表達WNT5B后對人乳腺癌MCF-7細胞活力及凋亡的影響，探討WNT5B在乳腺癌發生發展中的作用。方法：采用RT-PCR法檢測正常乳腺上皮細胞和乳腺癌細胞中WNT5B的mRNA表達水平，將WNT5B的表達載體pcDNA3.1/WNT5B和空白對照載體pcDNA3.1分別瞬時轉染人乳腺癌MCF-7細胞，通過real-time PCR和Western blotting法分別在mRNA和蛋白水平驗證WNT5B的表達效率；并通過CCK-8的方法檢測WNT5B過表達對人乳腺癌MCF-7細胞活力的影響，通過流式細胞術分別檢測過表達WNT5B對MCF-7細胞周期分布及凋亡比例的影響。結果：與正常乳腺上皮細胞相比，WNT5B在乳腺癌細胞中低表達；在乳腺癌細胞MCF-7中轉染WNT5B表達質粒后，WNT5B表達上調，差異有統計學顯著性(P<0.05)；與對照組相比，過表達WNT5B后，MCF7細胞的活力明顯降低，處于S期細胞的量明顯增加，G1和G2/M期細胞明顯減少，且細胞凋亡比例明顯增加，差異均有統計學顯著性(P<0.05)。結論：WNT5B在乳腺癌細胞中低表達，過表達WNT5B可使人乳腺癌細胞MCF-7阻滯在S期，抑制細胞增殖，促進細胞凋亡。

WNT5B； MCF-7細胞； 細胞凋亡

乳腺癌是嚴重威脅婦女身心健康的惡性腫瘤之一，其發病率在國內有逐年上升趨勢，雖然近年來對乳腺癌發病機理的研究已越來越廣泛，并且發現了多種因子及信號通路參與了乳腺癌的發生發展，但其在分子水平的發病機制尚需繼續探討[1-2]。

WNT信號通路功能廣泛、機制復雜，WNT5B作為WNT通路眾多配體之一，以旁分泌或自分泌的方式參與非經典WNT通路[3]，并參與調控了多種腫瘤細胞增殖、凋亡及侵襲轉移等過程[4-5]。有報道證實WNT5B的表達與結腸癌細胞的分化程度呈正相關，過表達WNT5B抑制WNT信號通路關鍵分子β-catenin的表達，促進細胞凋亡[6-7]。然而WNT5B在乳腺癌細胞中的研究較少。本研究探討WNT5B在人正常乳腺上皮細胞和乳腺癌細胞中的表達情況，并通過構建WNT5B真核過表達載體，上調WNT5B在人乳腺癌細胞MCF-7中的表達，研究過表達WNT5B后對人乳腺癌細胞MCF-7增殖與凋亡的影響，探討WNT5B在乳腺癌發生發展中的作用，進而為乳腺癌的基因靶向治療提供新的實驗依據。

材 料 和 方 法

1 主要試劑與質粒

1.1 主要試劑 Lipofectamine 2000轉染試劑購自Invitrogen；總RNA提取試劑盒購自Omega；RNA逆轉錄試劑盒購自TaKaRa；蛋白提取試劑盒購自上海碧云天生物；兔抗人WNT5B的I 抗購自Santa Cruz；β-actin的I抗購自北京鼎國生物技術有限公司，ECL發光試劑盒購自Thermo。

1.2 WNT5B真核過表達載體的構建 根據WNT5B基因在GenBank中的cDNA序列(NM_030775)設計特異性引物，上游引物為5’-CCGctcgagATGCCCAGCCTGCTGCTG-3’(含XhoI酶切位點)，下游引物為5’-CGCggatccTTTACAGATGTACTGGTCCACGA-3’(含BamH I酶切位點)，引物由上海生工合成。提取乳腺癌細胞MCF-7總RNA，并以逆轉錄獲得的cDNA為模板，進行PCR擴增，膠回收，按照pcDNA3.1操作手冊構建重組載體，測序和酶切鑒定pcDNA3.1/WNT5B過表達載體。由實驗室構建并保存。

2 方法

2.1 MCF-7細胞的培養與轉染 MCF-7細胞由重慶醫科大學附屬第一醫院分子腫瘤及表觀遺傳學實驗室儲存，培養于含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養基中，37 ℃、5% CO2培養箱中培養。實驗分為空載體組(pcDNA3.1)和實驗組(pcDNA3.1/WNT5B)。轉染前24 h消化收集細胞并計數，按每孔1×105個接種入6孔培養板中，當細胞融合達到70%～80%時,按脂質體Lipofectamine 2000說明書分別轉染pcDNA3.1/WNT5B和空載體pcDNA3.1，培養48 h提取總RNA，72 h提取總蛋白。

2.2 Real-time PCR法檢測WNT5B的mRNA表達水平 細胞轉染48 h后分別提取各組細胞的總RNA，反轉錄獲得cDNA。用于Real-time PCR檢測WNT5B的上游引物為5’-AAATGCCACGGCGTC-TCG-3’，下游引物為5’-GGG TGAAGCGGCTGTTGA-3’；β-actin的上游引物為5’-TCCTGTGGCATCCACGAAACT-3’，下游引物為5’-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3’。Real-time PCR的反應條件為95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 15 s， 39個循環；65 ℃ 15 s。采用 2-ΔΔCt法計算并分析mRNA的相對表達量。

2.3 Western blotting法檢測WNT5B蛋白的表達水平 細胞轉染48 h后分別提取各組細胞的總蛋白，BCA法測定各組蛋白濃度，加適量上樣緩沖液100 ℃煮沸變性5 min，按每孔上樣量為40 mg進行SDS-PAGE后，電轉至PVDF轉印膜上，用含5%脫脂奶粉PBST液封閉2 h；鼠抗人WNT5B單克隆抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜；PBST清洗 10 min 3次；加羊抗鼠II抗(1∶1 000)室溫孵育40 min；用ECL化學發光法檢測并計算WNT5B蛋白的相對表達量。

2.4 CCK-8檢測過表達WNT5B對MCF細胞活力的影響 轉染24 h的各組細胞消化收集，按每孔2 000個接種于96孔中，待細胞貼壁后記為1 d，分別在1 d、2 d、3 d、4 d、5 d加入10 mL CCK-8液，37 ℃孵育2 h后，在450 nm處測定吸光度(A)值。

2.5 細胞凋亡的檢測 轉染48 h后用不含EDTA的胰酶消化各組細胞，1 000 r/min離心收集，按照Annexin V-PE細胞凋亡檢測試劑盒操作步驟上流式細胞儀檢測細胞凋亡。

2.6 細胞周期分布的檢測 轉染72 h后消化收集各組細胞，預冷70%無水乙醇-20 ℃過夜固定細胞，加入500 μL含碘化丙啶的PBS，4 ℃靜置30 min，洗滌后流式細胞儀上檢測細胞周期分布。

3 統計學處理

統計分析采用SPSS 19.0進行，所有數據均以均值±標準差(mean±SD)表示，兩組間參數比較采用獨立樣本t檢驗，多組間參數兩兩比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 WNT5B在乳腺正常上皮和不同乳腺癌細胞中的表達

Real-time PCR的結果顯示，與人正常乳腺上皮細胞MCF10A相比，WNT5B在人乳腺癌細胞株T47D、MCF-7和MDA-MB-231中低表達，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The mRNA expression of WNT5B in different breast cancer cell lines detected by real-time PCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vsMCF-10A.

圖1 WNT5B mRNA在不同乳腺癌細胞中的表達情況

2 載體轉染MCF-7細胞效率的檢測

Real-time PCR和Western blot實驗的結果顯示，與空載體組相比，實驗組MCF-7細胞中WNT5B在mRNA和蛋白水平上的表達明顯增加，差異均有統計學顯著性(P<0.05),見圖2、3。這說明轉染成功，可進行后續實驗。

Figure 2.The mRNA expression of WNT5B in the MCF-7 cells. detected by real-time PCR. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsvector group.

圖2 ReaL-time PCR檢測MCF-7細胞中WNT5B mRNA的表達

3 WNT5B過表達對乳腺癌 MCF-7細胞活力的影響

通過CCK-8的方法檢測WNT5B過表達對MCF7細胞活力的影響，結果如圖4所示。與對照組相比，過表達WNT5B的人乳腺癌細胞MCF7的細胞活力明顯下降，差異具有統計學顯著性(P<0.05)。

Figure 3.The protein expression of WNT5B in MCF-7 cells detected by Western blotting. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsvector group.

圖3 MCF-7細胞中WNT5B在蛋白水平的表達

Figure 4.The effect of WNT5B up-expression on the viability of MCF-7 cells measured by CCK-8 assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsvector group.

圖4 經CCK-8檢測，過表達WNT5B的MCF-7細胞活力低于對照組細胞

4 過表達WNT5B對乳腺癌MCF7細胞周期分布的影響

流式細胞術檢測細胞周期的結果顯示，與空載體組相比，實驗組中S期細胞數量明顯增加，G1和G2/M期細胞數量減少，說明過表達WNT5B可將乳腺癌細胞阻滯在S期，差異有統計學顯著性(P<0.05),見圖5。

5 過表達WNT5B對乳腺癌MCF7細胞凋亡的影響

流式細胞術檢測凋亡的結果顯示，過表達WNT5B后，與空載體組相比實驗組中細胞凋亡的比例明顯增加(P<0.05)，見圖6。這說明過表達WNT5B能促進乳腺癌細胞的凋亡。

Figure 5.The cell cycle was examined by flow cytometry in the MCF-7 cells with WNT5B over-expression by transfection with plasmid pcDNA3.1/WNT5B for 72 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsvector group.

圖5 流式細胞術檢測過表達WNT5B對乳腺癌MCF-7細胞周期分布的影響

Figure 6.The cell apoptosis was analyzed by flow cytometry in the MCF-7 cells with WNT5B over-expression by transfection with plasmid pcDNA3.1/WNT5B for 28 h. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsvector group.

圖6 流式細胞術檢測過表達WNT5B對乳腺癌MCF-7細胞凋亡比例的影響

討 論

乳腺癌是一種全身性疾病，其發生發展的機制復雜，近幾年乳腺癌的發病率在我國逐年攀升[7]，而其治療的方法仍沒有較大的改善，因此探索分子水平上或其相關領域更有效、更安全的治療方法成為乳腺癌研究領域的當務之急。當前針對WNT信號通路與乳腺癌的研究受到重視[8-9]。WNT5B作為WNT通路眾多配體之一，通過WNT信號通路參與了腫瘤的發生發展。文獻報道WNT5B在乳腺癌、結腸癌等多種腫瘤中低表達[10-12]；Bradley等[5]研究發現在骨肉瘤細胞中WNT5B通過抑制JNK信號的中斷影響軟骨細胞的增殖與遷移；Kato等[13]在人肺癌A549細胞和人胰腺癌Panc-1細胞中的研究發現，WNT5B參與了上皮細胞向間質細胞的轉化，進而影響腫瘤細胞的侵襲能力，促進腫瘤的惡性增殖，提示WNT5B對腫瘤細胞的增殖、遷移、分化等過程起著重要作用。

我們的前期研究發現，與癌旁組織相比WNT5B在乳腺癌組織中明顯低表達，且與腫瘤大小顯著相關[11]。然而WNT5B在乳腺癌細胞中的表達及具體的分子作用機制是未知的；基于此，本研究首先探討了WNT5B在正常乳腺上皮細胞和不同乳腺癌細胞中的表達，結果顯示WNT5B在乳腺癌細胞中明顯低表達，與前期研究結果一致。為了研究WNT5B在乳腺癌發生發展中的作用，成功構建了WNT5B的真核過表達載體，瞬時轉染入人乳腺癌細胞MCF-7。研究結果發現過表達WNT5B后，MCF7細胞活力受到明顯抑制，而細胞周期被阻滯在S期，細胞凋亡比例也明顯增加，表明在乳腺癌細胞中，低表達的WNT5B可能作為腫瘤抑制因子，參與調節乳腺癌的發生與發展，然而WNT5B是如何靶定相關信號通路或轉錄因子發揮作用，仍不明確，這也是我們下一步工作的重點。

綜上所述，WNT5B可能作為抑癌因子調控人乳腺癌細胞MCF-7的增殖與凋亡，但其具體機制及所涉及的信號轉導途徑尚不明確，是否與非經典的WNT信號通路相關，有待于進一步研究，同時本實驗可為乳腺癌的基因治療提供新的思路。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effects of WNT5B over-expression on viability and apoptosis of human breast cancer cell line MCF-7

ZHOU Fan-han, LI Hong-yuan

(DepartmentofEndocrineandBreastSurgery,TheFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China.E-mail:L_hongyan@yeah.net)

AIM: To detect the expression of WNT5B in normal breast epithelial cells and different breast cancer cell lines, and to investigate the effects of WNT5B over-expression on the viability and apoptosis of human breast cell line MCF-7.METHODS: The mRNA expression of WNT5B was detected by RT-PCR in different breast cancer cells. MCF-7 cells were transfected with plasmid pcDNA3.1/WNT5B or pcDNA3.1, and the expression of WNT5B at mRNA and protein levels was examined in the 2 groups by real-time PCR and Western blotting, respectively. Subsequently, the changes of cell viability and cell apoptosis were analyzed by CCK-8 assay and flow cytometry, respectively. RESULTS: The expression of WNT5B in the breast cancer cell lines was lower than that in MCF10A cells. The WNT5B expression in the MCF-7 cells in experimental group was significantly higher than that in vector group (P<0.05). However, the cell viability in experimental group decreased significantly as compared with vector group (P<0.05). The number of the cells in S-phase obviously increased, while the percentage of the cells in G1-phase and G2/M-phase decreased compared with vector group. The number of apoptotic cells in WNT5B group was significantly higher than that in vector group. CONCLUSION: The expression of WNT5B is decreased in breast cancer cells. WNT5B over-expression significantly inhibits the cell growth and promotes the cell apoptosis in breast cancer MCF7 cells.

WNT5B; MCF-7 cells; Apoptosis

雜志網址： http://www.cjpp.net

1000- 4718(2016)09- 1594- 05

2016- 04- 01

2016- 07- 13

△ 通訊作者 Tel: 13883310407； E-mail: L_hongyan@yeah.net

R730.23

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10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.09.011