葛根素對RAW264.7源性泡沫細胞膽固醇攝取及外排功能的影響*

溫柱華， 付大偉， 王 靜， 徐如芹， 吳功雄， 劉世明

(廣州醫科大學附屬第二醫院，廣州市心血管疾病研究所，廣東 廣州 510260)

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葛根素對RAW264.7源性泡沫細胞膽固醇攝取及外排功能的影響*

溫柱華， 付大偉， 王 靜， 徐如芹， 吳功雄△， 劉世明△

(廣州醫科大學附屬第二醫院，廣州市心血管疾病研究所，廣東 廣州 510260)

目的： 探討葛根素(puerarin, Pur)對RAW264.7源性泡沫細胞膽固醇攝取及外排功能的影響。方法: 以氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)誘導RAW264.7源性泡沫細胞。細胞經處理后，利用熒光探針DiI-ox-LDL檢測泡沫細胞攝取ox-LDL的能力，NBD標記膽固醇外排實驗檢測泡沫細胞的膽固醇外排功能，Western blot 法檢測LC3II、P62、CD36、ATP結合盒轉運蛋白 A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)、溶酶體酸性脂肪酶(lysosomal acid lipase，LAL)以及p-AMPK的蛋白水平。結果: RAW264.7源性泡沫細胞經Pur處理后膽固醇攝取減少、胞內膽固醇外排增加并且自噬相關蛋白LC3II表達增加，P62表達減少，脂質吸收相關蛋白CD36表達減少，膽固醇外排相關蛋白ABCA1和LAL表達增加，其變化與自噬激動劑雷帕霉素處理后改變類似。Pur與自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤共處理后，膽固醇攝取增加、膽固醇外排功能減弱，并且ABCA1、LAL和p-AMPK的蛋白水平減少，但CD36表達未有明顯改變。結論: Pur可使得泡沫細胞LAL和ABCA1介導的膽固醇外排能力有所增強，其機制可能是通過AMPK通路增強自噬對膽固醇外排的調控；又可通過對CD36負向調節而使得泡沫細胞對脂質的攝取減少。

葛根素； 泡沫細胞； 膽固醇代謝； 自噬

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是眾多心血管疾病的病理基礎，AS病變過程中泡沫細胞的形成與發展始終貫穿于其中[1]。當體內的氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)被巨噬細胞吞噬后，將導致巨噬細胞內的脂質蓄積而形成巨噬細胞源性的泡沫細胞，而泡沫細胞對胞內脂質的代謝紊亂又將導致胞體的漲大、破裂并最終導致動脈粥樣硬化斑塊的破裂、出血而引發一系列心血管急癥的發生[2-3]。此外，大量證據表明，在動脈粥樣硬化斑塊中血管內皮細胞、平滑肌細胞以及巨噬細胞等血管組織主要的細胞類型均有著自噬現象的改變[4-5]。

葛根素(puerarin，Pur)具有擴張冠狀動脈、保護缺血心肌和抗心肌缺血再損傷、減少急性心肌梗死面積等多種作用[6-7]，臨床上主要用于冠心病心絞痛、心肌梗死等心血管疾病的治療。另有研究表明，Pur對AS有著治療作用[8]，但其機制仍未十分明確。本研究觀察Pur對泡沫細胞自噬現象、胞內膽固醇蓄積以及泡沫細胞膽固醇外排能力的影響，進而探討其抗AS作用的機制。

材 料 和 方 法

1 材料

無酚紅DMEM培養基和熒光NBD膽固醇均購自Invitrogen；葛根素、兔抗人LC3B多克隆抗體、人高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)和人載脂蛋白A-I(apolipoprotein A-I，ApoA-I)均購自Sigma；兔抗人P62多克隆抗體購自CST；鼠抗人ATP結合盒轉運蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1， ABCA1)和兔抗人CD36多克隆抗體均購自Abcam；兔抗人溶酶體酸性脂肪酶(lysosomal acid lipase，LAL)多克隆抗體購自Proteintech；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔 IgG 購自武漢博士德生物工程有限公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠 IgG 購自Jackson；ECL試劑購自 Santa Cruz；DiI-ox-LDL和ox-LDL購自廣州奕源生物公司；其它試劑為國產分析純品。

2 主要方法

2.1 細胞培養與細胞模型的建立 小鼠巨噬細胞系RAW264.7購自上海細胞庫，培養于DMEM培養基[含1%青鏈霉素混合液、1.5 g/L NaHCO3(Invitrogen)和10%胎牛血清(Bioind)]；培養條件為37 ℃、5 % CO2。以100 mg/L ox-LDL處理細胞48 h建立泡沫細胞模型。

2.2 熒光探針DiI-ox-LDL檢測巨噬細胞攝取ox-LDL的能力 細胞處理結束后，與 10 mg/L的 Dil-ox-LDL，4 ℃下孵育細胞4 h。 DPBS 洗 3 次，用熒光顯微鏡(×400)隨機拍照，激發波波長520 nm和發射波波長580 nm，紅色熒光表示攝取DiI-ox-LDL的細胞。

2.3 膽固醇外排功能檢測[9]以 5 μmol/L NBD-膽固醇孵育液干預ox-LDL負載的細胞。NBD-膽固醇孵育細胞6 h后，以PBS緩沖液洗滌細胞3次，分別以含有ApoA-I 或HDL的誘導外流液干預細胞，處理18～24 h后分別收集含熒光的誘導外流液(即細胞上清)和細胞裂解液(收集上清后將細胞裂解而得)，分別測定熒光強度，熒光NBD膽固醇濃度與其熒光信號強度成正比。

2.4 Western blot 法檢測LC3、P62、CD36、LAL、ABCA1和p-AMPK的蛋白水平 細胞處理結束后，收集蛋白樣品，以Lowry法進行定量后，在8%、12% SDS-PAGE中分離，然后電轉至PVDF膜上，5%脫脂牛奶或BSA室溫封閉1 h，加入1∶2 000稀釋的兔抗人LC3抗體、1∶1 000稀釋的兔抗人P62抗體、1∶1 000稀釋的兔抗人CD36抗體、1∶500稀釋的鼠抗人ABCA1抗體、1∶500稀釋的兔抗人LAL抗體以及1∶1 000稀釋的兔抗人p-AMPK抗體，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜7 min 2次，1∶4 000稀釋的羊抗兔辣根過氧化物酶標記的羊抗兔 IgG，室溫孵育1 h，TBST洗膜7 min 3次。目的蛋白特異條帶化學發光法顯影，經內參照 GAPDH標準化，并通過 Image-Pro Plus 軟件半定量分析。

3 統計學處理

數據由 SPSS 13.0統計軟件進行統計, 計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，并采用Bonferroni校正的t檢驗進行兩兩比較，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 Pur對RAW264.7源性泡沫細胞膽固醇攝取能力的影響

經不同濃度的Pur處理后，泡沫細胞的膽固醇攝取能力均有所下降。采用熒光標記的ox-LDL方法觀察葛根素對RAW264.7巨噬細胞攝取 ox-LDL能力的影響，結果顯示80、160、320和640 μmol/L葛根素預孵育后，巨噬細胞對ox-LDL的攝取能力均降低(P<0.05)。鑒于CD36對膽固醇攝取有著重要的作用，因此，我們利用Western blot 法檢測經Pur處理后細胞CD36蛋白的表達情況。結果表明，與ox-LDL模型組相比，各濃度Pur處理后CD36蛋白的表達水平降低，見圖1。

Figure 1.The effects of puerarin (Pur) on cholesterol influx in the RAW264.7 macrophage-derived foam cells. P1: 80 μmol/L Pur + ox-LDL; P2: 160 μmol/L Pur + ox-LDL; P3: 320 μmol/L Pur + ox-LDL; P4: 640 μmol/L Pur + ox-LDL. A: the cholesterol uptake was evaluated by a DiI-ox-LDL binding assay (scale bar=10 μm); B: the protein level of CD36 was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsox-LDL group.

圖1 Pur對RAW264.7源性泡沫細胞膽固醇攝取能力的影響

2 Pur對RAW264.7源性泡沫細胞膽固醇外排能力的影響

經不同濃度Pur處理后，泡沫細胞的膽固醇外排能力有所增加。采用熒光標記NBD膽固醇外流方法觀察Pur對RAW264.7巨噬細胞源性泡沫細胞膽固醇外排功能的影響，結果顯示泡沫細胞在由ApoA-I介導的膽固醇外流功能檢測中，各濃度Pur處理后均對外流率產生影響(P<0.05)。由HDL介導的膽固醇外流功能檢測中可見，細胞經160、320以及640 μmol/L濃度的Pur處理后，其膽固醇外流率均有所增加(P<0.05)。Western blot 實驗的檢測結果表明，Pur處理泡沫細胞可上調ABCA1和LAL蛋白的表達水平，見圖2。

3 Pur可通過AMPK通路激活細胞自噬

如圖3所示，不同濃度的Pur處理泡沫細胞后均可使得自噬相關蛋白LC3II水平上調及P62水平下調。經Pur處理后，泡沫細胞的AMPK磷酸化水平升高，見圖3。

4 促進或抑制自噬后泡沫細胞的膽固醇攝取、外排外功能以及相關蛋白的改變

如圖4所示，經雷帕霉素或與3-MA共孵育后， Pur組和RAPA組，與ox-LDL模型組相比均能明顯減弱對DiI-ox-LDL的攝取，Pur與3-MA共孵育后膽固醇攝取較Pur組有所增加。Pur組和RAPA組與ox-LDL模型組相比細胞內脂質向HDL和ApoA-I的膽固醇外流率均明顯增加，并且給予3-MA后，Pur處理的細胞膽固醇外流均較Pur組有所減少(P<0.05)。Pur組的LC3II表達以及AMPK磷酸化水平均增加明顯，而Pur+3-MA組的LC3II表達以及AMPK磷酸化水平均下調。膽固醇攝取相關蛋白CD36的表達在Pur組和RAPA組均下調，但Pur與3-MA共孵育組未見CD36表達明顯上調；而Pur組與RAPA組LAL的蛋白表達均有所上調，但RAPA組ABCA1的蛋白表達上調不甚明顯。

Figure 2.The effects of Pur on cholesterol efflux in the RAW264.7 macrophage-derived foam cells (A) and the expression of ABCA1 and LAL detected by Western blot (B). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsox-LDL group.

圖2 Pur對RAW264.7源性泡沫細胞膽固醇外排能力的影響

討 論

泡沫細胞的形成與發展過程中，膽固醇的攝取與排出占據著重要地位[10]。因此，本研究中利用DiI-ox-LDL對泡沫細胞的膽固醇攝取功能進行檢測并利用熒光NBD膽固醇外排實驗對泡沫細胞膽固醇外排功能進行檢測。結果表明，Pur處理后泡沫細胞膽固醇攝取能力減弱并且外排能力增強。既往研究表明，巨噬細胞接受ox-LDL刺激后，CD36蛋白表達增加，并且呈現出濃度依賴性，提示CD36在膽固醇吸收的過程中起著重要作用[11]。動物與細胞實驗中，沉默CD36基因后動脈粥樣硬化病變程度會有所減輕，進一步證實CD36在巨噬細胞膽固醇攝取過程中的促進作用[12]。本研究中，RAW264.7予以Pur處理后，細胞對DiI-ox-LDL攝取減少，同時伴有CD36蛋白表達減少，說明Pur可通過調控CD36的蛋白表達而影響巨噬細胞對膽固醇的吸收。

在膽固醇外排的過程中，ABCA1是較明確的介導膽固醇外排的蛋白之一，是細胞內多余膽固醇外排機制中的關鍵分子[13]。臨床研究和動物實驗結果表明，ABCA1基因突變或缺失會導致血漿HDL水平下降，巨噬細胞內大量膽固醇堆積和冠心病發病率增加。在易患AS的LDLR基因敲除小鼠中特異性敲除巨噬細胞內的ABCA1基因后，血清HDL水平無明顯影響，卻同樣可加快AS的病程。由此可見，巨噬細胞上正常功能的 ABCA1 對于抑制 AS 病變的發展具有十分重要的意義。本研究中，Pur干預后能夠有效增加胞內膽固醇外排并促進ABCA1的表達，說明膽固醇外排能力的增強是通過促進ABCA1的表達。

Figure 3.The protein levels of LC3, P62 (A) and p-AMPK (B) determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsox-LDL group.

圖3 Western blot 檢測LC3、P62以及p-AMPK表達

研究表明，在巨噬細胞源性泡沫細胞的膽固醇外排過程中，LAL對膽固醇進行降解并且介導膽固醇向ABCA1的外排[14]。該酶活性在ox-LDL的作用下的減弱，又可導致膽固醇的蓄積增多而促進AS的病變發展。我們的研究結果顯示，Pur處理后的泡沫細胞LAL蛋白表達增加，表明Pur通過調控LAL的表達而增強膽固醇外排的能力。

LC3II 的相對量反映了自噬體的含量，是目前最廣泛用來檢測自噬體的分子標記；自噬底物蛋白P62也被稱為SQSTM1，可通過LPS/LIRA途徑與 LC3結合并形成復合物，由LC3介導形成自噬小體，最后自噬小體與溶酶體融合完成蛋白的降解。本研究中，Pur處理后的泡沫細胞LC3II的相對量有所增加而P62的表達則減少，表明Pur有效促進泡沫細胞的自噬發生。既往研究也提示，ox-LDL能夠通過AMPK通路抑制巨噬細胞的自噬水平，并且Pur可通過AMPK通路上調H4IIE細胞自噬水平[15]。本研究中，Pur處理可上調泡沫細胞內AMPK蛋白磷酸化水平，表明在Pur 促進自噬的過程中，AMPK相關通路占有重要位置。

Figure 4. The effects of the agonist and inhibitor of autophagy on the functions of cholesterol influx and efflux and the changes of the related protein levels. A: the capacity of combining to ox-LDL was evaluated by a DiI-ox-LDL binding assay (scale bar=10 μm); B: cholesterol efflux to ApoA-I or HDL was tested in RAW264.7 macrophage-derived foam cells; C: the protein levels of LC3 II, p-AMPK, CD36, ABCA1 and LAL were determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsox-LDL group;#P<0.05vsPur group.

圖4 自噬促進劑雷帕霉素以及自噬抑制劑3-MA處理后泡沫細胞膽固醇攝取、膽固醇外流率的變化以及相關蛋白的改變

Ouimet等[16]研究表明，在泡沫細胞膽固醇排出過程中，自噬可介導泡沫細胞內膽固醇外排，并且脂滴可通過自噬途徑輸送至溶酶體，并由LAL對脂滴進行降解后再經過ABCA1排出胞外，進而實現膽固醇的逆轉運。故我們推測Pur對CD36的下調以及LAL、ABCA1的上調是通過自噬相關通路AMPK信號通路而實現的。為此，我們使用了自噬激動劑RAPA作為陽性對照，并將廣譜自噬抑制劑3-MA與Pur共孵育以進一步證實猜想。本研究中，Pur與自噬促進劑RAPA有著類似的促進自噬以及AMPK磷酸化水平升高的作用，并且兩者都能夠促進膽固醇外流以及LAL的表達；予以3-MA與Pur共同作用后，p-AMPK、ABCA1和LAL的蛋白水平均減少，表明Pur對ABCA1以及LAL介導的膽固醇外排的促進作用可通過AMPK相關通路而產生。本研究中，RAPA處理后ABCA1表達未有明顯增加而膽固醇外排效率有所增加，與既往文獻報道一致[17]。我們認為其可能與RAPA對ABCA1的調控并非僅僅通過調節其表達，可能主要調控ABCA1的定位，但目前未有相關研究。此外，CD36的表達并沒有因自噬的抑制而增加，可能是由于3-MA抑制自噬后使得Pur對于其它通路的作用增加而致CD36表達減少，有研究表明CD36的變化與PPARγ相關通路的改變有關，但Pur對CD36的調節機制仍有待進一步探討。

綜上所述，我們推測Pur可使得泡沫細胞LAL和ABCA1介導的膽固醇外排能力有所增強，其機制可能是通過AMPK通路增強自噬對膽固醇外排的調控；又可通過對CD36負向調節而使得巨噬細胞對脂質的攝取減少，但具體機制有待探討。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effect of puerarin on cholesterol influx and efflux in RAW264.7-treated foam cells

WEN Zhu-hua, FU Da-wei, WANG Jing, XU Ru-qing, WU Gong-xiong, LIU Shi-ming

(TheSecondAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,GuangzhouInstituteofCardiovascularDisease,Guangzhou510260,China.E-mail:gzliushiming@126.com)

AIM: To study the protective effect of puerarin on the atherosclerosis of RAW264.7-derived foam cells. METHODS: The model of foam cells was established by incubating the RAW264.7 cells with ox-LDL. The cholesterol uptake was evaluated by a DiI-ox-LDL binding assay. The ability of cholesterol efflux of the RAW264.7-derived foam cells was detected by cholesterol efflux assay. The protein levels of LC3II, P62, CD36, ABCA1, LAL and p-AMPK were determined by Western blot. RESULTS: Puerarin treatment reduced the cholesterol uptake capacity and enhanced the cholesterol efflux rate. The protein levels of LC3II, ABCA1 and LAL in puerarin group were higher than that in ox-LDL group, while the protein levels of P62 and CD36 were obviously decreased, and those in rapamycin treatment group had the same change as puerarin group. The protein levels of LC3II, ABCA1 and LAL were obviously decreased and the protein level of p-AMPK was increased after co-treated with 3-MA. CONCLUSION: Puerarin promotes LAL and ABCA1-mediated cholesterol efflux in ox-LDL-treated RAW264.7 macrophages, which might enhance autophagy through AMPK-dependent pathway for cholesterol efflux regulation, and reduce the uptake of lipids by CD36 negative regulation.

Puerarin; Foam cells; Cholesterol metabolism; Autophagy

雜志網址： http://www.cjpp.net

1000- 4718(2016)09- 1614- 07

2016- 03- 18

2016- 06- 01

廣東省自然科學基金資助項目(No. S2013020012479)；廣州市屬高校科研計劃項目(No. 2013C213)

△ 通訊作者 劉世明 Tel: 020-34153522; E-mail: gzliushiming@126.com；吳功雄 Tel: 020-34153522; E-mail: wugongxiong@hotmail.com

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10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.09.014