利拉魯肽通過調節microRNA-375對胰島細胞凋亡的影響

楊慶宇， 郜 娜

(1鄭州人民醫院藥學部， 2鄭州大學附屬腫瘤醫院， 河南省腫瘤醫院藥學部，河南 鄭州 450053)

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利拉魯肽通過調節microRNA-375對胰島細胞凋亡的影響

楊慶宇1△， 郜 娜2

(1鄭州人民醫院藥學部，2鄭州大學附屬腫瘤醫院， 河南省腫瘤醫院藥學部，河南 鄭州 450053)

目的： 觀察利拉魯肽通過微小RNA-375(microRNA-375，miR-375)對db/db小鼠胰島細胞凋亡的影響，探討其可能作用機制，為臨床應用提供藥效學依據。方法: 20只8周齡雄性db/m小鼠為正常對照組，皮下注射等量的生理鹽水。40只8周齡雄性db/db小鼠隨機分為2組，每組20只：糖尿病對照組的db/db小鼠皮下注射等量生理鹽水；利拉魯肽組的db/db小鼠皮下注射利拉魯肽300 μg·kg-1·d-1。給藥8周后，檢測各組小鼠體重(BW)、空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量，并進行腹腔注射葡萄糖耐量實驗(IPGTT)和胰島素耐量實驗(ITT)；蘇木精-伊紅(HE)染色檢測胰島組織病理學變化；原位末端轉移酶標記技術(TUNEL)檢測胰島凋亡情況；Western blot法檢測胰島凋亡相關蛋白caspase-3、Bcl-2及Bax的蛋白水平；實時熒光定量PCR檢測胰島miR-375的表達水平。小鼠胰島β細胞系MIN-6分為對照組(等量溶媒孵育)、miRNA-375 mimic組和miRNA-375 mimic+利拉魯肽組，MTT實驗檢測細胞活力，Western blot法檢測各組細胞caspase-3、 Bcl-2及Bax的蛋白水平。結果: 整體實驗中，與對照組相比，利拉魯肽組BW、FBG、FINS、TC、TG及LDL-C含量明顯降低(P<0.05)；胰島數量較模型組增多，體積較大，細胞結構明顯改善；胰島細胞凋亡減少；利拉魯肽組的Bcl-2表達明顯增高，caspase-3和Bax的表達顯著下降(P<0.05)；胰島組織miR-375的水平顯著降低(P<0.01)。細胞實驗中，經miRNA-375 mimic處理24 h后，MIN-6細胞活力顯著降低，Bcl-2表達減少，而caspase-3和Bax的蛋白水平顯著增加(P<0.05)，給予利拉魯肽組治療后，MIN-6細胞活力明顯上升，Bcl-2表達明顯增高，caspase-3和Bax的蛋白水平顯著下降(P<0.05)。結論: 利拉魯肽可以抑制糖尿病胰島β細胞的凋亡，其機制可能與調控胰島組織中miR-375的表達有關。

利拉魯肽； MicroRNA-375； 胰島細胞； 細胞凋亡

2型糖尿病主要由胰島素抵抗和β細胞功能障礙導致的絕對或相對的胰島素分泌不足而引起[1]。對于2型糖尿病而言，β細胞功能障礙是導致胰島素分泌不足的主要原因，而細胞凋亡是導致胰島β細胞功能障礙的關鍵因素，所以抑制胰島β細胞的過度凋亡，維持胰島細胞再生和死亡的平衡，是糖尿病治療的關鍵要素[2]。微小RNAs(microRNAs，miRNAs，miR)調節正常的細胞分化、細胞增殖和凋亡，研究發現miRNAs在胰腺發育和功能的維持中起著非常重要的作用， miR-375是在胰腺中特異表達的microRNAs之一，它的正常表達與否對胰腺的形態、發育和功能也至關重要[3]。研究表明，胰島細胞中miR-375低表達或表達缺失可通過減少β細胞團而減少胰島素的分泌，相反miR-375過表達將會影響胰島β細胞功能，同樣減少胰島素的分泌[4]。梁國威等[5]和胥娟等[6]研究結果亦顯示，2型糖尿病患者血清中的miR-375水平顯著高于正常對照組。夏華強[7]研究證實miR-375過表達可以通過抑制MTPN的表達引起胰腺損傷。由此可見，維持miR-375正常表達可能成為糖尿病治療的新靶點。

利拉魯肽(liraglutide)作為一種新型抗糖尿病藥物，是長效人胰高糖素樣肽-1(glucagons-like peptide-1，GLP-1)類似物，已廣泛應用于臨床，其主要以葡萄糖濃度依賴的模式刺激胰島素的分泌，從而安全有效降低糖尿病患者血糖，然而，近年來，研究者對利拉魯肽研究顯示，其作用機制不僅局限于這一點。胥娟等[6]研究結果顯示利拉魯肽治療初診斷2型糖尿病后，胰島β細胞功能的改善可能與血清中miR-375表達下調有關。王允山等[8]研究顯示利拉魯肽治療db/db小鼠8周后胰島形態顯著改善，β細胞增殖活躍，同時與模型對照組相比，給藥組miR-375表達降低了50%。以上研究表明，利拉魯肽對胰島細胞有保護作用且與miR-375有關，但利拉魯肽對通過miR-375對胰島的保護作用是否通過抑制胰島細胞凋亡并沒有明確研究報道。因此，本實驗在db/db小鼠模型及MIN-6細胞系上研究miR-375與胰島細胞凋亡的關系，以及利拉魯肽是否通過miR-375抑制胰島細胞凋亡。

材 料 和 方 法

1 實驗動物和細胞

40只8周齡雄性db/db小鼠，購自江蘇省動物實驗基地南京軍區總醫院實驗動物中心[合格證號SCXK(蘇)2012-450]，體重25～35 g；20只8周齡雄性db/m小鼠，體重30～40 g，購自江蘇省動物實驗基地南京軍區總醫院實驗動物中心[合格證號SCXK(蘇)2012-450]。MIN-6細胞系購自ATCC。

2 試劑和儀器

利拉魯肽購自諾和諾德制藥有限公司，國藥準字J20110026；血糖試劑及血糖儀購自Roche；血糖、總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)及低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；BCA蛋白濃度測定試劑盒生產于碧云天生物技術公司； I 抗GAPDH、Bcl-2、Bax、caspase-3及 II 抗購自CST;TRIzol、RNA to cDNA EcoDryTMPremix、XfectTMMicroRNA Transfection Reagent、Mir-XTMmiRNA qRT-PCR SYBR? Kit、miR-375、miR-375 mimic及U6引物購自TaKaTa生物工程有限公司； DMEM培養基和胎牛血清購自Gibco；胰酶購自Sigma。

低溫超速離心機(Thermo)；Western blot電泳系統(Bio-Rad)；凝膠成像系統(Tanon)；光學顯微鏡(OLYMPUS)；分析天平(METTLER TOLEDO)；細胞培養箱(SANYO)。

3 方法

3.1 動物分組、模型復制及給藥 所有小鼠飼養于清潔級環境中，保持濕度55%～65%，溫度25 ℃，并且維持12/12 h明暗交替。20只db/m小鼠作為正常對照組，皮下注射等量的生理鹽水； 40只db/db小鼠隨機分為2組：糖尿病對照組，db/db小鼠皮下注射等量的生理鹽水；利拉魯肽組，db/db小鼠皮下注射利拉魯肽300 μg·kg-1·d-1。給藥8周后，摘眼球取血，3 500 r/min離心15 min，吸取上清保存于-80 ℃冰箱中待用。分離胰島，一部分保存于-80 ℃冰箱，一部分固定于10%的甲醛溶液中待用。

3.2 糖脂代謝指標的測定 每周監測體重和血糖，給藥前和給藥后測定體重(body weight，BW),空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)和血胰島素(fasting blood insulin， FINS)水平，空腹總膽固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)及LDL-C含量。

3.3 腹腔注射葡萄糖耐量實驗(intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT) 給藥8周后，小鼠禁食12 h，腹腔注射20%葡萄糖，劑量為1 g/kg體重，分別于0 、30、60、90和120 min眼眶靜脈采血，測定血糖、胰島素水平。4 ℃ 3 500 r/min離心15 min，吸取上清保存于-80 ℃冰箱中待用。

3.4 胰島素耐量實驗(insulin tolerance test，ITT) 小鼠禁食4 h，腹腔注射生物合成人胰島素，劑量為2 U/kg，分別于0、15、30和60 min尾尖采血測血糖，并將每個時點的血糖值與0 min血糖值比較，以血糖降低的幅度反映胰島素的敏感性。

3.5 蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色 將固定于10%甲醛中的胰島脫水后常規石蠟包埋，切片。將切片二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，伊紅染色，蘇木精復染，梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂膠封片。光鏡下觀察，進行病理學分析。

3.6 原位末端轉移酶標記實驗(transferase-mediated deoxyuridine triphosphate-biotin nick end labeling，TUNEL) 將固定于10%甲醛中的胰島常規石蠟包埋，切片。之后將切片二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、20 mL/L蛋白酶K 37 ℃孵育30 min、0.3% H2O2的甲醇液室溫孵育5 min、滴加50 μL TUNEL反應混合液于暗室內37 ℃孵育60 min、滴加50 μL POD轉換液于暗室內37 ℃孵育30 min、DAB顯色、蘇木精復染、鹽酸乙醇分化、自來水沖洗、梯度脫水、二甲苯透明、中性樹脂膠封固、鏡下觀察。

3.7 細胞培養 小鼠胰島β細胞系MIN-6培養于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基(含1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)，孵育于溫度37 ℃、濕度90%、含5% CO2的細胞培養箱中，待細胞生長至70%～80% 覆蓋，用0.25%胰酶消化細胞進行傳代。MIN-6分為對照組(等量溶媒孵育)、miRNA-375 mimic(50 nmol/L)組和miRNA-375 mimic+利拉魯肽(100 nmol/L)組，轉染6 h后去除轉讓媒介繼續孵育18 h后，采用MTT方法檢測細胞活力，另用冰PBS清洗后收集總蛋白。

3.8 MTT實驗檢測細胞活力 MIN-6細胞經藥物處理24 h后，每孔加入20 μL 5 g/L MTT溶液，繼續培養4 h，小心吸取上清液，加入200 μL DMSO，充分振蕩使甲臜完全溶解，490 nm下測定吸光度(A)，計算細胞存活率，達到90%以上即認為此濃度對細胞活力無明顯影響。

3.9 Western blot法檢測凋亡相關蛋白水平 提取胰島組織或細胞蛋白，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定樣品蛋白含量并稀釋樣本，配制5%濃縮膠和12%或15%分離膠，上樣，電泳，將凝膠上的蛋白轉移到PVDF膜上，并于5%脫脂奶粉或5% BSA封閉液中室溫下封閉2 h，洗膜，加 I 抗Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、caspase-3(1∶1 000)和GAPDH(1∶5 000)，4 ℃冰箱孵育過夜，洗膜，加II抗(1∶ 5 000)室溫孵育2 h，洗膜，采用ECL化學發光法顯色，使用Quantity One軟件對結果進行處理分析。

3.10 Real-time PCR檢測胰島中的miR-375水平 采用TRIzol兩步法抽提小鼠胰島總RNA，并按照逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄。反應體系(20 μL)：總 RNA 50 ng；GSP(RT-primer) 2 μL，1 pmol；2×TS Reaction Mix 10 μL；Transcript RT/RI Enzyme Mix 1 μL；RNase-free water 加至 20 μL。反應條件 為42 ℃ 30 min、85 ℃ 5 min，所得cDNA于-20 ℃保存備用。采用real-time PCR 檢測胰島中 miR-375含量，以U6作為內參照。反應體系(20 μL):SYBR Green Mix 9 μL，RT-Product 2 μL，正義引物0.8 μL，反義引物0.8 μL，ddH2O 7.4 μL。擴增后miRNA的表達量計算公式為2-ΔΔCt。

4 統計學處理

使用SPSS 17.0軟件進行數據統計。計量資料均以均數±標準誤(mean±SEM)表示，組間比較采用單因素方差(one-way ANOVA)分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 各組小鼠糖脂代謝指標的變化

8周齡時，db/db小鼠的空腹血糖均已超過15 mmol/L，符合糖尿病小鼠高血糖代謝特征。基線水平時，糖尿病對照組和利拉魯肽組小鼠的BW、FBG、TC、TG和LDL-C均無明顯差異，但明顯高于非糖尿病組。利拉魯肽組小鼠在給藥8周后，與給藥前相比血糖沒有進一步的發展，且顯著低于糖尿病對照組(P<0.05)。給藥8周后FBG、TC、TG和LDL-C顯著低于糖尿病對照組(P<0.05)，BW高于糖尿病對照組(P<0.05)，見表1。

表1 各組小鼠血清生化指標的比較

*P<0.05,**P<0.01vsdiabetic group.

2 IPGTT結果

糖尿病對照組、利拉魯肽組小鼠血糖均在給予葡萄糖30 min后達到峰值，隨后下降。與糖尿病對照組比較，利拉魯肽組小鼠血糖水平顯著下降(P<0.01)，血糖曲線下面積計算結果亦顯示利拉魯肽組明顯低于糖尿病對照組(P<0.05)。糖尿病對照組小鼠腹腔注射葡萄糖引起的胰島素釋放顯著受損，胰島素釋放曲線低平，沒有明顯的分泌高峰，利拉魯肽組較糖尿病對照組胰島素分泌得到明顯改善，在30 min出現高峰，達到基線值的1.9倍，胰島素曲線下面積增加2.1倍(P<0.01)，見圖1。

Figure 1.The curves of blood glucose concentrationvstime (A) and their area under the curve (B) and the curves of insulin concentrationvstime (C) and their area under the curve (D) in intraperitoneal glucose tolerance test (IPGTT). Mean±SEM.n=20.*P<0.05,**P<0.01vsdiabetic group.

圖1 腹腔注射葡萄糖耐量實驗中血糖和胰島素隨時間變化曲線及其曲線下面積

3 ITT結果

與糖尿病對照組比較，利拉魯肽組小鼠胰島素敏感性明顯增加，ITT各個時點血糖降低幅度均明顯增加(P<0.05)，見圖2。

4 各組小鼠胰島的形態學觀察

經HE染色，顯微鏡下觀察可見：正常對照組小鼠胰島較大，胰島細胞數量較多，大小一致，排列整齊，分布均勻；糖尿病對照組小鼠胰島數目明顯減少，形狀不規則，排列紊亂，分布稀疏，出現空泡區；利拉魯肽組小鼠胰島數量較糖尿病對照組增多，體積較大，細胞結構明顯改善，見圖3。

5 各組小鼠胰島的TUNEL染色觀察

經TUNEL染色后，顯微鏡下觀察判斷標準為正常細胞核呈淡藍色，陽性細胞核出現深棕色顆粒。結果顯示正常對照組小鼠胰島細胞排列整齊，無棕色陽性細胞；糖尿病對照組胰島細胞排列松散，并有大量棕色陽性細胞；利拉魯肽組較糖尿病對照組棕色陽性細胞明顯減少，見圖4。

Figure 2.Percentage changes of glucose concentration at initial in insulin tolerance test (ITT). Mean±SEM.n=20.*P<0.05,**P<0.01vsdiabetic group.

圖2 胰島素耐量實驗中腹腔注射胰島素后血糖隨時間的變化曲線

Figure 3.The histopathological examination of the islet in each group (×400).

圖3 各組小鼠胰島的病理學檢查

Figure 4.TUNEL staining of islet in each group (×400).

圖4 小鼠胰島的TUNEL染色

6 各組小鼠胰島組織凋亡相關蛋白的表達

與糖尿病對照組相比，利拉魯肽組小鼠胰島組織凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達明顯升高，凋亡相關蛋白Bax的表達水平明顯降低，caspase-3剪切水平明顯降低，差異有統計學顯著性(P<0.05)，見圖5。

7 各組小鼠胰島組織miR-375水平的觀察

與正常對照組相比，糖尿病對照組小鼠胰島組織中miR-375含量顯著升高(P<0.01)；與糖尿病對照組比較，利拉魯肽組小鼠胰島組織中miR-375含量明顯降低(P<0.01)，見圖6。

8 利拉魯肽對miR-375過表達的MIN-6細胞活力的影響

如圖7所示，小鼠胰島β細胞系MIN-6經miR-375 mimic孵育12 h后，細胞活力顯著降低，為溶媒對照組的70%(P<0.01)；與miR-375 mimic組相比，共孵育利拉魯肽組的細胞活力顯著增加(P<0.01)。

9 利拉魯肽對miR-375過表達的MIN-6細胞凋亡相關蛋白的影響

如圖8所示，經miRNA-375 mimic處理12 h后，MIN-6細胞活力顯著降低，Bcl-2表達減少，而caspase-3和Bax的蛋白水平顯著增加(P<0.05)，共孵育利拉魯肽后，Bcl-2表達明顯增高，caspase-3和Bax的蛋白水平顯著下降(P<0.05)。

Figure 5.Apoptosis-related protein levels in the islet of each group. Mean±SEM.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsdiabetic group.

圖5 小鼠胰島中凋亡相關蛋白水平的檢測

Figure 6.miR-375 levels in the islet of each group. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vsdiabetic group.

圖6 小鼠胰島miR-375含量的觀察

討 論

2型糖尿病以胰島素抵抗和胰島β細胞功能衰竭為特征[9]。在糖尿病發病初期，胰島β細胞分泌功能代償性增強，表現為胰島素抵抗和高胰島素血癥。隨著病程的發展，胰島β細胞功能代償逐漸衰退，出現胰島β細胞功能衰竭和細胞凋亡，進一步加重糖尿病的代謝紊亂，并導致一系列并發癥。因此，胰島β細胞的功能衰退是2型糖尿病發展過程中的關鍵環節，如何保護和防止胰島β細胞功能衰竭和細胞凋亡是目前2型糖尿病防治的關鍵之一[10]。

Figure 7.The viability of the MIN-6 cell with different treatments. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vsmiR-375 group.

圖7 各組MIN-6細胞活力的比較

Figure 8.Apoptosis-related protein levels in the MIN-6 cells with different treatments. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsmiR-375 group.

圖8 MIN-6細胞凋亡相關蛋白水平的檢測

MicroRNA大部分在生物體中呈現特異性表達，可調節生物體的發育、神經分化、細胞增殖、凋亡等。miR-375是在進化中高度保守的microRNA，大量研究表明miR-375是在胰腺中特異表達最多的microRNA之一，在維持胰島β細胞的增殖、凋亡及胰島素分泌功能上發揮重要作用[11]。研究發現，miR-375的過度表達可抑制鼠胰島β細胞中由葡萄糖誘發的胰島素分泌，相反，內源性miR-375的功能被抑制后則可以促進胰島素的分泌[12]。另有研究顯示，miR-375可加劇棕櫚酸誘導的胰島β細胞凋亡。以上表明miR-375可作為改善胰島β細胞功能，治療2型糖尿病的靶點。

利拉魯肽作為一種新型抗糖尿病藥物，已廣泛應用于臨床。體外研究證實利拉魯肽可以抑制白細胞介素1β誘導的β細胞凋亡，誘導人胰島細胞增殖[13]。動物研究發現利拉魯肽可促進糖尿病小鼠胰島β細胞增殖[14]，并且利拉魯肽可以改善邊緣胰島細胞移植小鼠抑制物的植入和功能，使移植后的β細胞凋亡減少[15]。此外，大量的體內外研究均表明，利拉魯肽可以通過影響自噬保護高血脂及高血糖誘導的胰島β細胞凋亡，改善胰島β細胞功能[16-19]。然而，目前均無報道證明利拉魯肽是否通過調節miR-375進而抑制胰島β細胞凋亡。

本文主要探討利拉魯肽通過調節miR-375抑制胰島細胞凋亡的作用。整體實驗結果顯示，利拉魯肽可以降低db/db小鼠BW、FBG、FINS、TC、TG及LDL-C含量，HE結果顯示利拉魯肽可以改善胰島結構紊亂，TUNEL結果顯示利拉魯肽可以抑制胰島細胞凋亡，Western blot實驗結果顯示Bcl-2表達明顯增高，caspase-3和Bax的蛋白水平顯著下降；胰島組織miR-375水平顯著降低。進一步在細胞實驗中給予MIN-6細胞大劑量的miR-375 mimic孵育后，細胞活力顯著下降，且Bcl-2水平顯著下降，caspase-3和Bax水平顯著增加，直接證明miR-375上調會導致胰島β細胞凋亡。而利拉魯肽則可以通過下調或抑制miR-375起到保護胰島β細胞的作用。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Anti-apoptosis effect of liraglutide on islet via regulating microRNA-375

YANG Qing-yu1, GAO Na2

(1DepartmentofPharmacy,People’sHospitalofZhengzhou,2DepartmentofPharmacy,AffiliatedTumorHospitalofZhengzhouUniversity,HenanCancerHospital,Zhengzhou450053,China.E-mail:qingyuyang2016@163.com)

AIM: To observe the anti-apoptosis effect of liraglutide on the islet through microRNA-375 (miR-375) for providing additional pharmacodynamic evidence for its clinical application. METHODS: Forinvivostudy, C57BL/KsJ-db/mmice aged 8 weeks served as normal control group. A total of 40 male genetically diabetic C57BL/KsJ-db/dbmice at the same age were randomly divided into diabetic control group (thedb/dbmice were injected subcutaneously with equivalent amount of saline) and liraglutide group (thedb/dbmice were injected subcutaneously with liraglutide at dose of 300 μg·kg-1·d-1). After 8 weeks of administration, body weight (BW) was measured and blood was collected for detection of fasting blood glucose (FBG), fasting blood insulin (FINS), triglyceride (TG), total cholesterol (TC) and low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C). Before sacrifice, intraperitoneal glucose tolerance test (IPGTT) and insulin tolerance test (ITT) were conducted. The histopathological features in the islet tissue were examined with HE staining. The apoptosis in the islet tissue was detected by TUNEL staining. The protein levels of caspase-3, Bcl-2 and Bax were determined by Western blot. The level of miR-375 in the islet tissue was detected by qPCR. Forinvitrostudy, the MIN-6 cells were cultured and divided into control group (incubated with equivalent amount of solvent), miR-375 mimic group and miR-375 mimic+ liraglutide group. The cell viability was examined by MTT assay. The protein levels of caspase-3, Bcl-2 and Bax were detected by Western blot. RESULTS: In theinvivostudy, compared with control group, the levels of BW, FBG, FINS, TC, TG and LDL-C were decreased significantly in liraglutide group. The islet apoptosis was reduced by the administration of liraglutide. The expression of Bcl-2 was up-regulated significantly, while the protein levels of caspase-3 and Bax were down-regulated significantly in liraglutide group. The level of miR-375 was decreased significantly. In theinvitrostudy, the cell viability was decreased in miR-375 mimic group and increased in miR-375 mimic+liraglutide group. Moreover, the expression of Bcl-2 was decreased and the protein levels of caspase-3 and Bax were increased with the incubation of miR-375 mimic, while the expression of Bcl-2 was increased and the protein levels of caspase-3 and Bax were decreased with the co-incubation of miR-375 mimic and liraglutide. CONCLUSION: Liraglutide attenuates islet apotosis, and the mechanism may be associated with its effects of reducing the elevated level of miR-375 in islet tissues.

Liraglutide; MicroRNA-375; Islet cells; Apoptosis

雜志網址： http://www.cjpp.net

1000- 4718(2016)09- 1627- 08

2016- 03- 16

2016- 08- 11

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10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.09.016