SOX5基因多態性與慢性阻塞性肺疾病及并發癥肺動脈高壓的關聯性分析*

耑 冰， 何 凌， 魯玉婷， 李 萍， 趙 霞， 邱國輝， 馬 南， 馬 威， 楊 朝△

(1西北民族大學第一附屬醫院呼吸內科， 2寧夏人民醫院呼吸內科，寧夏 銀川 750001；3漯河市第一人民醫院呼吸科， 4漯河市中醫院內二科，河南 漯河 462000；5寧夏醫科大學，寧夏 銀川750021； 6西北民族大學第一臨床學院，寧夏 銀川 750001)

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SOX5基因多態性與慢性阻塞性肺疾病及并發癥肺動脈高壓的關聯性分析*

耑 冰1, 2， 何 凌3， 魯玉婷4， 李 萍1, 2， 趙 霞1, 2， 邱國輝5， 馬 南5， 馬 威6， 楊 朝1, 2△

(1西北民族大學第一附屬醫院呼吸內科，2寧夏人民醫院呼吸內科，寧夏 銀川 750001；3漯河市第一人民醫院呼吸科，4漯河市中醫院內二科，河南 漯河 462000；5寧夏醫科大學，寧夏 銀川750021；6西北民族大學第一臨床學院，寧夏 銀川 750001)

目的： 通過觀察慢性阻塞性肺疾病(COPD)穩定期患者、COPD合并肺動脈高壓(PH)患者及健康者之間SOX5基因單核苷酸多態性(SNPs)的分布差異，初步探索SOX5基因多態性與COPD相關PH易感性的關聯。方法: 連續選擇2013年4月～2015年4月就診于寧夏人民醫院總院及寧南分院呼吸內科的COPD穩定期患者250例，根據COPD診治指南(2013年版)診斷標準入組，并且就診當天全部進行超聲心動圖檢查，根據肺動脈收縮壓(PASP)結果分為COPD合并PH組(PASP≥50 mmHg)103例和COPD非PH組(PASP<50 mmHg)147例。健康對照組選擇同期在寧夏人民醫院體檢的健康者127例。使用Sequenom MassARRAY SNP檢測系統檢測所有受試者SOX5基因rs10842262和rs11046966位點的基因型，統計基因型頻率并對比各組間差異。結果: 健康對照組與COPD組之間(包括COPD合并PH及未合并PH組的全部患者)以及COPD合并PH組與COPD非PH組之間在年齡、性別和吸煙指數上的差別均無統計學顯著性。健康對照組與COPD組之間SOX5基因rs10842262位點及rs11046966位點基因型頻率分布的差異均存在統計學顯著性(P<0.05)。COPD合并PH組與COPD非PH組之間SOX5基因rs10842262位點及rs11046966位點各基因型頻率分布的差異無統計學顯著性。結論:SOX5基因rs10842262和rs11046966位點的基因多態性與COPD的易感性相關，但與COPD相關PH的易感性還不能認為有關聯。

慢性阻塞性肺疾病； 肺動脈高壓；SOX5基因； 單核苷酸多態性

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases，COPD)是一種以持續氣流受限為特征，嚴重危害人類健康的常見病、多發病。隨著病程的進展，COPD會出現多種并發癥，其中較常見的是肺動脈高壓(pulmonary hypertension，PH)。PH是COPD發展至肺心病的關鍵過程[1]，可使肺循環阻力逐漸增大，引起右心室的肥大及右心功能衰竭，最終導致患者的死亡。

越來越多的研究發現，基因多態性，尤其是單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)，可通過影響炎癥、免疫、蛋白酶-抗蛋白酶平衡、氧化-抗氧化平衡、肺發育-修復平衡等途徑參與COPD的發病過程[2]。一項以家系為基礎的關于早發COPD的研究發現[3]，染色體12p區域基因可能與FEV1的下降以及中度氣流阻塞存在一定關聯。另一項全基因組相關研究(genome-wide association study，GWAS)進一步鎖定了12p區域的SOX5基因rs11046966位點或許與COPD的致病風險相關[4]。同時，SOX5的另一關鍵位點rs10842262目前在非梗阻性無精子癥(non-obstructive azoospermia，NOA)中被廣泛研究[5]，但該位點在中國人群COPD的致病風險中研究較少。迄今為止，SOX5基因rs10842262位點及rs11046966位點在COPD相關PH發病易感性上是否存在聯系目前尚不明確。

因此，本研究擬對比COPD合并PH的患者、COPD非PH的患者以及健康者之間SOX5基因rs10842262位點和rs11046966位點基因型頻率的分布差異，初步探索SOX5基因的SNPs在部分中國人群COPD相關PH的易感性上是否存在聯系，進而為COPD相關PH的易感基因篩查提供實驗依據。

材 料 和 方 法

1 研究對象

病例組為連續選擇2013年4月～2015年4月就診于寧夏人民醫院總院及寧夏人民醫院寧南分院呼吸內科的COPD患者250例，平均年齡(72.1±10.2)歲(男女比例143/107)。健康對照組選擇同期于寧夏人民醫院體檢中心進行體檢的健康體檢者127例，平均年齡(71.2±9.5)歲(男女比例為66/61)。為了避免收入潛在的COPD患者，由呼吸內科專科醫師詢問病史、查體并核查體檢報告中胸片、心臟彩超、肺功能檢查結果均無異常。

COPD納入標準：所有入組的COPD患者均按照2013年《慢性阻塞性肺疾病診治指南》中推薦COPD診斷標準中相應臨床表現、危險因素、體征，且第1秒用力呼氣容積/用力肺活量(FEV1/FVC)<70%[6]。PH的診斷根據2009年歐洲呼吸學會和歐洲心臟病學會聯合頒布的PH診治指南[7]中提及超聲心動圖診斷PH的標準；根據病史，臨床表現可疑者，超聲心動圖檢查三尖瓣返流速度>3.4 m/s，肺動脈收縮壓(pulmonary artery systolic pressure，PASP)≥50 mmHg。我們按照以上標準將COPD患者按照心臟彩超檢查PASP結果分為 COPD-PH組[PASP≥50 mmHg,103例，平均年齡(73.2±9.3)歲,男女比例為58/45]； COPD非PH組[PASP<50 mmHg，147例，平均年齡(71.3±10.7)歲，男女比例為85/62]。

排除：肺結核、阻塞性睡眠暫停低通氣綜合征、慢性哮喘、肺栓塞，以及間質性肺病、胸廓畸形等限制性通氣障礙；高血壓、先天性心臟病、心瓣膜病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病，以及左心功能不全嚴重充血性心衰(2～4級NYHA分級)；惡性腫瘤疾病；自身免疫性疾病；糖尿病、嚴重的內分泌疾病、貧血等血液疾病、嚴重的肝、腎功能損傷等；靜脈藥物濫用、抑制食欲藥物(如右芬氟拉明、阿米雷司及其衍生物等)以除外藥物引起的PH。

本研究為回顧性病例對照研究，所有入組者均遵循自愿參加原則，簽署知情同意書，并經過寧夏自治區人民醫院倫理委員會批準。

2 研究方法

2.1 DNA的提取 所有受試者禁食后晨起抽取外周靜脈血4 mL用于本研究，使用AxyPrep 血基因組DNA小量試劑盒(AXYGEN)提取DNA。

2.2SOX5基因SNP位點基因分型 將DNA樣本稀釋至50 μg/L，并委托北京博奧生物有限公司采用Sequenom MassARRAY平臺(Sequenom)進行SNP的分型，引物設計使用Genotyping Tools 及MassARRAY Assay Design軟件設計待測SNP位點的PCR擴增引物及單堿基延伸引物，并交由北京博奧生物公司合成。rs11046966位點的上游引物為5′-ACGTTGGATGACCCAGAATTTGCTTATGCC-3′，下游引物為5′- ACGTTGGATGAACCACAGTTCCAGATAAGC-3′，延伸引物為5′-CGTTACAGATAAGCAAGAATCCATCC-3′； rs10842262位點的上游引物為 5′-ACGTTGGATGTCCTGATTCGAATCCTATG-3′，下游引物為5′-ACGTTGGATGTATGGGTTAACACAGAGTGC-3′，延伸引物為 5′-ATTCGAATCCTATGTACACTA-3′。

2.3 測序的質量控制 使用5管已經使用二代測序驗證(南京金斯瑞生物科技有限公司)的DNA作為陽性對照，使用5管鮭魚精DNA作為陰性對照，混雜在待測的所有DNA樣本中進行SNP分型，最后結果完全匹配。

3 統計學處理

數據的統計與處理采用SPSS17.0統計軟件，以P<0.05為差異有統計學顯著性。年齡、吸煙指數等計量資料采用均數±標準差(mean±SD)表示，兩組間均數的對比使用獨立樣本t檢驗，多組間均數的對比采用單因素方差分析；兩組間性別構成比、基因型頻率的對比采用卡方檢驗，使用Hardy-Weinberg 平衡法檢驗各組受試人員基因型頻率， 以P>0.05為該群體的基因型符合遺傳學平衡標準，即代表樣本具有群體遺傳代表性。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 一般資料

分別對比COPD組(包括COPD非PH組與COPD合并PH組所有患者)與健康對照組之間、COPD非PH組與COPD合并PH組之間的年齡、性別構成及吸煙指數(吸煙指數單位定義為每天吸煙1包持續吸煙1年)等指標，結果顯示：COPD組與健康對照組在年齡、性別構成比和吸煙指數上的差別均無統計學顯著性，提示兩組之間具有可比性,見表1。COPD非PH組與COPD合并PH組在年齡、性別構成比和吸煙指數上的差別也均無統計學顯著性，提示兩組之間具有可比性,見表2。

2 Hardy-Weinberg基因遺傳平衡性檢驗

經過Hardy-Weinberg 平衡檢驗，健康對照組、COPD組(包括COPD非PH組與COPD合并PH組所有患者)、COPD非PH組以及COPD合并PH組4組均具有群體遺傳代表性,見表3。

表1 健康對照組與COPD組間一般資料比較

表2 COPD-非PH組與COPD-PH組間一般資料比較

表3 SOX5基因rs11046966和rs10842262位點基因型在各組間的Hardy-Weinberg 平衡檢驗

P>0.05 suggests that the distribution ofSOX5 genotypes in the studied groups was representative of the genotype distribution in the entire population.

3 rs11046966和rs10842262位點基因型頻率與COPD的關聯性分析

SOX5基因rs11046966位點的基因型頻率在健康對照組和COPD組間的分布差別存在統計學顯著性(P<0.05)。同時SOX5基因rs10842262位點基因型頻率在COPD患者及健康對照者之間分布的差別也有統計學顯著性(P<0.05),見表4。

4 rs11046966和rs10842262位點基因型頻率在COPD合并PH的關聯性分析

SOX5基因rs11046966和rs10842262位點基因型頻率在COPD非PH組與COPD合并PH組之間的差別無統計學顯著性,見表5。

表4 健康對照組與COPD組之間rs11046966和rs10842262位點基因型頻率的對比

表5 COPD非PH組與COPD合并PH組間rs11046966和rs10842262位點基因型頻率對比

討 論

COPD的發病機制較為復雜，且個體之間發病易感性差異較大。究其原因，目前認為除了煙霧、缺氧等環境因素之外，基因多態性也起著一定作用[8]，針對基因多態性研究中最多的就是SNPs。SNPs是指某一基因中人群發生率超過1%的單個堿基的替換或顛換現象，發生在基因編碼區的SNPs 會導致其表達產物蛋白質中氨基酸替換，并對蛋白質的活性和生物學效應發生重要影響，在人體對致病物質的敏感性與耐受性、對藥物治療的反應性以及對疾病的易感性上都起著重要的作用。

SOX5基因是SOX基因家族中的重要成員之一，該基因家族成員表達產物的共同特點是均含高度保守的HMG box DNA結合域，SOX基因表達產物通過該結構域與對應DNA片段特異性結合，從而可以在個體各種發育過程中對特定細胞進行調控，決定細胞命運，已經證實其在肺組織中廣泛表達[9]。目前，SOX5基因的SNPs在神經膠質瘤、乳腺癌及NOA等疾病中被廣泛研究[10-12]。

近期有研究發現SOX5基因的SNPs與COPD的發病有一定關聯[3]。有學者通過全基因組關聯研究，發現SOX5基因3’端的rs11046966位點SNPs可能與COPD的發生具有顯著關聯，考慮SOX5基因是COPD的一個易感基因；并進一步通過對比SOX5基因敲除小鼠SOX5(-/-)、SOX5雜合基因小鼠SOX5(+/-)以及野生小鼠SOX5(+/+)肺發育情況，初步發現SOX5表達產物對于肺組織發育有一定作用，認為SOX5可能是通過影響肺發育來影響COPD發病進程。雖然這些肺發育的變化可能不會直接在兒童時期就顯現出來，但是可以增加機體對損傷因素的敏感性(比如說煙霧)[13-14]。

本研究采用病例對照研究的方法，通過飛行質譜法檢測中國寧夏回族自治區人群250例COPD患者及127例健康對照者SOX5基因SNPs位點基因型，發現SOX5的基因rs11046966位點的基因型頻率在兩組間的分布差別存在統計學顯著性，提示SOX5的基因rs11046966位點與COPD致病易感性有一定關聯。本研究同時發現SOX5基因rs10842262位點基因型頻率在COPD患者及健康對照者之間分布的差別有統計學顯著性，基因型頻率提示rs10842262位點與COPD易感性有關聯。然而，目前rs10842262位點在COPD易感性中研究較少，一項關于非梗阻性無精子癥的研究[15]指出，該位點所在的SOX5基因通過誘導精子細胞尾部變形在精子發育中起關鍵作用，進一步研究發現[16]，SOX5基因在一些包含纖毛的組織(如睪丸、肺、腦等)內高度表達，在纖毛的形成和運動中發揮重要作用。因此我們推測，rs10842262位點或許可能通過影響氣道內皮纖毛的發育和功能進而影響COPD的發生和進展，這些推測仍需要下一步通過動物實驗證實。

本研究將250例COPD患者分為COPD-非PH組與COPD合并PH組，檢測rs11046966位點及rs10842262位點各自在兩組間SNPs分布，發現兩位點在兩組之間的分布差別無統計學顯著性，提示SOX5的基因rs11046966位點及rs10842262位點與COPD相關PH致病關聯不大，因目前相似研究較少，我們考慮兩組間差別無統計學顯著性的原因如下：首先，PH是一種多因素參與的復雜的疾病，缺氧、離子通道功能紊亂，血管內皮細胞功能異常、血管舒縮因子合成分泌的失調等多種因素都在PH的發展中起作用，因SOX5基因rs11046966位點及rs10842262位點基因多態性所引起的SOX5表達水平的變化可能不足以對上述病理生理過程產生決定性影響。其次，樣本量不夠大也使本實驗產生II型錯誤的可能性增加，使實驗出現假陰性的結論。最后，超聲心動圖雖然可以達到一定的靈敏度和特異度，但畢竟不是診斷PH的金標準，可能使實驗分組產生一定的偏倚。因此，下一步研究我們需要繼續擴大樣本量，在條件具備后使用右心導管法檢測肺動脈壓力，從而增加實驗的說服力。

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(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Association of SOX5 polymorphisms in chronic obstructive pulmonary disease-related pulmonary hypertension

ZHUAN Bing1, 2, HE Ling3, LU Yu-ting4, LI Ping1, 2, ZHAO Xia1, 2, QIU Guo-hui5, MA Nan5, MA Wei6, YANG Zhao1, 2

(1DepartmentofRespiratoryMedicine,FirstAffiliatedHospitalofNorthwestUniversityforNationalities，2DepartmentofRespiratoryMedicine,NingxiaPeople’sHospital,Yinchuan750001,China;3DepartmentofRespiratoryMedicine,TheFirstPeople’sHospitalofLuohe，4TheSecondDepartmentofInternalMedicine,TraditionalChineseMedicinalHospitalofLuohe,Luohe462000,China;5TheNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750021,China;6TheFirstClinicalCollegeofFirstAffiliatedHospitalofNorthwestUniversityforNationalities,Yinchuan750001,China.E-mail:greentree66611@sina.com)

AIM: To investigate the differences in the distribution of SRY-related HMG box 5 (SOX5) gene single nucleotide polymorphisms (SNPs) among stable chronic obstructive pulmonary disease (COPD) patients, COPD with pulmonary hypertension (PH) patients and healthy controls, and to explore the association of theSOX5 SNPs in COPD-related PH. METHODS: From April 2013 to April 2015, 250 patients with stable COPD were enrolled continuously in Ningxia People’s Hospital according to COPD treatment guidelines (2013 edition). All the patients received echocardiography, and were divided into COPD with PH group [pulmonary artery systolic pressure (PASP)≥50 mmHg,n=103] and COPD without PH group (PASP<50 mmHg,n=147). The healthy persons (matched for age, sex, race and smoking index,n=127) were selected as control group at the same period. Genotyping ofSOX5 gene rs10842262 and rs11046966 loci was performed using MassARRAY genotyping system (Sequenom). Genotype frequencies were calculated. RESULTS: Age, sex and smoking index showed no significantly difference between control group and COPD group, neither between COPD with PH group and COPD without PH group. Genotype frequencies ofSOX5 gene rs10842262 and rs11046966 loci between control group and COPD group was of significant difference (P<0.05). Genotype frequencies ofSOX5 gene rs10842262 and rs11046966 loci showed no significant difference between COPD with PH group and COPD without PH group. CONCLUSION:SOX5 gene rs10842262 and rs11046966 loci may play an important role in COPD, but not in COPD-related PH.

Chronic obstructive pulmonary disease; Pulmonary hypertension;SOX5 gene; Single nucleotide polymorphisms

雜志網址： http://www.cjpp.net

1000- 4718(2016)09- 1648- 05

2016- 03- 21

2016- 05- 04

國家自然科學基金資助項目(No. 81160011； No. 81560014)； 西北民族大學中央高校基本科研業務費資助項目(No. 31920150056)

△通訊作者 Tel: 0951-5920282; E-mail: greentree66611@sina.com

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10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.09.019