雷公藤多苷通過NOXs-ROS-NLRP3炎癥小體信號通路抑制結腸炎癥*

鄭健豪， 鐘繼紅， 曹海軍， 朱 靈， 劉 軍， 胡華軍， 李善高△

(浙江中醫藥大學 1附屬第一醫院消化科， 2附屬第二醫院消化科， 3中國計量學院生命科學學院，浙江 杭州 310006)

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雷公藤多苷通過NOXs-ROS-NLRP3炎癥小體信號通路抑制結腸炎癥*

鄭健豪1， 鐘繼紅2， 曹海軍1， 朱 靈1， 劉 軍3， 胡華軍3， 李善高1△

(浙江中醫藥大學1附屬第一醫院消化科，2附屬第二醫院消化科，3中國計量學院生命科學學院，浙江 杭州 310006)

目的： 觀察雷公藤多苷對右旋葡聚糖硫酸鈉(dextran sulphate sodium，DSS)誘導的小鼠潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)的防治作用及對黏膜組織NADPH氧化酶(NADPH oxidases，NOXs)-活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)-NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)炎癥小體信號通路表達的影響，探討其治療潰瘍性結腸炎的作用及機制。方法: BALB/c小鼠隨機分為5組：模型組；低、中及高劑量雷公藤多苷灌胃組；正常組。采用DSS誘發UC動物模型，雷公藤多苷灌胃21 d 后，取結腸組織，運用實時熒光定量PCR法檢測結腸黏膜組織NLRP3、ASC及caspase-1 的mRNA表達，免疫組化法檢測結腸黏膜組織caspase-1的表達，ELISA法檢測結腸組織勻漿上清IL-1α、TNF-α及IL-13的含量，魯米諾化學發光法檢測結腸黏膜組織ROS的生成和經DPI(NOXs抑制劑)抑制后的NADPH消耗率來分析NOXs活性；體外分離結腸組織中性粒細胞，檢測分離的中性粒細胞中ROS的生成、NOXs活性以及NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA表達。結果: 雷公藤多苷灌胃各組小鼠結腸黏膜組織病理均存在不同程度異常，但組織病理學評分均低于模型組；雷公藤多苷灌胃各組結腸黏膜組織和分離的中性粒細胞中，除高劑量組結腸黏膜組織caspase-1的mRNA表達與正常組相比差異無統計學顯著性外，其余各組ROS生成、NOXs活性及NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA表達水平低于模型組(P<0.05)，高于正常組(P<0.05)；雷公藤多苷灌胃各組間兩兩比較發現，除中、高劑量組結腸黏膜組織及分離的中性粒細胞caspase-1的mRNA表達差異無統計學顯著性外，其它指標相比均有統計學顯著性(P<0.05)；雷公藤多苷灌胃各組小鼠結腸組織勻漿上清中促炎因子(IL1α和TNF-α)含量低于模型組(P<0.05)，高于正常組(P<0.05)，抑炎因子(IL-13)含量各組間比較差異無統計學顯著性。結論: 雷公藤多苷可能通過抑制NOXs-ROS-NLRP3炎癥小體信號通路來降低IL-1α、TNF-α等促炎因子的表達從而對DSS誘導的UC小鼠起保護作用，中性粒細胞可能是參與其保護作用的主要炎性細胞。

雷公藤多苷； 右旋葡聚糖硫酸鈉； 潰瘍性結腸炎； 活性氧簇； NADPH氧化酶； NLRP3炎癥小體

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)的確切病因和發病機制尚不清楚，多數學者認為UC的發生與免疫反應異常有關[1]。雷公藤多苷(Tripterygiumglycosides,TG)是從衛矛科植物雷公藤根提取精制而成[2]，具有很強的抗炎和免疫調節作用，本研究旨在探討雷公藤多苷對右旋葡聚糖硫酸鈉(dextran sulphate sodium，DSS)誘導小鼠UC的防治作用，并從NADPH氧化酶(NADPH oxidases，NOXs)、活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)和NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)炎癥小體信號通路的角度探討其作用機制。

材 料 和 方 法

1 動物和試劑

健康雄性BALB/c小鼠50只，8周齡，體重(20±2) g，由浙江中醫藥大學動物實驗中心提供，動物生產許可證號為SCXK(滬)2013-0016。DSS購自Sigma，臨用前配成5% 的溶液(5 g DSS溶于100 mL 蒸餾水)。雷公藤多苷片購于浙江得恩德制藥有限公司，臨用前按人-小鼠體表面積換算，分別溶于蒸餾水配制成低、中、高劑量的雷公藤多苷混懸液，即：9.02 mg·kg-1·d-1、27.02 mg·kg-1·d-1和81.08 mg·kg-1·d-1。檢測IL-1α、TNF-α和IL-13的ELISA檢測試劑盒均購于R&D。

2 方法

2.1 實驗動物的分組及處理 參考文獻[3-4]制作UC模型，小鼠隨機分為5組，每組10只，即模型組，低、中及高劑量雷公藤多苷灌胃組和正常組。自第1周開始模型組和雷公藤多苷灌胃各組小鼠自由飲用5% DSS溶液，正常組小鼠自由飲用純凈水，同時，模型組小鼠每天用蒸餾水按0.02 mL/g進行灌胃，每天1次，而低、中及高劑量雷公藤多苷灌胃組每天分別用低、中、高劑量雷公藤多苷混懸液按0.02 mL/g進行灌胃，每天1次。造模開始后第8天各組隨機處死1只小鼠，剖腹，觀察結腸組織大體形態，然后取直乙交界處結腸組織病檢(HE 染色)，以明確是否造模成功。第2周開始，各組小鼠均自由飲用純凈水，其中模型組小鼠繼續每天蒸餾水灌胃1次，低、中及高劑量雷公藤多苷灌胃組每天分別用低、中、高劑量雷公藤多苷混懸液灌胃，每天1次，至21 d后取直乙交界處結腸組織，分別進行如下處理：(1)PCR 樣品保存液保存，用于實時熒光定量PCR、ROS和NOXs檢測；(2)10%福爾馬林固定，用于HE染色及免疫組化檢測相關指標；(3)PBS 液保存，用于ELISA檢測和分離中性粒細胞。

2.2 結腸組織形態學檢測 取上述置10%福爾馬林固定的結腸組織，石蠟包埋，3～4 μm厚連續切片，HE染色，光鏡觀察組織形態學變化。

2.3 小鼠結腸黏膜組織病理學損傷評分標準 (1) 黏膜損傷：無黏膜損傷為0分；接近基膜1/3的隱窩丟失為1分；接近基膜2/3的隱窩丟失為2分；隱窩全部消失，上皮細胞完整覆蓋為3分；隱窩、上皮都消失為4分；(2)病變范圍：無病變為0分；局灶性病變為1分；病變大約累及1/3黏膜為2分；病變大約累及2/3黏膜為3分；病變累及到全部黏膜組織為4分。組織病理學評分總分(histological score，HS)為黏膜損傷評分與病變范圍評分的乘積[3]。

2.4 分離結腸組織中的中性粒細胞 采用組織中性粒細胞分離試劑盒(購于上海易佰聚生物)分離結腸組織中的中性粒細胞，操作步驟按說明書進行。

2.5 ROS測定 應用ROS檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)檢測小鼠結腸黏膜組織和分離的中性粒細胞中的ROS水平，操作步驟按說明書進行。

2.6 NOXs 活性測定 結腸黏膜組織和分離的中性粒細胞經胰酶(Gibco)消化后，4 ℃、2 500×g離心5 min，然后以PBS懸浮，接著加入250 μmol/L NADPH(北京博潤萊特科技有限公司)孵育，5 min后測定340 nm波長的吸光度，通過吸光率的減少來測定NADPH的消耗量。為了分析NOXs特異活性，在測定之前30 min加入10 μmol/L DPI(NOXs抑制劑，Sigma)，測定DPI抑制后的NADPH 的消耗率。為標準化，用等量的細胞加入SDS溶解，濃縮蛋白后用Lowry solution測定，計算NADPH消耗總量的吸收消光系數是6.22 L·mmol-1·cm-1，NOXs活性用pmol NADPH·min-1·mg-1表示。

2.7 實時熒光定量PCR檢測結腸黏膜組織和分離的中性粒細胞中NLRP3、ASC及caspase-1的mRNA表達 用TRIzol裂解結腸黏膜組織及分離的中性粒細胞，氯仿抽提，異丙醇沉淀，75% 乙醇洗滌，DEPC水溶解，使用分光光度計測定總RNA含量和純度。cDNA合成具體步驟按照TaKaRa試劑盒說明書進行。PCR擴增具體步驟參照TaKaRa試劑盒說明書進行，引物序列和反應條件見表1。

表1 RT-qPCR的有關參數

F:forward；R:reverse.

2.8 免疫組織化學法檢測結腸黏膜組織中caspase-1的表達 采用二步法(EnVisionTM試劑盒)，基本工作步驟為脫蠟、水化；預處理組織切片(據 I 抗具體說明而定)，熱修復；3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶，孵育10 min；滴加 I 抗孵育60 mim；滴加山羊抗兔IgG抗體孵育40 min；DAB顯色液顯色3 min，在顯微鏡下控制反應，純凈水沖洗終止反應；漂洗,復染，封片。在細胞漿和/或胞核內發現黃、棕色顆粒判定為陽性細胞。利用Image-Pro Plus 6.0測定吸光度(A)值。

2.9 組織勻漿上清中IL-1α、TNF-α及IL-13含量的測定 取結腸組織，切成(2～3) mm×1 mm×1 mm小塊，放入組織勻漿器中，加入適量PBS，冰上研磨，研磨產物在4oC下12 000×g離心15 min，取上清液分裝，-80oC保存，嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行操作。

3 統計學處理

應用SPSS 17.0統計軟件分析，數據均采用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 小鼠的一般狀況

除正常組小鼠外，自造模開始后其余各組動物均出現少動，進食少，毛色失去光澤，精神倦怠,不同程度的腹瀉，肉眼便血, 肛門血染，體重下降等癥狀，但雷公藤多苷灌胃各組小鼠較模型組上述癥狀較輕，各組均未出現死亡現象。

2 小鼠結腸組織病理學改變及評分

造模第8天，模型組及雷公藤多苷灌胃各組小鼠結腸黏膜可見不同程度的充血水腫及中性粒細胞浸潤，表明造模成功。實驗結束后，雷公藤多苷灌胃各組小鼠結腸黏膜組織病理學評分明顯低于模型組(P<0.05)；雷公藤多苷灌胃高劑量組的組織病理學評分與正常組相比差異無統計學顯著性，但雷公藤多苷灌胃中、低劑量組小鼠結腸組織病理學評分顯著高于正常組(P<0.05)；雷公藤多苷灌胃各組間兩兩比較發現，除中、低劑量組間病理學評分差異無統計學顯著性外，余均有統計學顯著性(P<0.05)，見圖1、表2。

Figure 1.HE staining of mouse colon sections in different groups (×100).

圖1 各組小鼠結腸組織HE染色

表2 各組小鼠結腸組織病理學評分和結腸組織中caspase-1的表達

Table 2.The histological score of mouse colon tissues and the expression of caspase-1 in different groups (Mean±SD.n=9)

GroupHistologicalscoreCaspase-1(Avalue)Model8.23±1.538.10±1.33Low-doseTG5.00±1.00*6.20±0.93*Medium-doseTG4.67±0.54*4.10±0.46*?High-doseTG2.57±0.48*?▲3.30±0.12*?Normal1.03±0.58*1.20±0.38*

*P<0.05vsmodel;?P<0.05vslow dose TG;▲P<0.05vsmedium dose TG.

3 小鼠結腸黏膜組織及分離的中性粒細胞ROS生成水平和NOXs活性

雷公藤多苷灌胃各組小鼠結腸黏膜組織及分離的中性粒細胞中ROS生成水平和NOXs活性明顯低于模型組，但高于正常組(P<0.05)；雷公藤多苷灌胃各組間兩兩比較發現，以高劑量組最低，低劑量組最高，各組之間比較差異均有統計學顯著性(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.ROS generation and NOXs activity in the mouse colon tissues and neutrophils of different groups. Mean±SD.n=9.*P<0.05vsmodel;?P<0.05vslow-dose TG;▲P<0.05vsmedium-dose TG.

圖2 各組小鼠結腸黏膜組織及分離的中性粒細胞ROS生成和NOXs活性的比較

4 小鼠結腸黏膜組織及分離的中性粒細胞中NLRP3、ASC和caspase-1的mRNA表達水平

雷公藤多苷灌胃各組結腸黏膜組織及分離的中性粒細胞中，除了結腸黏膜組織正常組與高劑量組caspase-1的mRNA差異無統計學顯著性外，其余各組NLRP3、ASC及caspase-1的mRNA表達水平低于模型組(P<0.05)；但高于正常組(P<0.05)。雷公藤多苷灌胃各組間兩兩比較發現，除結腸黏膜組織及分離的中性粒細胞中、高劑量組caspase-1的mRNA差異無統計學顯著性外，其余各組之間NLRP3、ASC及caspase-1 的mRNA表達水平差異均有統計學顯著性(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.The mRNA expression levels of NLRP3, caspase-1 and ASC in the mouse colon tissues and neutrophils of different groups. Mean±SD.n=9.*P<0.05vsmodel;?P<0.05，??P<0.01vslow-dose TG;▲P<0.05vsmedium-dose TG.

圖3 各組小鼠結腸組織及分離的中性粒細胞NLRP3、ASC 及caspase-1 mRNA表達水平的比較

5 小鼠結腸黏膜組織caspase-1免疫組化染色結果

模型組、雷公藤多苷灌胃各組caspase-1表達量均高于正常組，且結腸炎癥黏膜區caspase-1表達遠高于非炎癥黏膜區，該表達現象在模型組尤為明顯，差異有統計學顯著性(P<0.05)；與模型組相比，雷公藤多苷灌胃各組結腸黏膜組織caspase-1表達水平明顯下降，差異有統計學顯著性(P<0.05)，雷公藤多苷灌胃各組間兩兩比較發現，除了中、高劑量組間caspase-1表達水平差異無統計學顯著性外，其余均有統計學顯著性(P<0.05)，見圖4、表2。

Figure 4.Detection of caspase-1 expression in the mouse colon sections in different groups (×200).

圖4 各組小鼠結腸組織caspase-1的檢測

6 小鼠結腸黏膜組織勻漿上清中IL-1α、TNF-α及IL-13含量

雷公藤多苷灌胃各組小鼠結腸黏膜組織勻漿上清中IL-1α和TNF-α的含量明顯低于模型組(P<0.05)，但高于正常組(P<0.05)；雷公藤多苷灌胃各組間兩兩比較發現，除了高、中劑量組間IL-1α含量差異無統計學顯著性外，其余均有統計學顯著性(P<0.05)；各組間IL-13含量差異均無統計學顯著性，見表3。

表3 各組小鼠結腸組織勻漿上清IL-1α、TNF-α及IL-13含量

Table 3.The IL-1α, TNF-α and IL-13 levels in the supernatant of colon tissue homogenate in different groups (ng/L. Mean±SD.n=9)

GroupIL-1αTNF-αIL-13Model265.4±24.9313.6±47.398.5±16.5Low-doseTG200.0±16.4*230.8±18.8*119.4±20.2Medium-doseTG150.3±22.8*?178.8±19.3*?106.0±2.7High-doseTG159.5±19.5*?82.1±21.5*?▲103.8±5.4Normal52.9±6.7*27.4±7.3*22.0±15.4

*P<0.05vsmodel;?P<0.05vslow-dose TG;▲P<0.05vsmedium-dose TG.

討 論

UC發病機制仍不明，現認為UC是免疫、遺傳、環境及腸道菌群等多因素共同作用的結果，其中免疫功能紊亂被認為是重要致病因素之一[5]。目前治療炎癥性腸病3大類藥物(氨基水楊酸類藥物、皮質類固醇、免疫抑制劑)雖然有一定效果，但均存在諸多副作用，不宜長期服用。因此，尋找一種高效，且毒副作用少、能長期用于UC患者維持緩解治療的藥物已迫在眉睫。

雷公藤多苷是從中藥雷公藤中提取出來的有效成分，具有很強抗炎，免疫調節作用,能夠抑制多種細胞因子表達，如IL-1、IL-12、TNF-α等[6]。有研究報道雷公藤多苷能夠有效抑制小鼠結腸急性炎癥反應[7]，其具體作用機制仍不清楚。

Bauer等[8]研究發現，NLRP3-/-小鼠對DSS誘導的結腸炎耐受，其機制可能與結腸組織中促炎細胞因子的產生減少有關，NLRP3炎癥性小體在炎癥疾病中有著重要作用。NLRP3炎癥性小體的激活機制目前認為與鉀離子外流、溶酶體破壞和ROS生成有關，其中ROS生成是最主要的激活機制[9]。近年來研究發現氧化應激致機體免疫功能紊亂被認為可能在UC發病機制中起重要作用，而ROS是氧化應激的分子基礎[10]。在胃腸道紊亂患者腸道定居的中性粒細胞、嗜酸細胞及巨噬細胞中NOXs能促進ROS的生成[11]。中性粒細胞是參與組織炎癥損害的主要細胞之一[12]，其在UC中的主要機制為遷移以及聚集在炎癥部位[13-14]，并釋放出炎癥因子以及大量ROS[15-16]，故推測在UC炎癥部位，NOXs能夠促進ROS生成，而中性粒細胞是其中參與的主要炎性細胞。綜上所述，UC發病機制可能通過NOXs活化產生大量ROS，激活NLRP3炎癥性小體釋放促炎因子，而雷公藤多苷抑制腸道炎癥反應是否是通過抑制NOXs-ROS-NLRP3炎癥性小體信號通路發揮作用，目前國內外未見文獻報道。

本實驗通過小鼠自由飲用5% DSS溶液成功復制了與人類UC類似的小鼠UC動物模型，運用雷公藤多苷干預，通過檢測小鼠結腸黏膜組織ROS生成水平和NOXs活性、NLRP3炎癥性小體各組成部分(NLRP3、caspase-1和ASC)在小鼠結腸黏膜組織表達水平，及受NLRP3炎癥性小體調節下游蛋白(促炎因子如IL-1α、TNF-α和抑炎因子如IL-13)表達，探討雷公藤多苷對DSS誘導小鼠UC的保護作用及可能作用機制。發現雷公藤多苷灌胃各組ROS生成水平和NOXs活性，NLRP3、ASC及caspase-1的mRNA表達水平，IL-1α及TNF-α含量雖高于正常組，但明顯低于模型組，其組織病理學評分明顯好于模型組，以上作用以高劑量組最明顯，各組抑炎因子(IL-13)表達水平無明顯變化。表明雷公藤多苷對DSS誘發UC起防治作用可能是經雷公藤多苷干預后致結腸黏膜組織ROS生成水平和NOXs的活性及NLRP3炎癥性小體各組成部分表達下調，降低促炎因子(IL-1α和TNF-α)表達來實現的，與調控抑炎因子的表達無關。為明確中性粒細胞在雷公藤多苷對DSS誘發UC發生中的作用，我們還通過體外分離結腸組織中的中性粒細胞，并檢測了以上指標，結果與體內結果一致，說明中性粒細胞是參與其保護作用的主要炎性細胞。

綜上所述，據本實驗研究結果推測雷公藤多苷對DSS誘導UC具有防治作用可能是雷公藤多苷通過抑制腸道NOXs活性及ROS生成，從而抑制NLRP3炎癥性小體的激活，最后抑制促炎因子的表達，即抑制NOXs-ROS-NLRP3炎癥性小體信號傳導通路發揮作用。后續將在本實驗的基礎上應用ROS與NOXs的抑制劑及激動劑進一步研究雷公藤多苷對NOXs-ROS-NLRP3炎癥性小體信號通路的具體作用機制，挖掘信號轉導通路中的關鍵分子及防治UC作用的最適劑量，為臨床運用雷公藤多苷治療UC提供實驗依據。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Tripterygium glycosides suppress colitis via NOXs-ROS-NLRP3 inflammatory signaling pathways

ZHENG Jian-hao1, ZHONG Ji-hong2, CAO Hai-jun1, ZHU Ling1, LIU Jun3,HU Hua-jun3, LI Shan-gao1

(1DepartmentofGastroenterology,TheFirstAffiliatedHospitalofZhejiangChineseMedicalUniversity,2DepartmentofGastroenterology,TheSecondAffiliatedHospitalofZhejiangChineseMedicalUniversity,3AcademyofLifeSciencesofJiliangUniversityofChina,Hangzhou310006,China.E-mail:galisga@aliyun.com)

AIM: To observe the effect ofTripterygiumglycosides on NOXs-ROS-NLRP3 inflammatory signaling pathways in the colon tissue in dextran sulphate sodium (DSS)-induced ulcerative colitis (UC) mice, and to investigate the underlying mechanisms. METHODS: BALB/c mice were used and the mouse model of UC was established by DSS induction. The mice were randomly divided into 5 groups (model group, low-， medium- and high-doseTripterygiumglycosides groups， and normal group). The colon tissues were collected 21 d afterTripterygiumglycosides gavage. The mRNA expression of NLRP3, ASC and caspase-1 in the colon tissues was detected by real-time PCR. The caspase-1 expression in the colorectal mucosa was observed by immunohistochemical method. ELISA was used to detect the protein le-vels of IL-1α, TNF-α and IL-13. The production of reactive oxygen species (ROS) was measured by chemiluminescence technique, and the consumption rate of NADPH, which was inhibited by DPI, was analyzed to determine the activity of NADPH oxidases (NOXs). The neutrophils were isolated, and the ROS production, NOXs activity, and the mRNA expression of NLRP3, ASC and caspase-1 were also detected. RESULTS: The colon tissues were abnormal with different degrees inTripterygiumglycosides groups, and histopathological scores were lower than that in model group. InTripterygiumglycosides groups, in addition to the mRNA expression levels of caspase-1 in the colon tissues between normal group and high-dose group, ROS production, NOXs activity and the mRNA expression levels of NLRP3, ASC and caspase-1 in the colon tissues and colon-isolated neutrophils were lower than those in model group (P<0.05), and higher than those in normal group (P<0.05). The results of pairwise comparison for the efficacy ofTripterygiumglycosides administration showed that the above indexes were statistically significant except the mRNA expression levels of caspase-1 between middle-dose group and high-dose group.Tripterygiumglycosides administration significantly decreased the expression levels of proinflammatory cytokines IL-1α and TNF-α in the homogenates of colon tissues in the model mice (P<0.05). No difference of IL-13 expression among the groups was observed. CONCLUSION:Tripterygiumglycosides inhibits NOXs-ROS-NLRP3 inflammatory signaling pathways to reduce the expression of IL-1α, TNF-α and other proinflammatory cytokines, and attenuates DSS-induced ulcerative colitis in mice, by which the neutrophils might be involved in the process.

Tripterygiumglycosides; Dextran sulphate sodium; Ulcerative colitis; Reactive oxygen species; NADPH oxidases; NLRP3 inflammasome

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2016- 02- 24

2016- 07- 18

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