KSHV RTA 通過GC/Sp1和p53順式元件上調survivin表達*

高建明， Erle S. ROBERTSON

(1三峽大學醫學院生理與病理生理學系， 湖北 宜昌 443002；2賓夕法尼亞大學醫學院微生物學系， 美國 賓夕法尼亞州 費城 19104)

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KSHV RTA 通過GC/Sp1和p53順式元件上調survivin表達*

高建明1， Erle S. ROBERTSON2△

(1三峽大學醫學院生理與病理生理學系， 湖北 宜昌 443002；2賓夕法尼亞大學醫學院微生物學系， 美國 賓夕法尼亞州 費城 19104)

目的： 定位survivin基因啟動子中參與卡波西肉瘤相關皰疹病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus，KSHV)復制轉錄激活因子(replication and transcription activator，RTA)上調survivin表達的重要元件。方法: 構建survivin基因啟動子的突變報告質粒，采用螢光素酶報告基因檢測和染色質免疫共沉淀技術，定位survivin基因啟動子區域能與 RTA相互作用的順式元件。結果: 突變GC/Sp1和p53兩個結合位點啟動子活性幾乎完全關閉，p53順式作用元件對RTA上調survivin基因啟動子活性具有協同作用。結論: KSHV RTA能夠與survivin基因啟動子中的GC/Sp1和p53順式元件相互作用，特異性地增強survivin基因啟動子活性。

卡波西肉瘤相關皰疹病毒； 復制轉錄激活因子； Survivin； GC/Sp1； p53； 啟動子活性

Survivin是哺乳動物凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis，IAP)家族中分子量最小的一個蛋白，僅由142個氨基酸組成，是迄今發現的最強凋亡抑制因子[1]。Survivin結構上含有一個桿狀病毒IAP重復序列(baculoviral IAP repeat，BIR)和一個較長的羧基端α螺旋。由于其組織分布存在特異性，并具有參與細胞凋亡及細胞有絲分裂調節雙重的重要功能[2]，逐漸為腫瘤發病機制和分子治療研究所關注[3-5]。卡波西肉瘤相關皰疹病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus， KSHV)編碼的復制轉錄激活因子(replication and transcription activator，RTA)能夠特異性地增強survivin基因啟動子活性,上調宿主細胞的survivin表達[6]。本研究旨在進一步定位survivin基因啟動子中能與RTA相互作用，在轉錄水平上調控survivin表達的核心序列，以期全面闡明KSHV RTA調控宿主細胞survivin表達的分子機制。

材 料 和 方 法

1 質粒

pcDNA-RTA編碼全長RTA的真核表達載體。pGL3-SurP為含survivin基因全長啟動子的螢光素酶報告質粒。SurPΔNkx、SurP-269/+1、 SurP-269/+1ΔGC/Sp1、SurP-269/+1Δp53、SurPΔGC/Sp1、SurPΔGC/Sp1+Δp53 和SurPΔp53為一系列包含survivin基因啟動子不同結構域的螢光素酶報告質粒[7]。以上質粒均為Robertson實驗室研究人員構建并保存。

2 抗體與細胞

RTA抗體用雜交瘤技術制備，由上海巴斯德研究所藍柯實驗室提供；GAPDH抗體為Novus Biologicals產品；HEK 293是原代人胚腎細胞轉染腺病毒DNA的永生化細胞，Saos-2是p53低表達的人骨肉瘤細胞株，BCBL1是感染KSHV的人體腔淋巴瘤細胞系。

3 方法

3.1 細胞轉染及KSHV的誘導 采用Bio-Rad公司的Gene Pulser 電穿孔儀進行細胞轉染，用20 μg/L佛波酯、1.5 mmol/L丁酸鈉誘導KSHV，未經處理的細胞作為對照組。所有細胞均在誘導后培養48 h收集。

3.2 螢光素酶報告基因實驗 107個HEK 293細胞、Saos-2細胞共轉染10 μg全長或突變的啟動子螢光素酶報告質粒和10 μg RTA表達質粒。轉染后24 h收獲細胞，制備細胞裂解液。向40 μL細胞裂解液中加入25 μL螢光素酶實驗底物，使用LMax II 384熒光光度計(Molecular Devices)檢測熒光水平。結果以3次實驗值的均數與標準差表示。用Western blot 實驗驗證轉染的蛋白質表達。

3.3 Western blot 實驗 細胞收集后加入RIPA 緩沖液裂解，用Bradford 比色法測定蛋白質濃度。取相同質量的細胞裂解液上樣，聚丙烯胺凝膠電泳結束后，轉移蛋白樣品至PVDF膜，分別用RTA抗體、GAPDH抗體及耦聯IR Dye 800的羊抗鼠IgG抗體進行免疫印跡。用Odyssey紅外線成像系統(LI-COR)觀察結果。

3.4 染色質免疫共沉淀(chromatin Immunoprecipitation，ChIP)實驗 BCBL1細胞于佛波酯誘導48 h后向培養液中加入甲醛，終濃度為1%，37 ℃ 固定細胞10 min，使蛋白質和DNA 發生交聯。加入甘氨酸使其終濃度為0.125 mol/L，在室溫晃動孵育5 min以終止交聯反應。使用預冷的PBS清洗細胞2次，加入含1% SDS的裂解液裂解細胞，超聲裂解細胞懸液將DNA均一地打斷成500～1 000 bp的片段。用ChIP 稀釋緩沖液將超聲剪切后的DNA稀釋10倍，取20 μL 稀釋液保存，這時的樣品標記為INPUT，作為PCR的空白對照。其余稀釋液加入蛋白A 瓊脂糖磁珠，4 ℃ 孵育2 h，分為2組，一組加入RTA抗體，4 ℃振蕩過夜，另一組加入鼠IgG抗體作為陰性對照。將免疫復合物用磁珠沉淀，將沉淀物分別經低鹽、高鹽和氯化鋰溶液3次系列沖洗，然后用TE 緩沖液洗2 次，每次沖洗5 min。用新配制的洗脫緩沖液將蛋白/DNA 復合物從磁珠上洗脫，加氯化鈉(Na+濃度為200 mmol/L)與2 μL RNaseA(0.5 g/L)，65 ℃過夜，松解蛋白/DNA 交聯；加入5 μL蛋白酶K(20 g/L)，于 55 ℃水浴2 h。用酚/氯仿抽提DNA。以回收的DNA 片段為模板，進行PCR 反應，DNA的數量水平可通過定量PCR來檢測，引物序列為5’-CGTTCTTTGAAAGCAGTCGAG-3’和5’-TCAAATCTGGCGGTTAATGG-3’，擴增產物覆蓋GC/Sp1與p53區域，片段長度為200 bp。同時做RT-qPCR，用2-ΔΔCt值的方法對DNA豐度進行相對定量。

4 統計學分析

采用 SPSS 16.0 軟件的t檢驗進行統計學分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 GC/Sp1和p53結合位點對RTA 上調survivin啟動子活性具有重要作用

野生型survivin基因啟動子全長為649 bp。用在線軟件(http://motif.genome.jp/)分析其轉錄因子結合區域，結果發現survivin基因啟動子含有4個主要轉錄因子結合位點，從起動子上游向起始密碼子處依次為Sp1、NKx2.5、GC/Sp1和p53。野生型和突變型survivin基因啟動子報告質粒的構建示意圖如圖1所示[7]。

用RTA質粒、野生型和突變型survivin基因啟動子報告質粒分別轉染HEK 293細胞進行螢光素酶報告基因檢測。結果顯示突變NKx2.5導致RTA激活survivin啟動子活性輕度增強，RTA激活的野生型survivin啟動子活性是未有RTA轉染時的基底活性的3倍，而RTA介導的突變報告質粒SurPΔNkx活性是野生型survivin啟動子基底活性的3.5倍；突變Sp1和NKx2.5元件(SurP-269/+1)對啟動子活性沒有明顯影響，因此Sp1和NKx2.5元件對RTA介導的survivin啟動子活性并不重要。然而，突變GC/Sp1結合位點(SurP-269/+1ΔGC/Sp1和SurPΔGC/Sp1)導致啟動子活性顯著降低(P<0.05)；突變p53時，在RTA表達時突變報告質粒SurP-269/+1Δp53和SurPΔp53的活性只有野生型survivin啟動子活性的1/4(P<0.05)；當GC/Sp1和p53兩個結合位點均突變后啟動子活性幾乎完全關閉(P<0.05)。上述結果證實GC/Sp1和p53結合位點對RTA 上調survivin啟動子活性不可或缺，具有重要作用，見圖2A。

Figure 1.Schematic showing of the wild-type and mutant survivin promoters[7].

圖1 野生型和突變型survivin啟動子結構示意圖

2 p53 順式作用元件對RTA介導的survivin表達上調具有協同作用

為闡明p53順式作用元件對RTA介導的survivin表達上調具有何種作用，我們應用p53低表達的Saos-2細胞做了螢光素酶報告基因檢測。突變p53結合位點導致survivin基因啟動子活性相比野生型全長啟動子的活性降低一半(P<0.05)。然而，一旦突變在p53結合位點上游52 bp的GC/Sp1元件，啟動子活性會顯著降低(P<0.05)；如果將GC/Sp1 和 p53 兩個結合位點一起突變，與轉染了RTA質粒的Saos-2細胞野生型survivin基因啟動子活性相比，啟動子活性急劇降低，幾乎完全關閉(P<0.05)。螢光素酶報告基因檢測表明Saos-2細胞弱表達的p53蛋白與survivin基因啟動子序列中的順式作用元件結合后，能夠與RTA-GC/Sp1復合物協同作用，在轉錄水平上調survivin表達，見圖2B。

Figure 2.RTA activated the expression of survivin through interacting with GC/Sp1 and p53 cis elements. Reporter assay for the wild type and mutant survivin promoters in 293 (A) and p53 null Saos-2 cells (B). Western blot showed the expression of RTA in the cotransfected cells and GAPDH was used as control.*P<0.05vs-RTA.

圖2 RTA通過GC/Sp1和p53順式元件上調survivin的表達。

3 ChIP實驗證實RTA蛋白與GC/Sp1和p53結合位點存在直接相互作用

用佛波酯、丁酸鈉誘導的BCBL1細胞進行免疫共沉淀試驗，結果表明了RTA蛋白與GC/Sp1和p53結合位點存在直接相互作用。PCR擴增證實免疫復合物中存在跨越GC/Sp1和p53結合位點的DNA片段。經誘導細胞的核DNA組經RTA抗體沉淀后可見清晰的目的片段，未經誘導細胞的核DNA組經RTA抗體沉淀后無陽性信號，2個IgG抗體陰性對照組亦均無目的片段。RT-qPCR用來相對定量沉淀下來的DNA的豐度，RTA抗體沉淀下來的經誘導BCBL1細胞的核DNA量比對照組高25倍,見圖3。

討 論

RTA是促使KSHV從潛伏性感染向裂解性感染轉變的關鍵調控因子[8]。病毒的反復感染或者建立潛伏感染/再激活，使宿主細胞的DNA損害不斷累積，繼而發生遺傳不穩定、細胞永生化、腫瘤等一系列效應[9]。近年來的研究揭示，survivin屬于凋亡抑制蛋白家族，與細胞分裂、凋亡、應激和基因組完整性的檢測點機制調控密切相關[10]。我們的前期研究已提示RTA能夠增強survivin基因啟動子的活性，進而上調宿主細胞的survivin表達[6]。

Figure 3.RTA protein interacted with the GC/Sp1 and p53 binding sites. The DNA fragments covering the GC/Sp1 and p53 binding sites were detected within the RTA antibody/DNA comlex by PCR (A). Real-time PCR was used to relatively quantitate the precipitated DNA (B). UN: the cells were not induced with TPA and sodium butyrate; IN: the cells were induced with TPA and sodium butyrate.

圖3 RTA蛋白與GC/Sp1和p53結合位點存在直接相互作用

既往有文獻報道survivin基因啟動子區域存在Sp1、類Sp1和p53等轉錄因子的結合位點[11]，因此Sp1和p53很可能在RTA介導的survivin表達上調機制中發揮重要的作用。本研究發現survivin基因啟動子區域的GC/Sp1和p53順式元件對RTA上調survivin啟動子活性具有重要作用，并且染色質免疫共沉淀實驗結果證實了RTA與GC/Sp1和p53順式元件之間存在直接相互作用。

既往研究報道KSHV潛伏相關核抗原(latency-associated nuclear antigen, LANA)通過GC/Sp1和p53元件上調survivin表達，并促進細胞增殖[7]。本研究提示RTA通過相同機制下調細胞凋亡，這與在病毒轉向裂解性感染過程后細胞凋亡、病毒子釋放并不相悖。事實上LANA 與RTA在調控病毒生活周期上存在互相的反饋性調節機制[12]。RTA介導的survivin表達上調可以延緩進入裂解性復制期的宿主細胞的凋亡，理論上應導致宿主細胞在裂解性復制過程中會釋放出更多的病毒子，促進病毒傳播。少部分宿主細胞經歷潛伏感染/再激活后得以存活，但DNA損害不斷累積。后續的研究將圍繞KSHV RTA介導的survivin表達上調在宿主細胞增殖與凋亡、病毒子的產生、病毒宿主細胞相互作用等方面的生物學意義而展開。

[1] 李璐蓉，黃曉丹，季國忠.Survivin 在肝癌中的臨床應用研究進展[J].醫學綜述，2015，21(14):2549-2552.

[2] Altieri DC. Survivin and IAP proteins in cell-death mechanisms[J]. Biochem J, 2010, 430(2):199-205.

[3] Li G, Chang H, Zhai YP, et al. Targeted silencing of inhibitors of apoptosis proteins with siRNAs: a potential anti-cancer strategy for hepatocellular carcinoma[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2013, 14(9):4943-4952.

[4] Shen H, Shao HW, Chen XH, et al. Identification of a novel HLA-A2-restricted mutated Survivin epitope and induction of specific anti-HCC CTLs that could effectively cross-recognize wild-type survivin antigen[J]. Cancer Immunol Immunother, 2013, 62(2):393-403.

[5] Ryan BM, O’Donovan N, Duffy MJ. Survivin: a new target for anti-cancer therapy[J]. Cancer Treat Rev, 2009, 35(7):553-562.

[6] 高建明, Robertson ES. 卡潑氏肉瘤病毒復制轉錄激活因子上調宿主細胞survivin表達的機制[J]. 湖北民族學院學報:醫學版, 2015, 32(3)：1-3.

[7] Lu J, Verma SC, Murakami M, et al. Latency-associated nuclear antigen of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) upregulates survivin expression in KSHV-associated B-lymphoma cells and contributes to their proliferation[J]. J Virol, 2009, 83(14): 7129-7141.

[8] Lan K, Kuppers DA, Verma SC, et al. Induction of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus latency-associated nuclear antigen by the lytic transactivator RTA: a novel mechanism for establishment of latency[J]. J Virol, 2005, 79(12): 7453-7465.

[9] Avanzi S, Alvisi G, Ripalti A. How virus persistence can initiate the tumorigenesis process [J]. World J Virol, 2013, 2(2):102-109.

[10]Ai ZH, Yin L, Zhou X, et al. Inhibition of survivin reduces cell proliferation and induces apoptosis in human endometrial cancer[J]. Cancer, 2006, 107(4):746-756.

[11]Esteve PO, Chin HG, Pradhan S. Molecular mechanisms of transactivation and doxorubicin-mediated repression of survivin gene in cancer cells[J]. J Biol Chem, 2007, 282(4):2615-2625.

[12]Jin Y, He Z, Liang D, et al. Carboxyl-terminal amino acids 1052 to 1082 of the latency-associated nuclear antigen (LANA) interact with RBP-Jκ and are responsible for LANA-mediated RTA repression[J]. J Virol, 2012, 86(9):4956-4969.

(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)

KSHV RTA upregulates expression of survivin through interacting with GC/Sp1 and p53 cis-acting elements

GAO Jian-ming1, Erle S. ROBERTSON2

(1DepartmentofPhysiologyandPathophysiology,ThreeGorgesUniversitySchoolofMedicine,Yichang443002,China;2DepartmentofMicrobiology,UniversityofPennsylvaniaSchoolofMedicine,Philadelphia,Pennsylvania19104,USA.E-mail:erle@mail.med.upenn.edu)

AIM: To identify the potential elements within the survivin promoter indispensable for the upregulation of survivin by Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus encoded replication and transcription activator (KSHV RTA). METHODS: A series of truncated survivin promoter luciferase constructs were generated. Reporter assay and chromatin immunoprecipitation were performed to detect the interaction between RTA and the importantcis-acting elements. RESULTS: Deletion of the GC/Sp1 and p53 binding sites within the survivin promoter almost completely shut down the survivin promoter activity and the p53cis-acting element synergistically contributes to survivin promoter activation by RTA. CONCLUSION: KSHV RTA interacts with the GC/Sp1 and p53cis-acting elements and regulates the expression of cellular survivin by specifically increasing the activity of survivin promoter.

Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus; Replication and transcription activator; Survivin; GC/Sp1; p53; Promoter activity

雜志網址： http://www.cjpp.net

1000- 4718(2016)09- 1666- 04

2016- 04- 06

2016- 05- 25

National Cancer Institute 5R01CA091792-08, 5R01CA108461-05, 1R01CA137894-01 and 1R01CA138434-01A209; National Institute of Allergy and Infectious Diseases 5R01AI067037-04；National Institute of Dental and Craniofacial Research 5R01DE017338-03 (to ESR)

△ 通訊作者 Tel: (215)746-0114； E-mail: erle@mail.med.upenn.edu

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10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.09.022