間充質干細胞條件培養基治療肝氧化應激損傷中部分miRNA的變化*

徐雪晶， 李 棟， 李 雪， 鞠秀麗△

(1山東大學深圳研究院，廣東 深圳 518057； 2山東大學齊魯醫院兒科，山東 濟南 250012)

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間充質干細胞條件培養基治療肝氧化應激損傷中部分miRNA的變化*

徐雪晶1， 李 棟2， 李 雪2， 鞠秀麗2△

(1山東大學深圳研究院，廣東 深圳 518057；2山東大學齊魯醫院兒科，山東 濟南 250012)

目的： 研究采用人臍帶間充質干細胞條件培養基(MSC-CM)治療肝細胞氧化應激損傷中微小RNA(miRNA)的差異性表達并探討其調控機制。方法: 制備人正常肝細胞株L02氧化應激損傷模型，體外分離培養健康人臍帶間充質干細胞并制備MSC-CM。損傷模型經MSC-CM治療，用凋亡、細胞活力、細胞周期及線粒體膜電位等實驗驗證其治療效果。定量RT-qPCR篩選差異性表達miRNA。應用生物信息學預測其靶蛋白后使用Western blot實驗驗證。結果：MSC-CM 治療可以顯著減少H2O2氧化應激損傷所致的細胞凋亡比率，增加細胞活力，調節細胞周期。經RT-qPCR篩選出顯著差異表達的miR-143、miR-145、miR-301a與let-7a，均在損傷后表達升高，而在MSC-CM作用后表達降低。Western blot實驗結果顯示miR-143的預測靶蛋白HK2和ADRB1的表達在肝細胞損傷后降低，MSC-CM作用后升高，與miR-143調控趨勢一致。結論：MSC-CM治療可能通過調節相關miRNA及其靶蛋白逆轉H2O2所致肝細胞氧化應激損傷。

肝細胞； 氧化應激損傷； 間充質干細胞； 微小RNA

肝細胞氧化應激損傷是肝臟疾病中常見的病理生理過程，常規治療手段為藥物干預，療效欠佳，如何預防和修復肝細胞氧化應激損傷是亟需解決的問題。間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)為肝細胞氧化應激損傷的防治提供了一個新的治療策略。MSC的作用機制與其旁分泌某些化學物質密切相關，如HGF、 IGF-1、 EGF、VEGF、 bFGF與TGF-β等。研究證實MSC通過改變微小RNA(microRNA, miRNA)的表達進而參與氧化應激損傷細胞的修復[1-2]。miRNA與氧化應激損傷修復的發生、發展、臨床表現和預后有密切聯系[3]。基于本實驗室前期[4]就MSC對肝硬化大鼠治療機制所行miRNA微陣列基因芯片的雜交分析結果篩選了21種顯著差異性表達的miRNA，用RT-qPCR驗證并篩選出高敏感性高特異性、差異表達顯著的4種miRNA(miR-143、miR-145、miR-301a與let-7a)。本文研究了間充質干細胞條件培養基(mesenchymal stem cell-conditioned medium，MSC-CM)在修復肝細胞氧化應激損傷過程中，miR-143、miR-145、miR-301a與let-7a及其潛在靶基因表達的變化，并探討了miRNA在肝臟氧化應激損傷中可能的調控機制。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

αMEM培養基、1640培養基均購自HyClone；胎牛血清為Gibco產品；凋亡檢測Annexin V/碘化丙啶(propidium iodide，PI)試劑盒、線粒體膜電位JC-1檢測試劑盒購自BD；CCK-8檢測試劑盒購自Dojindo；細胞周期測定PI檢測試劑盒購自康為公司；miRNA提取試劑盒、miRNA逆轉錄試劑盒和SYBR Green熒光定量試劑盒購自北京天根生化科技公司，其中21種miRNA引物和內參U6由該公司合成；抗人GAPDH、HK2、DAB2、NR2C2、ESR2、Bax和Bcl-2的抗體與 II 抗購自Proteintech；抗人ADRB1和BMF的抗體購自Abcam。

2 主要方法

2.1 臍帶MSC的分離、培養與條件培養基的制備 足月正常分娩的臍帶取自山東大學齊魯醫院婦產科(產婦均知情同意)。臍帶MSC的分離、培養、鑒定[4]與條件培養基的制備參見本實驗室已發表的論文[5]。

2.2 肝細胞氧化應激損傷模型的制備與實驗分組 人正常肝細胞株L02(山東大學齊魯醫院低溫醫學實驗室保存)經1 mmol/L H2O2作用3 h建立氧化應激損傷細胞模型[5]，換置20% MSC-CM繼續培養6 h、24 h和48 h[5]。實驗分為對照組(control)、H2O2組和H2O2+ MSC-CM組。利用酶標儀測定450 nm處吸光度(A)值，計算MSC-CM作用后各個時點對受氧化應激損傷肝細胞的細胞活力的影響，選擇合適的時點用于后續實驗。H2O2與H2O2+ MSC-CM組參考本實驗室前期研究[5]，為保證結果的準確性，所有實驗重復5次以上。

2.3 凋亡的定量測定 收集3組細胞，預冷無菌PBS沖洗，1 000 ×g離心5 min，計數并用1×binding buffer調整細胞密度為1 × 109/L，取100 μL，加入5 μL Annexin V、5 μL PI，混勻，室溫避光孵育15 min，加200 μL 1×binding buffer混勻，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡比例。

2.4 細胞周期的測定 收集105～106個細胞，預冷PBS沖洗2遍，95%乙醇固定過夜，1 000×g離心5 min，棄上清，用PBS沖洗2遍后加入400 μL PI染色液，37 ℃避光溫浴30 min。流式細胞術檢測細胞周期分布情況，應用Incyte軟件分析數據。

2.5 線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)的測定 收集105～106個細胞，PBS沖洗2遍,加入500 μL JC-1工作液，37 ℃避光孵育15 min，1 000×g離心5 min，加入1×assay buffer 2 mL洗滌2次，離心棄上清，加入500 μL 1×assay buffer 重懸，使用流式細胞儀檢測細胞去極化比例。

細胞凋亡、周期與MMP測定均采用Guava EasyCyte 8HT流式細胞儀(Millipore)與Guava Incyte V 2.6(Millipore)軟件分析。2.6 細胞活力的測定 取對數生長期的L02細胞以每孔5 × 103細胞接種于96孔板，1 mmol/L H2O2作用3 h后，加入MSC-CM 作用24 h(根據CCK-8實驗結果選取)，每孔(設置3個復孔)分別加10 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育2 h。酶標儀測定各實驗組肝細胞在波長為450 nm 處的A值，利用各時刻生長抑制率研究MSC-CM對肝細胞氧化應激損傷的修復程度。

2.7 miRNA的提取和RT-qPCR 富集miRNA提取按miRNA提取試劑盒說明書操作。基于本實驗室前期MSC對肝硬化大鼠模型拯救機制的miRNA微陣列基因芯片雜交分析結果篩選了21種顯著差異性表達的miRNA，用RT-qPCR驗證篩選高敏感性高特異性的miRNA。0.25 μg的富集miRNA加入20 μL miRNA逆轉錄體系[采用miRNA 3’ 末端加多聚A尾ploy(A)，使用Oligo(dT)-universal tag通用逆轉錄引物進行逆轉錄反應，最終生成miRNA對應的cDNA第一鏈]。cDNA在ABI 7500熒光定量PCR儀上進行SYBR Green熒光定量PCR檢測(試劑盒提供通用下游引物)。引物設計參考miRBase。實驗設3個復孔，軟件分析其Ct值，以U6作為內參照，由公式2-ΔΔCt計算miRNA在氧化應激損傷與MSC-CM拯救過程中的相對表達量。

2.8 miRNA靶基因的生物信息學預測 采用miRBase(http://www.mirbase.org/)、 TargetScan(http://www.targetscan.org/)和 PubMed(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)3個在線分析軟件預測miRNA的靶基因。

2.9 Western blot法驗證靶基因與凋亡相關蛋白的表達 收集3組L02細胞，提取總蛋白，根據內參照GAPDH定量結果對各蛋白樣本上樣量校正定量。通過SDS-PAGE進行檢測。本操作對MSC-CM逆轉肝細胞氧化應激損傷過程中定量驗證miRNA下游靶基因和凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、 BMF的變化，所有實驗重復5次以上。

3 統計學處理

采用SPSS 20.0統計學軟件分析，計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示。組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Tukey檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。數據制圖采用Graphpad Prism6軟件。

結 果

1 MSC-CM對肝細胞氧化應激損傷致凋亡的影響

1.1 Annexin V/PI雙染實驗結果 對照組、H2O2組和H2O2+ MSC-CM組的凋亡率分別為11.04%±0.48%、31.60%±1.07%和15.58%±0.55%；活細胞比例分別為82.87%±3.01%、65.69%±2.91%和82.00%±3.11%；與H2O2組相比， MSC-CM能減少H2O2誘導的細胞凋亡，增加活細胞比例，上述差異有統計學顯著性(P<0.05)，見圖1A。

Figure 1.MSC-CM reduced the apoptosis of L02 cells with oxidative stress injury. A: typical protective effect of MSC-CM on the apoptosis of L02 cells induced by H2O2examined by Annexin V/PI double staining and flow cytometryic analysis; B: MSC-CM protected L02 cells from MMP depolarization observed by JC-1 staining and flow cytometryic analysis. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH2O2group.

圖1 MSC-CM逆轉肝細胞氧化應激損傷所致的細胞凋亡

1.2 肝細胞MMP的變化 JC-1染色示去極化的細胞比例對照組為2.60%±0.12%，H2O2組為20.20%±0.93%，H2O2+ MSC-CM組為5.06%±0.21%。H2O2+ MSC-CM組早期凋亡的比例顯著低于H2O2組，上述差異有統計學顯著性(P<0.05)，見圖1B。

1.3 肝細胞凋亡相關蛋白的變化 Western blot實驗結果表明，Bcl-2在H2O2處理L02細胞后蛋白表達下調，Bax和BMF蛋白表達上調；MSC-CM作用后，Bcl-2蛋白表達增加，Bax和BMF蛋白表達下降，差異具有統計學顯著性(P<0.05),見圖2。

Figure 2.The expression levels of apoptosis-related proteins in the L02 cells detected by Western blot. In H2O2- treated L02 cells, the expression level of Bax and BMF proteins increased, while the expression level of Bcl-2 decreased. In MSC-CM-treated L02 cells, the expression levels of BAX and BMF proteins decreased, while the expression level of Bcl-2 increased. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH2O2group.

圖2 MSC-CM逆轉肝細胞氧化應激損傷中凋亡相關蛋白的表達

2 細胞周期和細胞毒性的檢測結果

CCK-8實驗結果顯示氧化應激損傷降低細胞活力，MSC-CM 作用6 h、24 h和48 h后，細胞活力明顯上升，上述差異均具有統計學顯著性(P<0.05)，見圖3。與對照組相比，H2O2組G1期的細胞比例降低，S+G2期升高，而H2O2+ MSC-CM組的上述變化發生逆轉(P<0.05)，見圖4。

Figure 3.MSC-CM regulated the viability of L02 cells under the condition of oxidative stress injury. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH2O2group.

圖3 MSC-CM通過提高細胞活性參與氧化應激損傷的肝細胞的修復

3 在H2O2氧化應激損傷與MSC-CM處理過程中miRNA的變化，RT-qPCR的驗證與miRNA靶基因的預測

經miRNA微陣列基因芯片分析和 RT-qPCR分析，篩選4種在氧化應激損傷與MSC-CM作用過程中高敏感性、高特異性、有顯著差異性表達的miRNA(miR-143、miR-145、miR-301a與let-7a)。上述miRNA在細胞氧化損傷后升高，MSC-CM作用后降低(圖5)。生物信息學軟件預測miR-143的靶基因為己糖激酶2(hexokinase 2，HK2)和β1-腎上腺素受體(β1-adrenoreceptor，ADRB1)，miR-145的靶基因為Disabled homolog 2 (DAB2)，miR-301a的靶基因為nuclear receptor subfamily 2 group C member 2(NR2C2)，let-7a的靶基因為雌激素受體2(estrogen receptor 2，ESR2)。

4 H2O2氧化應激損傷與MSC-CM處理后肝細胞靶蛋白的變化

Western blot實驗檢測結果表明，H2O2處理L02細胞后，HK2、ADRB1、DAB2、NR2C2與ESR2的蛋白表達下調；而MSC-CM作用后，上述蛋白表達均增加，差異具有統計學顯著性(P<0.05)，見圖6。

Figure 4.MSC-CM regulated cell cycle of the L02 cells with oxidative stress injury. Mean±SD.n=8.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH2O2group.

圖4 MSC-CM通過調節細胞周期參與氧化應激損傷肝細胞的修復

Figure 5.The effects of MSC-CM on the differential expression of miRNAs in the L02 cells with H2O2- induced oxidative stress injury as validated by RT-qPCR. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH2O2group.

圖5 RT-qPCR驗證miRNA在氧化應激損傷與MSC-CM處理過程中的差異性表達

討 論

間充質干細胞的應用為氧化應激損傷提供了新的治療策略。MSC通過分泌多種生長因子、細胞因子及其趨化因子調節細胞和組織活性進而參與氧化應激損傷的修復[6-9]。研究證實MSC-CM通過調節miRNA參與H2O2所致的肝細胞氧化應激損傷的修復。miRNA是一類由內源基因編碼的約22 nt大小非編碼RNA分子, 通過與靶基因mRNA的結合調控其它基因mRNA和蛋白的表達, 參與細胞代謝[10]。本研究發現在氧化應激損傷與MSC-CM修復進程中，miR-143、miR-145、miR-301a與let-7a均呈損傷后升高，MSC-CM作用后降低，差異性表達顯著。

miR-143在腫瘤中低表達，研究證實其通過調節靶基因KRAS、c-MYC和EBK5等，抑制細胞增殖， 促進細胞凋亡。HK2是糖酵解途徑的第一個限速酶，催化己糖磷酸化，HK2還可拮抗線粒體途徑的細胞凋亡。在供氧充足條件下，肝癌細胞比正常肝細胞糖酵解代謝活躍，糖酵解明顯增強， 即有氧糖酵解[11]。本研究發現，miR-143可能通過HK2調節氧化應激損傷過程中的細胞代謝，即經H2O2誘導，相關代謝酶活性降低，細胞代謝降低，在供氧充足條件下加入MSC-CM，因富含細胞活性因子[5-8]，發生類似腫瘤細胞的有氧糖酵解，促進代謝與氧化應激損傷的修復。β1-腎上腺素受體通過活化蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)，增強鈣調蛋白激酶 II(calmodulin kinase II，CaMKII)和核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)的表達，增強caspase-8/9的活性，促進脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)所致細胞凋亡；ADRB1也可通過調節TNF-α和IL-6的表達，影響細胞炎癥的進展[12]。本研究中ADRB1損傷后表達降低，可能與機體自身調節抑制細胞凋亡有關；ADRB1在多巴酚丁胺停用期間抑制骨細胞凋亡[13]，本實驗中MSC-CM作用后ADRB1表達輕度上升，可能與細胞微環境相關，機制仍需深入探討。

Figure 6.The expression of miRNA target proteins in H2O2- and/or MSC-CM-treated L02 cells detected by Western blot analysis.Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH2O2group.

圖6 miRNA在氧化應激損傷與MSC-CM處理過程中相關靶蛋白的變化

NR2C2又稱睪丸孤核受體4(testicular orphan nuclear receptor 4，TR4)，編碼核激素受體家族蛋白，該家族成員參與細胞代謝、分化與體內穩態的調節。Li等[14]指出TR4 作為FOX3a下游途徑調節因子參與氧化應激損傷進程。研究指出TR4通過調節轉錄偶聯核苷酸切除修復(transcription-coupled nucleotide excision repair，TC-NER)DNA修復途徑保護細胞免受電離輻射所致的氧化應激損傷[15]。Kim等[16]提出TR4 通過調節Bcl-2的表達調控凋亡。本研究發現氧化應激損傷中NR2C2表達降低，MSC-CM作用后表達升高，升高的NR2C2可能通過調節凋亡相關蛋白及其DNA損傷的修復對抗細胞氧化應激損傷。DAB2通過綁定生長因子受體結合蛋白2競爭性結合SOS進而調節生長因子/Ras途徑。DAB2參與Wnt 信號通路[17]和促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路[18]。本研究發現H2O2損傷后DAB2表達降低，MSC-CM作用后表達升高。在氧化應激損傷與修復中miR145通過調節DAB2參與上述進程。ESR2編碼雌激素受體家族蛋白和核受體超家族轉錄因子。Kabir等[19]證實ESR通過MEK/ERK/GSK-3β通路誘導缺血/再灌注損傷心肌細胞的修復。本研究經MSC-CM作用后，ESR2的表達顯著上升，MSC-CM可能通過上調的ESR2增強氧化應激損傷肝細胞的自我修復。

綜上所述，MSC-CM可能通過調節凋亡、周期與相關miRNA等參與肝細胞氧化應激損傷的修復。miR-143通過調控預測靶蛋白HK2、ADRB1，調節糖酵解與炎癥因子的活性，參與肝細胞氧化應激損傷的修復。此外，miR-145、miR-301a和let-7a通過調控預測靶蛋白DAB2、NR2C2和ESR2調節FOX3a途徑、DNA修復、Wnt信號通路和MAPK等信號通路構建一個復雜的調控網絡來調控細胞氧化應激損傷的修復。參與調控網絡的其它環節與具體調控機制仍需后續深入研究。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

MicroRNA expression in hepatocytes with hydrogen peroxide-induced oxidative stress-injury and alleviating effect of mesenchymal stem cell-conditioned medium

XU Xue-jing1, LI Dong2, LI Xue2, JU Xiu-Li2

(1ShenzhenResearchInstituteofShandongUniversity,Shenzhen518057,China;2DepartmentofPediatrics,QiluHospital,ShandongUniversity,Jinan250012,China.E-mail:shellysdcn@hotmail.com)

AIM: To evaluate the changes of microRNA (miRNA) in hepatocytes during hydrogen peroxide-induced oxidative stress injury, and to observe the alleviating effect of mesenchymal stem cell-conditioned medium (MSC-CM) in this progress. METHODS: The hepatocyte oxidative stress injury model was established using hydrogen peroxide and human normal liver cell line L02. MSC-CM was prepared using centrifugation and filter. The effects of MSC-CM on hepatocyte injury were evaluated by apoptosis analysis, cell viability detection, cell cycle, and mitochondrial membrane potential (MMP). Twenty-one differentially expressed miRNAs were selected by gene chip hybridization, in which miR-143, miR-145, miR-301a and let-7a were confirmed by RT-qPCR. Bioinformatics software was utilized to predict target proteins of these miRNAs, and then the proteins were verified by Western blot.RESULTS: MSC-CM markedly attenuated hydrogen peroxide-induced oxidative stress injury by reducing apoptosis, promoting cell viability and regulating cell cycle. The expression of miR-143, miR-145， miR-301a and let-7a, indentified by RT-qPCR, increased under the condition of oxidative stress injury, while decreased after MSC-CM treatment. The expression of miR-143 predicted target proteins, HK2 and ADRB1, decreased under the hydrogen peroxide-exposure, while increased after MSC-CM treatment, which is consistent with the regulatory trend of miR-143. CONCLUSION: MSC-CM might attenuate hydrogen peroxide induced oxidative stress injury via inhibiting apoptosis and regulating some miRNA expression.

Hepatocyte; Oxidative stress injury; Mesenchymal stem cells; MicroRNA

雜志網址： http://www.cjpp.net

1000- 4718(2016)09- 1670- 07

2016- 04- 25

2016- 06- 27

深圳市科技研發基金知識創新計劃(No.JCYJ20140418115449178);山東省科技發展計劃(No.2014GSF118131&2013GSF11812);山東大學基本科研業務費資助項目(No.2014QLKY02&2014QY003-11)

△通訊作者 Tel: 0531-82169214; E-mail: shellysdcn@hotmail.com

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.09.023