重組人內皮抑素通過激活Dll4/Notch通路抑制大鼠動脈粥樣硬化斑塊內血管新生*

蔡宏文， 朱 敏， 周鑫斌， 繆 靜， 邱原剛， 毛 威

(浙江中醫藥大學附屬第一醫院心內科，浙江 杭州 310006)

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重組人內皮抑素通過激活Dll4/Notch通路抑制大鼠動脈粥樣硬化斑塊內血管新生*

蔡宏文， 朱 敏， 周鑫斌， 繆 靜， 邱原剛， 毛 威△

(浙江中醫藥大學附屬第一醫院心內科，浙江 杭州 310006)

目的： 觀察重組人內皮抑素(rhES)對大鼠動脈粥樣硬化(AS)斑塊內新生血管的抑制作用，探討Dll4/Notch信號通路在其中的調控機制。方法:雄性Wistar大鼠隨機分為正常對照組(N組)、AS組和AS+rhES組，每組10只。N組始終喂基礎飼料，其余2組采用高脂喂養、維生素D3負荷及球囊損傷動脈內膜建立大鼠AS模型。AS+rhES組以10 mg·kg-1·d-1的rhES腹腔注射4周，另2組注射等量生理鹽水。采血檢測各組的總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、C反應蛋白(CRP)、白細胞介素-1(IL-1)和肌鈣蛋白I(TnI)等；免疫組化CD31染色觀察新生血管密度；Western blot法檢測主動脈內Dll4、Notch1蛋白表達。結果:與N組比較，AS組和AS+rhES組的TC、TG、LDL-C、CRP和L-1水平均顯著升高(P<0.05)，但上述指標在AS組和AS+rhES組之間差異無統計學顯著性。CD31染色結果顯示，AS組的新生血管表達最豐富；與AS組比較，AS+rhES組的新生血管密度顯著下降(P<0.05)。AS組的Dll4和Notch1蛋白水平顯著低于N組(P<0.05)；相比AS組，AS+rhES組的Dll4和Notch1蛋白水平顯著升高(P<0.05)。結論: rhES能夠抑制大鼠AS斑塊內血管新生，Dll4/Notch通路的激活可能是rhES抑制斑塊內的血管新生的信號機制。

重組人內皮抑素； 動脈粥樣硬化； Dll4/Notch通路； 新生血管

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是冠心病病理基礎，結構不同的AS斑塊有著不同的穩定性，穩定性低的斑塊易發生破裂繼發急性血栓形成，這是導致冠心病死亡的主要原因。因此，如何穩定AS斑塊，預防斑塊破裂是近年來冠心病防治研究關注的重點。近年發現，斑塊內新生血管是不穩定斑塊形成的關鍵，抑制斑塊內血管新生已成為防治AS的一個新方向[1-2]。重組人內皮抑素(recombinant human endostatin，rhES)是特異性的病理性新生血管抑制劑，前期工作中，我們發現rhES可有效抑制AS斑塊內新生微血管形成，能穩定并消退AS斑塊，但rhES上述作用的具體信號機制尚不清楚[3-4]。已知Dll4/Notch信號通路是調控體內多種病理性血管新生的重要通路[5]。但Dll4/Notch通路是否參與調控AS斑塊內血管新生這一過程尚無研究報道，對其進一步研究有望揭示AS新的治療靶點。因此，本實驗將探討Dll4/Notch通路在rhES抑制AS斑塊內血管新生過程中的調控機制。

材 料 和 方 法

1 動物

清潔級雄性Wistar大鼠30只，8周齡，體重150～180 g，由浙江中醫藥大學動物實驗中心統一代購，并飼養于該中心。動物合格證為SYXK(浙)2013-0184。

2 藥物、試劑和儀器

rhES由山東先聲麥得津制藥有限公司提供。高脂飼料配方：3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、5%干絡素、10%蛋黃粉、8%全脂奶粉、10%豬油、63.5%基礎飼料，由浙江中醫藥大學動物實驗中心提供。維生素D3注射液購自上海通用藥業股份有限公司。大鼠C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)、白細胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、肌鈣蛋白I(troponin I，TnI)ELISA試劑盒購自上海源葉生物科技有限公司。Anti-Dll4 antibody、anti-Notch1 antibody、anti-β-actin antibody均購自杭州誠維生物科技有限公司。酶聯免疫檢測儀(Bio-Tek)；垂直電泳儀及轉膜裝置(Bio-Rad)。

3 方法

3.1 分組、造模和給藥方法 Wistar大鼠30只，隨機分為3組，每組10只，分別為正常對照(normal control,N)組、AS組和AS+rhES組。N組始終喂基礎飼料，其余2組始終喂高脂飼料。AS和AS+rhES組于喂養開始時1次性腹腔注射維生素D310 mg/kg，N組注射等量生理鹽水。AS和AS+rhES組于喂養后第7天行主動脈球囊拉傷術，0.3%戊巴比妥鈉10 mL/kg腹腔麻醉，無菌條件下做頸正中切口，分離左頸外動脈，結扎遠心端，向心臟方向插入1.5 F球囊，約進入8 cm后充盈球囊，感到阻力后緩慢回拉約5 cm，放空球囊，再進入5 cm，充盈、回拉，重復3次，退出球囊，結扎近心端，逐層縫合，術后肌注青霉素鈉3 d。造模成功后4周，AS+rhES組以10 mg·kg-1·d-1rhES連續腹腔注射注射4周，另2組注射等量生理鹽水。

3.2 血脂、TnI及炎癥指標檢測 采用全自動生化分析儀測定血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)等項目。用ELISA法檢測血清CRP、IL-1和TnI含量。

3.3 CD31免疫組化染色檢測主動脈新生微血管密度 采用內皮細胞特異性標記物CD31行免疫組化染色，CD31標記的新生血管內皮細胞陽性染色呈棕黃色或棕褐色，采用Carl Zeiss Imaging Systems測量的陽性細胞的積分吸光度(integral absorbamce,IA)反映新生血管密度。

3.4 Western blot法檢測主動脈Dll4和Notch1蛋白水平變化 提取同等水平球囊損傷處腹主動脈組織總蛋白后采用BCA法測定各組Dll4和Notch1蛋白的表達。凝膠圖像處理系統分析各組目的條帶與相應β-actin蛋白條帶的吸光度比值。

4 統計學處理

采用SPSS 17.0軟件進行統計分析。所有數據以均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間均數兩兩比較采用Bonferroni法。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 各組血清TC、TG和LDL-C水平的變化

造模后的AS組和AS+rhES組的血清TC、TG和LDL-C水平與N組比較，均顯著升高(P<0.05)，但AS組和AS+rhES組之間比較差異無統計學顯著性，見表1。

表1 各組血清TC、TG和LDL-C水平的比較

Table 1.The levels of blood TC, TG and LDL-C in 3 groups (mmol/L.Mean±SD.n=10)

TreatmentTCTGLDLCN1.26±0.450.43±0.100.21±0.01AS1.45±0.08*0.79±0.14*0.28±0.02*AS+rhES1.41±0.09*0.72±0.23*0.26±0.09*

*P<0.05vsN group.

2 各組大鼠血清CRP和IL-1和TnI水平的變化

與N組比較，AS組和AS+rhES組的血清CRP和IL-1水平均顯著升高(P<0.05)，但上述指標在AS組和AS+rhES組之間比較差異無統計學顯著性；各組間TnI水平兩兩比較差異均無統計學顯著性，見表2。

3 免疫組化染色檢測各組主動脈新生血管

采用CD31標記的新生血管內皮細胞陽性染色呈棕黃色或棕褐色，結果顯示AS組新生血管表達最豐富；與N組相比，AS組和AS+rhES組的CD31表

表2 各組血清CRP、IL-1和TnI水平的比較

Table 2.The levels of blood CRP, IL-1 and TnI in 3 groups (Mean±SD.n=10)

TreatmentCRP(μg/L)IL-1(ng/L)TnI(ng/L)N3128.74±124.95206.13±24.64965.40±58.39AS3573.77±165.76*238.70±11.56*1003.61±84.17AS+rhES3441.61±357.89*240.22±14.07*1016.65±92.14

*P<0.05vsN group.

達均明顯增多(P<0.05)；與AS相比，AS+rhES組的CD31表達顯著減少(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The representative images of aorta with CD31 immunohistochemical staining (×400). Mean±SD.n=10.*P< 0.05vsN;#P<0.05vsAS.

圖1 各組主動脈CD31免疫組化染色

4 Western blot法檢測各組主動脈Dll4和Notch1蛋白水平變化

與N組比較，AS組的Dll4和Notch1蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)；而與AS組相比，AS+rhES組的Dll4和Notch1蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)，見圖2。

討 論

近年研究發現，AS斑塊內常出現病理性新生血管，它可以促進AS進展，誘發斑塊內出血、破裂及并發癥的發生，AS斑塊內的新生血管作為不穩定斑塊的病理特征已經得到充分認識，抑制斑塊內新生血管已成為防治AS的新策略[1-2]。前期工作中，我們發現rhES可有效抑制兔和小型豬模型中AS斑塊內新生血管形成，減小斑塊面積，延緩AS進展，但rhES抑制斑塊內新生血管的具體信號機制尚不清楚[3-4]。

Dll4/Notch通路是近年來頗受關注的對新生血管的形態和功能發育有著重要影響的信號通路[6]。Notch通路由Notch受體及5種配體(Jagged1、Jagged2、Dll1、Dll3和Dll4)組成，其中Dll4是血管特異性Notch配體，它在血管構建和穩態維持中扮演著關鍵角色，Dll4能在生理及病理性血管生成中特異性表達[7]。Dll4/Notch通路參與調控腫瘤的病理性血管新生已經在乳腺癌、腎癌、Ksposi肉瘤等體內外實驗中得到證實[8]。研究發現，Dll4/Notch通路通過抑制內皮細胞增生、血管分支形成和促進血管功能完善來抑制病理性血管的過度發生[9]。在使用Dll4抑制劑阻斷Dll4/Notch通路后，可促進血管內皮細胞的新生血管出芽和血管分支形成，從而導致腫瘤組織中病理性新生血管密度增加[10]。而過表達Dll4激活Dll4/Notch通路可以減少腫瘤內新生血管密度，抑制腫瘤生長[11]。同樣在眼底疾病的研究中，阻斷Dll4/Notch通路將加重脈絡膜病理性新生血管的生成，而外源性激活該通路則抑制眼底血管的生長[12]。由此可見，Dll4/Notch通路是體內調控病理性血管新生的重要通路，基于該通路的各種治療手段將為抗血管新生的治療帶來新方向。

Figure 2.The protein expression of Dll4 and Notch1 in 3 groups. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsN;#P<0.05vsAS.

圖2 各組主動脈Dll4和Notch1的蛋白表達

鑒于Dll4/Notch通路調控病理性血管新生的重要意義，我們首次將其納入AS斑塊內新生血管的研究當中。我們首先發現，rhES能有效抑制AS大鼠模型主動脈斑塊內血管新生，該作用與血脂、炎癥因子的變化無關。我們還發現，較之對照組，AS模型組的Dll4和Notch1蛋白表達水平顯著降低，提示兩者表達的異常可能是加速AS斑塊內血管新生的原因；而在rhES干預后，相比模型組，Dll4和Notch1蛋白表達均顯著升高，提示rhES可能通過激活Dll4/Notch通路抑制大鼠AS斑塊內新生血管形成。本研究在國內外首次發現Dll4/Notch通路參與了rhES抑制AS斑塊內血管新生這一過程，這一發現為AS的抗血管新生治療提供了更多的理論和實驗依據，也為AS的防治研究提供了新的思路。但Dll4/Notch通路在斑塊內血管新生這一病理過程中究竟發揮了怎樣的作用，Dl14/Notch通路是否是調控rhES抗血管新生的具體信號機制，還需要進一步研究。

[1] Staub D, Schinkel AF, Coll B, et al. Contrast-enhanced ultrasound imaging of the vasa vasorum: from early atherosclerosis to the identification of unstable plaques[J]. JACC Cardiovasc Imaging, 2010, 3(7):761-771.

[2] Finn AV, Jain RK. Coronary plaque neovascularization and hemorrhage: a potential target for plaque stabilization?[J]. JACC Cardiovasc Imaging, 2010, 3(1):41-44.

[3] Mao W, Kong J, Dai J, et al.Evaluation of recombinant endostatin in the treatment of atherosclerotic plaques and neovascularization in rabbits[J]. J Zhejiang Univ Sci B, 2010, 11(8):599-607.

[4] Xu X, Mao W, Chai Y, et al. Angiogenesis inhibitor, endostar, prevents vasa vasorum neovascularization in a swine atherosclerosis model[J]. J Atheroscler Thromb, 2015, 22(10):1100-1112.

[5] Ahmad I, Balasubramanian S, Del Debbio CB, et al. Regulation of ocular angiogenesis by Notch signaling: implications in neovascular age-related macular degeneration[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2011, 52(6):2868-2878.

[6] Yan M, Plowman GD. Delta-like 4/Notch signaling and its therapeutic implications[J]. Clin Cancer Res, 2007, 13(24):7243-7246.

[7] Kume T. Novel insights into the differential functions of Notch ligands in vascular formation[J]. J Angiogenes Res, 2009, 1:8.

[8] Hu XB, Feng F, Wang YC, et al. Blockade of Notch signaling in tumor-bearing mice may lead to tumor regression, progression, or metastasis, depending on tumor cell types[J]. Neoplasia, 2009, 11(1):32-38.

[9] Suchting S, Freitas C, le Noble F, et al. The Notch ligand Delta-like 4 negatively regulates endothelial tip cell formation and vessel branching[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007, 104(9): 3225-3230.

[10]Hellstrom M, Phng LK, Hofmann JJ, et al. Dll4 signaling through Notch1 regulates formation of tip cells during angiogenesis[J]. Nature, 2007, 445(7129): 776-780.

[11]Noguera-Troise I, Daly C, Papadopoulos NJ, et al. Blockade of Dll4 inhibits tumour growth by promoting non-productive angiogenesis[J]. Nature, 2006, 444(7122)：1032-1037.

[12]Ahmad I, Balasubramanian S, Del Debbio CB, et al. Regulation of ocular angiogenesis by Notch signaling: implications in neovascular age-related macular degeneration[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2011, 52(6):2868-2878.

(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Inhibitory effect of recombinant human endostatin on angiogenesis in atherosclerotic plaque of rats by regulating Dll4/Notch pathway

CAI Hong-wen, ZHU Min, ZHOU Xin-bin, MIAO Jing, QIU Yuan-gang, MAO Wei

(DepartmentofCardiology,TheFirstAffiliatedHospitalofZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou310006,China.E-mail:chwzju2002@163.com)

AIM: To observe the inhibitory effect of recombinant human endostatin (rhES) on plaque angiogenesis, and to explore the regulatory mechanism of Dll4/Notch pathway in the anti-angiogenic effect of rhES. METHODS: Male Wistar rats were randomized into 3 groups: normal control group (N group), atherosclerotic model group (AS group), and rhES treated group (AS+rhES group). The rats in N group were fed a normal diet, while the remaining 2 groups were established to atherosclerotic rat model via high-cholesterol diet, intraperitoneal injection of vitamin D3and aortic balloon injury. The rats in AS+rhES group received intraperitoneal injection of rhES. The blood total cholesterol (TC), triglyceride (TG), low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C), C-reactive protein (CRP), interleukin-1 (IL-1) and troponin I (TnI) were measured. The atherosclerotic abdominal aortas were taken for pathological observation. Immunohistochemical staining was used to measure the density of neovessels in the plaques， which were marked by CD31. The protein levels of Dll4 and Notch1 in the aortas were analyzed by Western blot. RESULTS: The levels of blood TC, TG, LDL-C, CRP and IL-1 in AS group and AS+rhES group were much higher than those in N group (P<0.05), and no statistical difference between AS group and AS+rhES group was observed. The expression of CD31 in AS group was the highest among all groups. Compared with AS group, the density of neovessels in the plaques of AS+rhES group decreased significantly (P<0.05). The protein expression of Dll4 and Notch1 in AS group was lower than that in N group (P<0.05). Compared with AS group, the protein expression of Dll4 and Notch1 increased significantly (P<0.05). CONCLUSION: rhES has the ability to inhibit plaque angiogenesis in rats. The activation of Dll4/Notch pathway may be the mechanism of rhES in inhibiting plaque angiogenesis.

Recombinant human endostatin; Atherosclerosis; Dll4/Notch pathway; Angiogenesis

雜志網址： http://www.cjpp.net

1000- 4718(2016)09- 1700- 04

2016- 01- 11

2016- 07- 03

浙江省中醫藥科研基金項目(No. 2013ZA054)；浙江省醫藥衛生研究計劃(No. 2013KYB186)

△通訊作者 Tel: 0517-86620295; E-mail: chwzju2002@163.com

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10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.09.028