大鼠頸動(dòng)脈體免疫組化實(shí)驗(yàn)方法

賈祥磊　李超紅　蔡瑞艷　馮　杰　姜淑嫻　劉玉珍

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院　河南省神經(jīng)病學(xué)研究所，河南　衛(wèi)輝　453100)

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大鼠頸動(dòng)脈體免疫組化實(shí)驗(yàn)方法

賈祥磊李超紅蔡瑞艷馮杰姜淑嫻劉玉珍

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院河南省神經(jīng)病學(xué)研究所，河南衛(wèi)輝453100)

目的運(yùn)用石蠟切片免疫組化試驗(yàn)方法檢驗(yàn)大鼠頸動(dòng)脈體。方法通過(guò)對(duì)頸動(dòng)脈體的固定，石蠟包埋，切片。分析切片的質(zhì)量及其原因，運(yùn)用免疫組化方法標(biāo)記大鼠頸動(dòng)脈體標(biāo)記物——酪氨酸羥化酶。結(jié)果大鼠頸動(dòng)脈體在100%的酒精和二甲苯的脫水時(shí)間18 min為宜。將頸動(dòng)脈體水平放置包埋和修剪之后更好進(jìn)行石蠟切片操作。結(jié)論應(yīng)用免疫組化方法研究頸動(dòng)脈體的過(guò)程需要小心操作，反復(fù)練習(xí)，及時(shí)總結(jié)，才能熟能生巧，最終掌握適用于頸動(dòng)脈體的研究方法。

頸動(dòng)脈體；石蠟切片；免疫組化

頸動(dòng)脈體外周化學(xué)感受器通過(guò)感受外周血氧分壓的變化介導(dǎo)睡眠呼吸暫停綜合征、高血壓及慢性心力衰竭等病理狀況下的交感神經(jīng)活性增強(qiáng)。大鼠模型常被用來(lái)研究頸動(dòng)脈體在上述疾病狀況下功能變化的機(jī)制。為檢測(cè)信號(hào)分子水平的變化，免疫組化為最常用研究方法之一，但是由于頸動(dòng)脈體體積微小且難與周圍組織區(qū)分，在做免疫組化的過(guò)程中，往往會(huì)出現(xiàn)頸動(dòng)脈體丟失或誤認(rèn)等問(wèn)題，最終導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗〔1～6〕。本文擬探討大鼠頸動(dòng)脈體石蠟切片和免疫組化染色過(guò)程的各個(gè)環(huán)節(jié)，為頸動(dòng)脈體研究提供方法學(xué)保障。

1　材料和方法

1.1動(dòng)物雄性SD大鼠，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(No.41003100001855)，每5只一籠飼養(yǎng)，體重220～280 g。光照條件：每天明暗12 h交替。攝食飲水自由，墊料更換1次/w。

1.2試劑兔抗酪氨酸羥化酶(Abcam)、二抗試劑盒(中山金橋，PV-9001)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(萬(wàn)類生物，WLA022)、蘇木素(上海標(biāo)本模型廠)、伊紅(上海試劑三廠)、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、無(wú)水碳酸鈉、甘油、硫酸鎂(天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)、醋酸(天津市北辰方正試劑廠)、無(wú)水乙醇(天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司)、二甲苯(天津市永大化學(xué)試劑有限公司)、硫酸鋁鉀(天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司)、碘酸鈉(天津市化學(xué)試劑三廠)、甲醛(煙臺(tái)市雙雙化工有限公司)、中性樹(shù)膠(中國(guó)上海懿洋儀器有限公司)、載玻片。

1.3器材石蠟切片機(jī)(Thermo，F(xiàn)inesse 325)、烤片機(jī)(Leica，HI1220)、顯微鏡(Nikon)、微波爐(格蘭仕)、烘箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、蠕動(dòng)泵(保定蘭格恒流泵有限公司，BT00-300T)、pH儀(Sartorius，PB-10)，冷凝臺(tái)(孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司，BM-IX)、體視顯微鏡(XYH-4A)。

1.4方法

1.4.1組織固定用10%的水合氯醛麻醉大鼠(腹腔注射，3.4 ml/kg)，把大鼠固定在灌流架上，開(kāi)胸。灌流針頭從心尖穿入左心室，一直穿入到主動(dòng)脈弓。剪開(kāi)右心耳，快速灌流生理鹽水。灌流生理鹽水速度為120 ml/min，灌流量為500 ml。然后，用4%中性甲醛進(jìn)行固定。灌流速度為10 ml/min，灌流量為200 ml。灌流結(jié)束后，從頸部分離出頸動(dòng)脈分叉，為了不損傷頸動(dòng)脈體，頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈盡量留長(zhǎng)一些。將分離的頸動(dòng)脈分叉室溫放置于4%中性甲醛溶液中，不低于2 h。然后取出頸動(dòng)脈分叉置于生理鹽水中。在體視鏡下分離與頸內(nèi)動(dòng)脈伴行的迷走神經(jīng)。在頸外動(dòng)脈上，離頸總動(dòng)脈分叉很近的部位有一根細(xì)小的血管，為枕動(dòng)脈，將其從頸內(nèi)動(dòng)脈的根部修剪下來(lái)。在頸動(dòng)脈分叉的腹面，有一個(gè)橄欖型膠質(zhì)狀的組織，為頸上神經(jīng)節(jié)。將頸上神經(jīng)節(jié)分離。此時(shí)，在頸總動(dòng)脈分叉靠近頸內(nèi)動(dòng)脈一側(cè)觀察到有一團(tuán)半透明的組織，為頸動(dòng)脈體；把頸動(dòng)脈體周邊的結(jié)締組織分離干凈，只留下頸動(dòng)脈體和分叉。

1.4.2組織包埋把頸動(dòng)脈分叉置于包埋盒中，開(kāi)始脫水。逐一浸在60%酒精、80%酒精、95%酒精1、95%酒精2、各1 h。依次在100%酒精1、100%酒精2、二甲苯1、二甲苯2，每個(gè)液體中浸18 min。脫水完成后，開(kāi)始浸蠟，浸蠟時(shí)間不低于7 h(68℃)。然后在組織包埋機(jī)上進(jìn)行包埋。包埋時(shí)盡量讓頸動(dòng)脈分叉和蠟盒的平面保持平行，這樣有利于在切片機(jī)上切出較理想的頸動(dòng)脈體切片。將包埋盒放在冷凝臺(tái)上，室溫下冷凝10 min。冷凝后修蠟塊，去除周圍多余的蠟。置于4℃冰箱中過(guò)夜。次日，將蠟塊置于-20℃冰箱冷卻保存。

1.4.3石蠟切片和脫蠟蠟塊從-20℃冰箱中取出固定到石蠟切片機(jī)上修片，修到血管處，放回-20℃冰箱進(jìn)行降溫。降溫5 min后，取出蠟塊，切片厚度調(diào)整為5 μm，開(kāi)始切片。每切3～5片，將最后1片貼在載玻片上，放在顯微鏡下觀察。觀察到頸動(dòng)脈體的片子后，收取以后的石蠟切片。將片子放在自來(lái)水中展開(kāi)，自來(lái)水中滴加幾滴酒精有利于展片，用載玻片從自來(lái)水中取出切片，置于45℃水中進(jìn)一步展片，石蠟切片完全展開(kāi)后，貼到載玻片上。將載玻片置于室溫晾干。晾干后也可放在盒子中室溫保存。做蘇木素-伊紅染色(HE)或者免疫組化實(shí)驗(yàn)時(shí)，把載玻片放到65℃烤片機(jī)上烤片90 min。然后進(jìn)行梯度脫蠟，先置于二甲苯1、二甲苯2內(nèi)各5 min，依次置于無(wú)水酒精、95%酒精、80%酒精各1 min。自來(lái)水洗1 min。整個(gè)脫蠟過(guò)程不要讓組織干。脫蠟完成后，直接做HE染色或者免疫組化實(shí)驗(yàn)的抗原修復(fù)步驟。

1.4.4HE染色和免疫組化HE染色：浸在蘇木素6 min，去離子水浸泡1 min；分化液3 s，去離子水浸泡10 min；促藍(lán)液1 min，去離子水浸泡1 min；染伊紅10 s，去離子水浸泡1 min。室溫下晾干，用中性樹(shù)膠封片。HE染色完成。

免疫組化實(shí)驗(yàn)：脫蠟后用檸檬酸鈉緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，玻片置于500 ml的檸檬酸鈉緩沖液中(0.01 mol/L，pH6.0)，微波爐加熱沸騰10 min，冷卻至室溫，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，每次5 min 。3%H2O2室溫孵育15 min去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，暗盒避光。然后PBS洗滌3次，每次5 min。加0.2%的Triton-X100(Triton-X100溶解在0.01 mol/L的PBS)通透10 min。滴加10%山羊血清(用0.01 mol/L的PBS配制)封閉，室溫孵育20 min。然后滴加酪氨酸羥化酶(TH)抗體(稀釋比例1∶500)，陰性對(duì)照滴加PBS，4℃過(guò)夜。PBS洗滌3次，每次5 min。滴加中衫金橋PV-9001二抗試劑，室溫孵育20 min，PBS洗滌3次，每次5 min。按照試劑盒說(shuō)明配制DAB顯色液，顯色時(shí)需鏡下觀察確定，發(fā)現(xiàn)目的蛋白顯色發(fā)生變化，立即浸泡在去離子水中，終止反應(yīng)。然后進(jìn)行核染。蘇木素溶液中染色4 min，去離子水浸泡1 min。放到顯微鏡下觀察核的顏色，若染色過(guò)深在分化液中浸3 s，去離子水洗滌5 min。促藍(lán)1 s，去離子水浸泡1 min。再放到鏡下觀察核的顏色；如果核的顏色過(guò)淺，可再用蘇木素復(fù)染，直到染出理想的顏色。核染以后，在室溫晾干片子，浸二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。將玻片晾干，在顯微鏡下拍片。

2　結(jié)　果

2.1HE染色頸動(dòng)脈體呈不規(guī)則的橢圓形，借結(jié)締組織連于血管壁上(圖1A)，主要由成簇聚集的細(xì)胞，豐富血管網(wǎng)以及疏松的結(jié)締組織構(gòu)成(圖1B)；細(xì)胞核較大，結(jié)構(gòu)致密(圖1C)。

2.2免疫組化染色表達(dá)TH的Ⅰ型細(xì)胞成團(tuán)聚集。對(duì)照組未加TH抗體，TH未被抗體標(biāo)記，只呈現(xiàn)核染色(圖2)。

胞質(zhì)為伊紅染色，胞核為蘇木素染色圖1　頸動(dòng)脈體HE染色

圖2　頸動(dòng)脈體免疫組織化學(xué)染色

3　討　論

由于頸動(dòng)脈體體積微小，應(yīng)用免疫組化方法對(duì)其研究的過(guò)程中，許多初學(xué)者耗費(fèi)大量的時(shí)間和精力學(xué)習(xí)和總結(jié)頸動(dòng)脈體石蠟切片制作的技巧性操作，否則將會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。經(jīng)驗(yàn)表明，理想的切片是成功的關(guān)鍵。首先，灌注完成后，在體視鏡下要把頸動(dòng)脈體周圍的組織修除干凈，因大鼠頸動(dòng)脈體較小，對(duì)于初學(xué)者來(lái)說(shuō)，在做免疫組化石蠟切片時(shí)，往往因?yàn)檎`判出現(xiàn)切不到頸動(dòng)脈體的現(xiàn)象。為了提高制備頸動(dòng)脈體切片的成功性，組織固定后盡量把組織分離的只剩下頸動(dòng)脈體和血管。其次，頸動(dòng)脈體在無(wú)水酒精和二甲苯中的脫水時(shí)間各保持18 min為宜(圖3A)。如果脫水時(shí)間過(guò)短，則會(huì)導(dǎo)致脫水不足，蠟不易浸透組織；時(shí)間過(guò)長(zhǎng)(20 min)，會(huì)出現(xiàn)組織過(guò)硬，切片易碎且有刀痕(圖3B)。刀痕過(guò)重就會(huì)出現(xiàn)頸動(dòng)脈體受損，做不出理想的片子。石蠟包埋的時(shí)間不低于7 h，避免由于浸蠟時(shí)間不足而造成組織塊過(guò)硬。包埋時(shí)，盡量把頸動(dòng)脈分叉水平放置于包埋盒底部，使所獲蠟塊中的頸動(dòng)脈分叉結(jié)構(gòu)與蠟塊表面呈平行關(guān)系。

A為理想的頸動(dòng)脈體切片；B為脫水20 min頸動(dòng)脈體切片圖3　頸動(dòng)脈體石蠟切片

切片前，準(zhǔn)備好所需全部物品，避免由于準(zhǔn)備不足導(dǎo)致切片過(guò)程延長(zhǎng)，因?yàn)樵诓僮鬟^(guò)程中，最初在冰箱中變硬的蠟塊在室溫下會(huì)慢慢變軟，從而導(dǎo)致切下來(lái)的組織切片卷在一起，難以切出完整的片子。切片時(shí)，刀片盡量與石蠟包塊中的頸動(dòng)脈分叉結(jié)構(gòu)保持平行關(guān)系，以便切片過(guò)程中根據(jù)頸動(dòng)脈分叉處的結(jié)構(gòu)關(guān)系定位出頸動(dòng)脈體，減少切片時(shí)由于誤判導(dǎo)致的頸動(dòng)脈體遺失。切片速度不宜過(guò)快，始終保持手腕力度均勻，以保證所得石蠟切片的完整及厚度均一。切的過(guò)程中及時(shí)在顯微鏡下觀察切片是否已經(jīng)含有頸動(dòng)脈體，因?yàn)槠潴w積微小，稍有疏忽即可造成部分或整個(gè)頸動(dòng)脈體組織已經(jīng)切掉還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的情況。在切片過(guò)程中由于蠟塊溫度高而切不成片時(shí)，需將蠟塊取下，放回-20℃冰箱，再次降溫后重新開(kāi)始。在水中展片時(shí)，可用柔軟小毛刷將切片小心移至載玻片上，在貼片過(guò)程中防止石蠟切片碎裂，一張載玻片上可以貼3張切片。一般情況下，從一個(gè)SD大鼠頸動(dòng)脈體可以獲得5 μm厚度含頸動(dòng)脈體石蠟切片27張。

做HE染色時(shí)，及時(shí)過(guò)濾染料，避免因?yàn)槿玖现谐霈F(xiàn)的沉淀導(dǎo)致后續(xù)染色結(jié)果不均一，最終影響圖像的質(zhì)量。做免疫組化染色時(shí)，避免切片干燥，要?jiǎng)幼魅岷停⌒牟僮鳎乐挂虿僮鞑划?dāng)引起的切片損傷或切片脫落造成的實(shí)驗(yàn)失敗。用DAB發(fā)色時(shí)，需及時(shí)在顯微鏡下觀察色素的變化，根據(jù)所檢測(cè)蛋白的特性決定何時(shí)終止反應(yīng)。用蘇木素復(fù)染時(shí)，應(yīng)在顯微鏡下觀察核的著色是否達(dá)到理想效果，避免核染色過(guò)深影響到檢測(cè)蛋白的著色表現(xiàn)。如果顏色偏深，可重復(fù)去分化后促藍(lán)步驟。如果核顏色較淺，可以用蘇木素重新染色。

綜上所述，應(yīng)用免疫組化方法研究頸動(dòng)脈體的過(guò)程需要小心操作，反復(fù)練習(xí)，及時(shí)總結(jié)，才能熟能生巧，最終掌握適用于頸動(dòng)脈體的研究方法。

1Kumar P，Prabhakar NR.Peripheral chemoreceptors：function and plasticity of the carotid body〔J〕.Compr Physiol，2012；2(1)：141-219.

2Prabhakar NR.Sensing hypoxia：physiology，genetics and epigenetics〔J〕.J Physiol，2013；591(9)：2245-57.

3Pardal R，Ortega-Saenz P，Duran R，etal.Glia-like stem cells sustain physiologic neurogenesis in the adult mammalian carotid body〔J〕.Cell，2007，131(2)：364-77.

4Bairam A，Neji H，De-Grandpre P，etal.Autoreceptor mechanism regulating carotid body dopamine release from adult and 10-day-old rabbits〔J〕.Respir Physiol，2000；120(1)：27-34.

5Kim DK，Prabhakar NR，Kumar GK.Acetylcholine release from the carotid body by hypoxia：evidence for the involvement of autoinhibitory receptors〔J〕.J Appl Physiol，2004；96(1)：376-83.

6Bisgard GE.Carotid body mechanisms in acclimatization to hypoxia〔J〕.Respir Physiol，2000；121(2-3)：237-46.

〔2016-02-17修回〕

(編輯袁左鳴)

國(guó)家自然科學(xué)基金(81470271)

劉玉珍(1964-)，女，博士，教授，主要從事阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征研究。

賈祥磊(1985-)，男，碩士，主要從事神經(jīng)電生理研究。

Q34；Q5-33；Q593+.2

A

1005-9202(2016)15-3621-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.15.005