白細(xì)胞介素-17在卵清蛋白誘導(dǎo)的大鼠過(guò)敏性結(jié)膜炎發(fā)病中的作用

張　劍　王玉清　宿星杰　劉宏偉

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科，黑龍江　佳木斯　154002)

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白細(xì)胞介素-17在卵清蛋白誘導(dǎo)的大鼠過(guò)敏性結(jié)膜炎發(fā)病中的作用

張劍王玉清宿星杰劉宏偉

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科，黑龍江佳木斯154002)

目的探討白細(xì)胞介素(IL)-17在雞卵清蛋白(OVA)誘導(dǎo)的大鼠過(guò)敏性結(jié)膜炎(AC)發(fā)病中的可能作用。方法30只Brown Norway大鼠隨機(jī)分對(duì)照組(NC組)和AC組。應(yīng)用OVA誘導(dǎo)大鼠AC模型。觀察兩組眼瞼和結(jié)膜充血、水腫、分泌物情況并做評(píng)分。對(duì)兩組眼球和上下眼瞼進(jìn)行病理學(xué)分析,計(jì)數(shù)穹隆部眼結(jié)膜嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測(cè)定大鼠血清和脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-17、IL-4、IL-6、IL-10、干擾素(IFN)-γ水平。結(jié)果AC組體征評(píng)分明顯高于NC組(P<0.01)。AC組眼結(jié)膜穹隆部嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)較NC組明顯升高(P<0.01)。AC組血清和脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-17、IL-4、IL-6、IL-10水平較NC組明顯升高(均P<0.01)，IFN-γ水平明顯降低(P<0.01)。結(jié)論IL-17 增高、Th1/Th2失衡是大鼠AC發(fā)病的重要原因，降低IL-17、恢復(fù)Th1/Th2失衡可能成為AC治療的一條新途徑。

過(guò)敏性結(jié)膜炎；T細(xì)胞；白細(xì)胞介素-17

有報(bào)道全世界患過(guò)敏性結(jié)膜炎(AC)者達(dá)20%，我國(guó)患病率約10%～16%〔1,2〕。研究表明AC是眼部結(jié)膜對(duì)外源特異性抗原發(fā)生的免疫應(yīng)答，包括IgE介導(dǎo)的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)和T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)〔3〕。近年研究發(fā)現(xiàn)機(jī)體T 細(xì)胞前體Th0能分化產(chǎn)生一種新型的17型輔助性T細(xì)胞，它不同于1型和2型T細(xì)胞，有獨(dú)特的分化和發(fā)育調(diào)節(jié)機(jī)制，能產(chǎn)生特異性的效應(yīng)因子白細(xì)胞介素(IL)-17，IL-17能強(qiáng)大招募中性粒細(xì)胞，促進(jìn)多種細(xì)胞分泌釋放炎性因子，放大炎癥反應(yīng)，參與多種免疫性炎癥疾病的病理過(guò)程〔4〕。本實(shí)驗(yàn)探討IL-17在卵清蛋白(OVA)致敏的大鼠AC發(fā)病中的可能作用。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組由佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的SPF級(jí)，鼠齡6～8 w，Brown Norway大鼠30只，體重150～200 g，按隨機(jī)數(shù)字法分為對(duì)照組(NC組)10只，AC組20只。

1.2主要試劑及儀器OVA、Al(OH)3(美國(guó)Sigma公司)，Giemsa染色試劑(北京索萊寶科技有限公司)，臺(tái)吩藍(lán)(上海生工生物工程股份有限公司)，RPMI1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，大鼠變應(yīng)原特異性IL-17、IL-4、IL-6、IL-10、干擾素(IFN)-γ試劑盒(美國(guó)RD公司)，全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Rayto RT-6000)。

1.3AC大鼠模型的制作AC組于實(shí)驗(yàn)第1天給OVA 100 μg和佐劑Al(OH)35 mg磷酸鹽緩沖液(PBS)0.2 ml左后足底部注射，第7天給同樣OVA PBS液100 μg/0.2 ml腹腔注射。第14、16天給OVA PBS液(每眼750 μg/5 μl)點(diǎn)眼激發(fā)。NC組給予等量的PBS液，給藥時(shí)間和途徑同實(shí)驗(yàn)組。

1.4眼部臨床評(píng)估在結(jié)膜囊OVA末次致敏后20 min，雙盲法裂隙燈顯微鏡觀察眼部體佂(均觀察右眼)。根據(jù)Magone等〔5〕的標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分。評(píng)分四項(xiàng)指標(biāo)為：結(jié)膜水腫、結(jié)膜充血、眼瞼充血水腫、流淚，分別計(jì)0～3分。結(jié)膜水腫評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：輕度局限結(jié)膜水腫1分；彌散水腫、穹隆部受累2分；結(jié)膜水腫致結(jié)膜嚢淺窄3分。結(jié)膜充血評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：輕度的彌散血管充血1分；彌散充血近穹隆部明顯2分；充血伴結(jié)膜下出血3分。眼瞼充血水腫評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：輕度眼瞼充血水腫1分；眼瞼彌散充血水腫瞼裂變小2分；眼瞼嚴(yán)重充血水腫、眼開困難3分。流淚評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：淚阜部淚液積存1分；淚液溢出瞼緣2分；流淚不止3分。最后將4項(xiàng)指標(biāo)各自積分相加得出總分。

1.5眼部病理學(xué)檢測(cè)末次激發(fā)24 h斷髓法處死大鼠，摘取眼球及上、下眼瞼10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，矢狀位4 μm連續(xù)切片，Giemsa染色，觀察大鼠眼結(jié)膜病理變化。計(jì)數(shù)穹隆部結(jié)膜每高倍鏡下嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)。

1.6脾細(xì)胞培養(yǎng)摘取眼球及瞼結(jié)膜后，無(wú)菌條件下取出大鼠脾臟，經(jīng)100目鋼網(wǎng)研磨過(guò)濾成單個(gè)細(xì)胞，用RPMI1640培養(yǎng)基(含100 mg/L小牛血清、100 mg/L青霉素及100 mg/L鏈霉素)重懸脾細(xì)胞。用8.3 g/L NH4Cl紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，離心，收集細(xì)胞沉淀。用RPMI1640培養(yǎng)基重懸脾細(xì)胞，制成均質(zhì)脾細(xì)胞懸液。取少量細(xì)胞懸液作臺(tái)盼藍(lán)染色，鑒定活細(xì)胞數(shù)(高于98%可用)。將脾細(xì)胞懸液調(diào)整到細(xì)胞數(shù)2×106ml-1。取脾細(xì)胞懸液100 μl加到無(wú)菌平底96孔板中，加入OVA至終濃度為100 μg/ml，并設(shè)立陰性對(duì)照，恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h。收集培養(yǎng)上清液。

1.7細(xì)胞因子的測(cè)定分離大鼠脾臟同時(shí)，腹主動(dòng)脈取血，分離血清。應(yīng)用ELISA測(cè)定大鼠血清和脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-17、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ含量。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SSPS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、Pearson相關(guān)分析。

2　結(jié)　果

2.1大鼠眼部結(jié)膜炎癥的臨床評(píng)估在末次激發(fā)后20 min，裂隙燈顯微鏡觀察，NC組眼部無(wú)明顯異常改變，Magone炎癥評(píng)分(0.79±0.14)分；AC組明顯有眼部過(guò)敏癥狀，包括不同程度

的眼結(jié)膜水腫、充血，眼瞼充血水腫、流淚，炎癥評(píng)分(7.64±1.26)分，兩組有明顯差異(P<0.01)。提示AC組出現(xiàn)明顯的急性期變態(tài)反應(yīng)性炎癥改變。

2.2眼部病理變化NC組眼結(jié)膜無(wú)明顯充血水腫，固有層沒(méi)有或偶見粒細(xì)胞浸潤(rùn)，穹隆部眼結(jié)膜每高倍鏡下嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)(17.36±6.02)個(gè)；AC組結(jié)膜組織疏松，充血水腫明顯，固有層內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，肥大細(xì)胞增加，并有脫顆粒現(xiàn)象，結(jié)膜嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)(78.27±15.96)個(gè)，兩組差異顯著(P<0.05)。見圖1。

2.3大鼠血清、脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-17、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ水平與NC組比較，AC組血清、脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-17、IL-4、IL-6、IL-10水平明顯升高(均P<0.01)，IFN-γ水平明顯降低(P<0.01)。見表1。

圖1　兩組病理切片(Gimesa染色，×400)

組別n血清IL-17IL-4IL-6LL-10IFN-γ培養(yǎng)上清液IL-17IL-4IL-6LL-10IFN-γNC組1020.98±2.1888.76±6.3271.81±6.9482.28±9.4835.02±5.652.59±0.066.12±1.134.91±0.485.66±1.0223.45±3.87AC組2054.64±3.071)128.16±10.641)105.69±9.711)121.44±11.521)11.36±1.981)17.68±2.561)54.62±4.371)54.62±4.371)62.92±5.891)7.96±1.011)

與NC組比較：1)P<0.01，下表同

2.4大鼠血清IL-4/IFN-γ、IL-6/IFN-γ、IL-10/IFN-γ比值A(chǔ)C組血清IL-4/IFN-γ、IL-6/IFN-γ、IL-10/IFN-γ比值較NC組明顯升高(均P<0.01)。見表2。

表2　兩組血清IL-4/IFN-γ、IL-6/IFN-γ、IL-10/IFN-γ比值比較

2.5AC組血清IL-17與其他指標(biāo)的相關(guān)性AC組血清IL-17水平與眼部炎癥評(píng)分呈明顯正相關(guān)(r=0.914,P<0.01)。AC組血清IL-17水平與眼結(jié)膜嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)呈明顯正相關(guān)(r=0.956,P<0.01)。

3　討　論

AC是眼結(jié)膜對(duì)外界致敏原發(fā)生速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)性疾病，T細(xì)胞是介導(dǎo)免疫應(yīng)答的主要細(xì)胞。近年研究發(fā)現(xiàn)除輔助性T細(xì)胞1(Th1)和輔助性T細(xì)胞2(Th2)，在輔助性T細(xì)胞中還存在一類新的CD4+T細(xì)胞亞群，因其分泌的細(xì)胞因子以IL-17為主，因此被命名為Th17〔6〕。IL-17于1993年首次由Rouvier從激活的T細(xì)胞雜交瘤中克隆出，其結(jié)構(gòu)獨(dú)特，與目前已知的其他IL蛋白結(jié)構(gòu)無(wú)相似性。近年來(lái)越來(lái)越多的研究證實(shí)Th17產(chǎn)生的IL-17參與許多變應(yīng)性疾病，如過(guò)敏性哮喘、過(guò)敏性鼻炎的免疫炎癥反應(yīng)病理過(guò)程。在小鼠哮喘模型中Th17能上調(diào)Th2介導(dǎo)的嗜酸性粒細(xì)胞性氣道炎癥反應(yīng)〔7〕。IL-17通過(guò)活化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶P38促分裂原活化蛋白激酶和核轉(zhuǎn)錄因子-κb等信號(hào)激酶調(diào)節(jié)嗜酸性粒細(xì)胞功能，放大炎癥反應(yīng)〔8〕。IL-17介導(dǎo)哮喘氣道中中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，許多研究證明中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)在哮喘發(fā)病中發(fā)揮十分重要作用〔9〕。研究發(fā)現(xiàn)變應(yīng)性鼻炎患者鼻腔分泌物中IL-17水平較健康人明顯升高〔10〕。變應(yīng)性鼻炎患者外周血Th17細(xì)胞數(shù)量增加，血清 IL-17水平與患者臨床癥狀的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，IL-17參與了過(guò)敏性鼻炎的炎癥反應(yīng)〔11〕。

本研究提示IL-17水平升高參與了大鼠AC發(fā)病的病理生理過(guò)程。IL-17作為前炎癥因子能誘導(dǎo)上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞釋放IL-6、IL-8、粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-2和生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-α等炎癥因子和趨化因子，刺激炎癥反應(yīng)，對(duì)T細(xì)胞活化起協(xié)同作用〔12〕。IL-17通過(guò)誘導(dǎo)IL-8和活化肥大細(xì)胞介導(dǎo)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞參與AC病理過(guò)程〔13〕。

Th1和Th2也通過(guò)產(chǎn)生不同的細(xì)胞因子介導(dǎo)免疫應(yīng)答。Th1 產(chǎn)生IL-2、IFN-γ、腫瘤壞死因子(TNF)-α參與細(xì)胞免疫，Th2產(chǎn)生IL-4、IL-6、IL-10參與體液免疫。IL-4、IL-6、IL-10和IFN-γ分別為Th2和Th1細(xì)胞產(chǎn)生的特征性細(xì)胞因子。這兩組細(xì)胞因子的水平分別代表Th2和Th1細(xì)胞的功能狀態(tài)〔14〕。本研究結(jié)果表明AC大鼠Th2型細(xì)胞因子增多，Th1型細(xì)胞因子減少。AC大鼠表現(xiàn)為Th2型優(yōu)勢(shì)表達(dá)，Th2/Th1比例升高，免疫狀態(tài)由Th1向Th2“克隆漂移”。Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-6、IL-10參與了AC發(fā)病的病理生理過(guò)程〔15〕。IL-4通過(guò)調(diào)節(jié)Ig重鏈基因類型的轉(zhuǎn)換使B細(xì)胞由產(chǎn)生IgM轉(zhuǎn)換成產(chǎn)生IgE，IL-4不僅促進(jìn)B細(xì)胞表達(dá)分泌IgE還促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞的趨化〔16〕。IL-6能激活嗜酸性粒細(xì)胞，誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞的分化和募集。IgE和嗜酸性粒細(xì)胞共同介導(dǎo)了大鼠AC的免疫病理過(guò)程。小鼠實(shí)驗(yàn)證明，在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β的協(xié)同作用下，IL-6可以誘導(dǎo)Th17分化，產(chǎn)生轉(zhuǎn)移因子孤獨(dú)受體γδ，促進(jìn)Th17產(chǎn)生IL-17〔17〕。另有實(shí)驗(yàn)證明，應(yīng)用IL-6中和抗體可阻斷Th17細(xì)胞分化，抑制Th17介導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦炎的發(fā)生〔18〕。IL-6可促進(jìn)Th17分泌IL-17。有研究證明，IL-4與IL-17可以共同促進(jìn)IgE的合成分泌〔19〕。IL-17、Th17與Th2/Th1細(xì)胞比值變化相互作用、相互影響共同參與了大鼠AC的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制。恢復(fù)Th2/Th1失衡、抑制Th17免疫應(yīng)答，減少IL-17產(chǎn)生或拮抗其生物活性可能成為AC治療的一條新途徑。

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〔2015-01-11修回〕

(編輯苑云杰)

黑龍江省衛(wèi)生廳科研項(xiàng)目(No.2013248);佳木斯大學(xué)青年基金項(xiàng)目(No.Sq2014-006)

劉宏偉(1981-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事眼表疾病、白內(nèi)障疾病研究。

張劍(1977-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事眼表疾病、白內(nèi)障疾病研究。

R777.31

A

1005-9202(2016)15-3623-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.15.006