腦缺血/再灌注致心肌損傷大鼠心肌內皮素和降鈣素基因相關肽的變化

符少萍　王吉文　黃子通　陳煥清

(中山大學孫逸仙紀念醫院預防保健科，廣東　廣州　510120)

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腦缺血/再灌注致心肌損傷大鼠心肌內皮素和降鈣素基因相關肽的變化

符少萍王吉文1黃子通1陳煥清

(中山大學孫逸仙紀念醫院預防保健科，廣東廣州510120)

目的探討內皮素(ET)-1和降鈣素基因相關肽(CGRP)在大鼠腦缺血/再灌注期間心肌中的變化以及在繼發心肌損傷中的作用。方法將大鼠隨機分成假手術組(n=48)、腦缺血組(n=80)、再灌注組(n=80)，通過栓塞右側大腦中動脈(MCAO)法制備腦缺血/再灌注模型，測定腦缺血及再灌注0、6、12、24、48、72 h的腦缺血區域面積、血清肌酸激酶-同工酶(CK-MB)濃度、心肌中ET-1、CGRP含量變化，比較各指標在同一時點及不同時點間的變化以及分析CK-MB、ET-1、CGRP之間關系。結果腦缺血組血CK-MB、心肌ET-1均逐漸升高，12 h達峰值，其后逐漸下降；心肌CGRP于6 h開始下降，12 h達最低值，其后逐回升。 再灌注組CK-MB、ET-1 均于12 h達到峰值，其后下降，CGRP于12 h達最低值，其后回升。缺血組、再灌注組ET-1/CGRP均在6 h開始升高，12 h達峰值，其后逐漸下降，在72 h仍明顯高于0 h(P<0.05)。與腦缺血組比較，再灌注組腦缺血面積在 24、48、72 h 明顯減少(P<0.05)，CK-MB、ET-1 在 6、12 h明顯升高(P<0.05)，CGRP在 6、12 h 明顯降低(P<0.05)。血CK-MB與心肌ET-1/CGRP相關(r=0.547 7，P<0.05)。心肌病理表現為炎性細胞浸潤、心內膜炎、肌纖維變性、灶性壞死等。結論心肌ET-1、CGRP參與腦缺血/再灌注后的繼發心肌損傷過程，心肌損傷程度與心肌ET-1升高程度、CGRP降低程度有關。

腦缺血/再灌注；內皮素-1；降鈣素基因相關肽；心肌損傷；肌酸激酶-同工酶(CK-MB)

早期溶栓再灌注是臨床上治療缺血性腦卒中常用的方法，內皮素(ET)是強有力的內源性血管收縮肽，降鈣素基因相關肽(CGRP)是內源性保護心肌的神經多肽，急性腦缺血再灌注后血中ET-1分泌增加、CGRP分泌減少〔1〕，但有關心肌中ET-1和CGRP的變化以及它們在繼發心肌損傷中的作用報道甚少。為了解急性腦缺血后心肌中ET-1 和CGRP的變化及再灌注對其的影響，探討二者在腦缺血/再灌注術后心肌損傷中的作用，本研究采用大鼠腦缺血/再灌注模型對心肌中的ET-1和CGRP含量變化及其與血中CK-MB的關系進行研究。

1　資料與方法

1.1動物將健康月齡6～8個月、體質量220～250 g的208只雄性SD大鼠(中山大學動物實驗室提供)隨機分成3組：假手術組(對照組，n=48)；腦缺血組(n=80)；再灌注組(n=80)。再根據腦缺血時間將腦缺血組、再灌注組則隨機分成 6、12、24、48、72 h 共5小組(n=16)，將假手術組隨機分成 0、6、12、24、48、72 h共6小組(n=8)，其中假手術組的0 h作為3組的共同0時點。

1.2方法

1.2.1模型制定以頂端燙制成光滑球狀(直徑0.25～0.30 mm)的尼龍線作為栓子，參照張忱等〔2〕報道的方法通過大鼠右側大腦中動脈栓塞(MCAO)法制備腦缺血/再灌注模型。再灌注組則在腦缺血后1 h，拔出栓線實現再灌注。

1.2.2模型成功標準參考Kuluz等〔3〕神經缺陷三級評分標準，腦缺血組于腦缺血后1 h評分達2級以上視為腦缺血模型成功；再灌注組于腦缺血后1 h符合以上標準，且拔栓線后動物成活2 h以上，顱底無出血，Willis環內無血栓形成，視為再灌注成功標準〔4〕。

1.2.3標本采集及處理各組動物于各時點予麻醉后處死，迅速剖腹于下腔靜脈取血，剖胸取心臟組織和開顱取腦組織。

1.2.3.1取血測CK-MB濃度取血2 ml，在3 000 r/min離心10 min，取血清標本50 μl稀釋5倍后用自動生化儀采用酶聯速率法測定血清肌酸激酶-同工酶(CK-MB)濃度。

1.2.3.2取心臟行病理檢查剖胸取出心臟后迅速用冰鹽水沖洗，取左心室沿冠狀面中點分成兩部分，取前部分用10%甲醛溶液浸泡，石蠟包埋固定，切片常規HE染色，光鏡下觀察心肌病理變化。

1.2.3.3取心肌測ET-1、CGRP含量取上述后部分心肌吸去血跡稱質量，盡快放入生理鹽水1 ml中研磨勻漿，4℃3 000 r/min離心15 min，取上清液以5倍磷酸緩沖液(PBS)稀釋。用放射免疫分析法檢測ET-1、CGRP含量。

1.2.3.4取腦TTC染色和測量開顱取腦后，冠狀位視交叉處起切下一厚約2 mm的腦片，置于10%TTC溶液中避光、37℃恒溫30 min后，肉眼觀察并數碼標化攝像。經Photoshop軟件處理后用Scion Image圖像軟件測量腦缺血面積與同側腦面積的比率。

1.3統計學方法采用t檢驗、方差分析、相關分析(α=0.05)。

2　結　果

2.1各組血清CK-MB濃度變化腦缺血組血清CK-MB濃度在6 h開始升高，12 h達高峰，而后逐漸下降，再灌注組CK-MB變化規律與腦缺血組類同。再灌注組CK-MB在6 h、12 h均較腦缺血組的明顯升高(P<0.05)。假手術組CK-MB在各時點比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2各組心肌 ET-1 、CGRP含量的變化腦缺血組、再灌注組心肌ET-1含量均在6 h開始升高，12 h達峰值，而后逐漸下降。腦缺血組、再灌注組心肌CGRP含量均在6 h開始降低，12 h達最低值，而后逐漸回升。腦缺血組、再灌注組ET-1/CGRP均在6 h開始升高，12 h達峰值，之后逐漸下降，在72 h仍明顯高于0 h(P<0.05)。假手術組心肌ET-1、CGRP含量、ET-1/CGRP在各時點比較均無差異性(P>0.05)。見表2。

表1　各組大鼠血CK-MB 濃度的變化

與腦缺血組同時點比較：1)P<0.05，表3同

表2　各組大鼠心肌 ET-1 、CGRP含量的變化

與腦缺血組同時點比較：1)P<0.05；與假手術組同時點比較：2)P<0.05

2.3各組腦壞死組織與同側冠狀面積之比的變化腦缺血組腦壞死面積與同側冠狀面積之比隨時間延長逐增大，至12 h達高峰，之后有逐漸下降；再灌注組腦壞死面積比在12 h達峰值，隨后逐漸下降，且在24、48、72 h較腦缺血組腦壞死面積明顯減少(P<0.05)。 假手術組未見腦壞死組織，見表3。

2.4腦缺血組與再灌注組的心肌病理改變光鏡下心肌細胞：腦缺血后6 h開始出現纖維排列不規則，參差不齊，有顯著的嗜伊紅帶，而后大部分心肌可見炎性細胞浸潤、心內膜炎，部分可見肌纖維變性、灶性壞死等病理改變，偶見大面積心肌壞死。再灌注組在6 h、12 h各病理表現均有較腦缺血組發生率增高的趨勢，但均無明顯差異性。腦缺血組繼發心肌損傷的總發生率為77.5%，再灌注組的為80%，兩組間總的心肌病理異常發生率無明顯差異性(P>0.05)。

表3　各組大鼠腦壞死面積占同側冠狀面積的比率

2.5心肌中CK-MB與ET-1/CGRP的相關性對所有樣本心肌中CK-MB與ET-1/CGRP進行相關性分析，結果顯示兩者在α=0.05水平相關(r=0.547 7，P<0.05)。

3　討　論

本研究結果說明腦缺血再灌注可減少腦缺血壞死的面積，對缺血的腦組織有保護作用，早期再灌注治療缺血性腦卒中有積極意義。

本研究中，腦缺血后血CK-MB濃度逐漸升高，于12 h達峰值，其后逐漸下降，同時心肌病理顯示心肌有炎性細胞浸潤、心內膜炎、肌纖維變性、灶性壞死等心肌損傷的病理改變。根據血CK-MB升高及心肌陽性病理改變說明大鼠腦缺血后繼發有心肌損傷。本實驗中腦缺血繼發心肌損傷的發生率為77.5%，可見MCAO易繼發心肌損傷，其發生率較高。本研究提示，腦缺血再灌注后使繼發的心肌損傷較單純腦缺血所繼發者加劇，這是臨床上腦缺血再灌注治療中不可忽視的問題。

ET和CGRP是一對血管舒縮功能調控作用完全相反的神經多肽，二者的動態平衡對維持心血管系統的正常生理功能具有極重要作用。ET中以ET-1作用最強，ET-1是強有力的內源性血管收縮肽，對動脈有強烈的收縮作用，且以冠脈最為敏感〔5〕，故ET-1對心臟氧供以負性作用為主。CGRP是一種由降鈣素基因表達的含37個氨基酸殘基的生物活性多肽，是迄今發現的體內最強的舒血管神經肽，廣泛分布于神經和心血管系統，對全身血管有不同程度的擴張作用，尤對腦、心血管的作用更為顯著，并有拮抗ET的作用〔6〕。

本研究提示腦缺血后心肌ET-1產生增多，心肌CGRP產生減少，ET-1、CGRP參與腦缺血后繼發心肌損傷的過程。急性腦缺血可作為一種應急原而引起機體產生全身性應激反應，心血管系統是應激反應的主要效應器官，其應激反應主要由交感-腎上腺髓質系統介導。腦缺血后心肌ET-1升高機制可能與腦缺血后出現全身應激反應、心臟血管內皮細胞受損、高濃度的茶堿對ET-1誘導作用等有關〔7〕。升高的心肌 ET-1與心肌細胞上的ETA 受體結合親和力強，使心肌細胞鈣超負荷，引起鈣介導的血管平滑肌和心肌收縮，抑制心肌能量代謝，促進血管活性物質釋放等，從而導致心肌損傷，使血中CK-MB升高。腦缺血后CGRP也應相應增加以拮抗ET的作用，但由于CGRP降解速度快，加之ET過度增加從而導致CGRP降低。研究表明，用CGRP灌注離體大鼠缺血心臟可明顯減輕心肌細胞損傷；CGRP可拮抗內皮素作用，抑制鈣內流，減輕心肌損傷〔8〕。腦缺血后心肌ET-1含量增高，CGRP含量降低造成以ET-1占優勢的ET-1與CGRP的平衡失調，CGRP對心肌組織保護作用減弱，ET-1對心肌負性作用增強，引起冠脈收縮和心肌低灌注狀態，從而引起心肌損傷。

本研究結果提示腦缺血再灌注后使繼發的心肌損傷較單純腦缺血所繼發者加劇，故考慮再灌后心肌損傷加重與心肌ET-1合成釋放明顯增多、CGRP明顯減少、ET-1/CGRP比例明顯失調有關。再灌后應激反應加劇、自由基增多、鈣超載、炎癥細胞激活、血管內皮細胞損害加重等可引起心肌ET-1合成釋放明顯增多、CGRP明顯減少。心肌中高濃度的ET-1通過使冠脈強烈收縮、對心臟組織直接毒性作用等作用來加劇對心肌的損傷。心肌CGRP明顯減少，其對心肌組織的保護作用明顯減弱，因而心肌損傷愈發嚴重。

本研究顯示在大鼠腦缺血后，血清CK-MB的動態變化與心肌ET-1的變化相一致，心肌ET-1和心肌CGRP變化呈相反趨勢，心肌中CK-MB與ET-1/CGRP有顯著性相關。這結果進一步表明，腦缺血后繼發心肌損傷的嚴重程度與心肌ET-1升高程度、CGRP下降程度有關，腦缺血后心肌 ET-1 和 CGRP在心肌損傷中作用是相反的。

腦缺血后可繼發心肌損傷，腦缺血再灌注后使繼發的心肌損傷加劇，這是臨床上腦缺血治療中不可忽視的問題。本研究為腦缺血后再灌注繼發心肌缺血損傷機制提供了相關的理論依據，提示在腦缺血后及時調節體內ET-1與CGRP水平，降低心肌ET-1含量，同時提高CGRP合成以調節兩者平衡，可降低腦缺血/再灌注后繼發心肌損傷，尚需臨床上進一步試驗證實。

1鞏固，袁利邦，黃怡，等.LRG在脂多糖預處理誘導大鼠腦保護效應中的作用研究〔J〕.實用醫學雜志，2012；28(2)：187-9.

2張忱，李剛，徐亞萍，等.大鼠局灶性腦缺血再灌注模型的再灌注時間窗〔J〕.中日友好醫院學報，2000；4(5)：256-8.

3Kuluz JW，Prado RJ，Dletrich D，etal.The effect of nitric oxide synthase on infarct volume after reversible focal ischemia in conscious rats〔J〕.Stroke，1993；24：2023.

4Zarow GJ，Karibe H，Staes BA，etal.Endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in rats：effect of suture insertion distance on cerebral blood flow infarct distribution and infarct volume〔J〕.Neruol Res，1997；19(3)：409-16.

5Greenberg DA，Chan J，Sampson HA.Endothelins and the nervous system〔J〕.Neurology，1992；42(1)：25-7，42-5.

6Keith IM，Tjen-A-Looic S，Kraiczi H，etal.Three-week neonatal hypoxia reduces blood CGRP and cause persistent pulmonary hypretension rats〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2000；279(4)：1571-8.

7余維華，孫善全，汪克建，等.腦外傷后大鼠脊髓內去甲腎上腺素能神經元變化的研究〔J〕.中國危重病急救醫學，2007；19(6)：349-52.

8萬小華，譚道全.缺氧時大鼠降鈣素基因相關肽含量變化與心肌損傷關系探討〔J〕.江西醫學院學報，2003；43(2)：44.

〔2014-09-17修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

符少萍(1971-)，女，主治醫師，碩士，主要從事老年疾病防治研究。

R743

A

1005-9202(2016)15-3657-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.15.021

1中山大學孫逸仙紀念醫院急診科