脂聯素對帕金森病模型大鼠免疫炎癥及氧化應激的保護作用

胡　霞　陳方方　孔陳蘇

(新疆醫科大學第五附屬醫院神經內科，新疆　烏魯木齊　830011)

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脂聯素對帕金森病模型大鼠免疫炎癥及氧化應激的保護作用

胡霞陳方方孔陳蘇1

(新疆醫科大學第五附屬醫院神經內科，新疆烏魯木齊830011)

目的探討脂聯素(APN)對帕金森病(PD)模型大鼠免疫炎癥及自由基損傷的保護作用。 方法采用6-羥多巴胺單側損毀左側紋狀體建立PD大鼠模型，選取40只造模成功的大鼠隨機分為模型組和APN組各20只，APN組分別于第1、8、15天經鞘內注射人工合成的APN 60 μg/kg，模型組僅接受鞘內注射人工腦脊液。另取20只正常大鼠(僅行紋狀體定位而不注射6-羥多巴胺)作對照。分別于治療前及治療1、2、3 w后進行旋轉行為學及自主活性觀察，檢測各組治療3 w后損毀側紋狀體的炎性因子〔腫瘤壞死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1β和IL-6〕、氧化應激相關指標〔丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和過氧化氫酶(CAT)〕及神經遞質〔多巴胺(DA)、二羥基苯乙酸 (DOPAC)和高香草酸 (HVA)〕水平，免疫組化法檢測損毀側紋狀體的酪氨酸羥化酶 (TH)水平。結果與對照組相比，模型組治療前后的旋轉圈數均升高，自主活動次數降低(P<0.05)；模型組和APN組治療前旋轉圈數和自主活動次數無顯著差異，但APN組治療后的旋轉圈數和自主活動次數均優于模型組(P<0.05)，且APN組各時間點旋轉圈數和自主活動次數均有顯著差異(P<0.05)。與對照組相比，模型組的炎性因子及MDA含量升高，SOD、GSH-Px和CAT活性、神經遞質水平及TH陽性細胞數均降低(P<0.05)；APN處理后可改善PD大鼠的以上異常指標(P<0.05)，與對照組的仍有統計學差異(P<0.05)。結論APN對PD大鼠紋狀體免疫炎癥及自由基損傷具有保護作用，可能與改善損毀側紋狀體的神經遞質水平有關。

脂聯素；帕金森病；免疫炎癥；自由基損傷；神經遞質

新近研究發現炎癥反應在帕金森病(PD)疾病進展中可能發揮重要作用〔1〕。此外，PD黑質內可見內源性氧自由基堆積，不僅加重了腦組織損傷，同時在一定程度上加速了黑質多巴胺神經受損，繼而導致進行性退變〔2〕。脂聯素(APN)是一種由脂肪組織分泌的活性物質，除調節糖脂代謝外還具有多種生物活性〔3～5〕。此外，李芹等〔6〕發現APN具有神經保護作用，可改善大鼠腦缺氧灌注損傷。APN能否改善PD大鼠的癥狀、免疫炎癥及氧化應激反應，目前尚未見報道，本研究擬探討APN處理對PD大鼠損毀側紋狀體免疫炎癥及氧化應激的影響。

1　材料與方法

1.1主要試劑及儀器重組球形APN購自瑞士Enzo Life Sciences公司，腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6和IL-1β的酶聯免疫吸附(ELISA)檢測試劑盒購自美國RD公司，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒均購自南京建成生物工程公司，過氧化氫酶(CAT)試劑盒購自碧云天生物科技公司，酪氨酸羥化酶(TH)抗體購自美國Santa Cruz公司；儀器：小動物腦立體定位儀及套管針(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)、1200型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)和5430R型冷凍離心機(德國Eppendorf公司)。

1.2動物與分組選取體重為200～220 g的成年雄性SD大鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司)，采用6-羥多巴胺單側損毀左側紋狀體建立PD大鼠模型，選取40只造模成功的大鼠隨機分為模型組和APN組各20只，APN組分別于第1、8、15天鞘內注射人工合成的APN 60 μg/kg，模型組僅接受鞘內注射人工腦脊液。另取20只正常大鼠(僅行紋狀體定位而不注射6-羥多巴胺單)作對照。本實驗中所用大鼠飼養于SPF級環境下，可自由攝食、飲水，溫度控制(22±1)℃，相對濕度為50%～10%，明暗交替 12 h/12 h。

1.3PD模型大鼠的建立采用戊巴比妥鈉麻醉后，將大鼠頭部固定在立體定位以上，正中切口切開顱頂皮膚，暴露前囟后，以前囟為準，參照Paxinos和Watson鼠腦立體定位圖譜進行紋狀體立體，具體坐標：前囟前1.0 mm，正中線左側3.0 mm，硬膜下4.0/5.0 mm。兩點分別注射2.5 μl和3 μl的6-羥多巴胺(3.6 mg/ml)，每次注射后留針5 min，緩慢將微量注射器拔出。造模后21 d腹腔注射5 ml/kg阿樸嗎啡以誘發旋轉行為，以30 min內轉速>210 r為造模成功。

1.4旋轉行為學觀察每組各選取8只大鼠，分別于治療前及治療1、2、3 w后進行旋轉行為學觀察，采用腹腔注射阿樸嗎啡以誘發旋轉行為，每次觀察時間為30 min，連續觀察2～3次，最終結果取30 min內轉圈數的均值。

1.5自主活動觀察每組各選取8只大鼠，分別于治療前及治療1、2、3 w后將其放入自主活動箱內，采用自動記錄儀記錄大鼠的自主活動次數，最終結果表示為10 min內的活動次數。

1.6紋狀體的炎性因子及活性物質檢測每組取8只大鼠，于治療3 w后采用頸椎脫臼法處死，將損毀側紋狀體取出，經液氮處理后充分研磨，高速離心后采用BCA法檢測上清液蛋白水平，采用相關試劑盒檢測損毀側紋狀體的TNF-α、IL-1β、IL-6和MDA水平及SOD、GSH-Px和CAT活性。最終結果表示為每mg單位蛋白對應的各指標水平。

1.7神經遞質檢測將1.6制備的損毀側紋狀體勻漿液，經超聲破碎后離心，采用0.22 μm濾膜過濾后，取50 μl待測，采用1200型高效液相色譜儀檢測多巴胺(DA)、二羥基苯乙酸(DOPAC)和高香草酸(HVA)水平。

1.8免疫組化于末次行為學觀察結束后，每組取6只大鼠，頸椎脫臼法處死后取腦組織，經修剪后，低溫下冰凍切片機行冠狀切片，片厚10 μm，隔5張取1只，依次經抗原修復、封閉、加TH一抗、二抗、辣根酶標記、顯色、復染、脫水及二甲苯透明后，在高倍顯微鏡下觀察TH的陽性表達情況，計算每個組織的TH陽性表達率，操作步驟完全遵循免疫組化試劑盒說明書。

1.9統計學處理采用SPSS19.0軟件行t檢驗、單因素分析。

2　結　果

2.1APN對PD大鼠旋轉行為學的影響與對照組(設為0)相比，模型組治療前后的旋轉圈數均升高(P<0.05)；模型組和APN組治療前旋轉圈數無統計學差異(P>0.05)，APN組治療后均少于模型組(P<0.05)，且隨著治療時間的延長而逐漸降低(P<0.05)。見表1。

表1　各組大鼠治療前后的旋轉圈數比較

與對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；下表同

2.2APN對PD大鼠自主活動的影響與對照組相比，模型組治療前后的自主活動次數均降低(P<0.05)，主要表現活動明顯減少、肢體震顫、反應震顫、偏斜、弓背、后肢騷擾、躁動及激惹等異常行為；模型組和APN組治療前自主活動次數無統計學差異(P>0.05)，APN組治療后均多于模型組(P<0.05)，且隨著治療時間的延長而逐漸升高(P<0.05)。見表2。

表2　各組大鼠治療前后的自主活動次數比較,次/10 min,n=8)

2.3APN對PD大鼠損毀側紋狀體炎性因子含量的影響與對照組相比，模型組損毀側紋狀體的TNF-α、IL-1β和IL-6含量升高(P<0.05)；APN組含量低于模型組，但高于對照組(P<0.05)。見表3。

2.4APN對PD大鼠損毀側紋狀體神經遞質水平的影響與對照組相比，模型組損毀側紋狀體的DA、DOPAC和HVA水平均降低(P<0.05)；APN組均高于模型組，且對照組比較差異顯著(P<0.05)。見表4。

表3　各組大鼠損毀側紋狀體的炎性因子含量比較

表4　各組大鼠的損毀側紋狀體神經遞質水平比較

2.5APN對PD大鼠損毀側紋狀體氧化應激相關指標的影響與對照組相比，模型組損毀側紋狀體的MDA水平升高，但SOD、GSH-Px和CAT活性均降低(P<0.05)；APN組MDA水平低于模型組，SOD、GSH-Px和CAT活性均高于模型組(P<0.05)，且與對照組比較差異顯著(P<0.05)。見表5。

表5　各組大鼠的損毀側紋狀體的氧化應激相關指標比較±s,n=8)

2.6APN對PD大鼠損毀側紋狀體TH表達的影響對照組、模型組和APN組的損毀側紋狀體TH陽性表達率依次為(56.21±12.78)%、(16.74±3.29)%和(38.44±6.11)%，三組差異顯著(P<0.05)。

3　討　論

PD是一種常見的老年神經系統退行性疾病，主要表現為靜止性震顫、僵直及姿勢障礙等，DA的主要病因為中腦黑質多巴胺能神經元喪失和紋狀體的DA濃度降低，故多巴替代療法是PD的首選方法，但隨著治療時間的延長，藥效減弱直至完全失效〔1〕，故除補充多巴類制劑外，還應聯合其他有效的手段，以緩解PD進展。目前研究認為，氧化應激及炎性反應均參與了PD的發病過程。多項研究表明緩解炎癥反應及改善氧化應激均可有效緩解PD癥狀并延緩進展〔7～9〕，而APN有確切的抗感染、抗氧化作用。本研究采用經典的紋狀體注射6-羥多巴胺的方法制備PD模型〔10,11〕，結果顯示APN可改善PD大鼠的癥狀，且APN對PD進展有較好的延緩效果。

PD發生發展中的氧化應激主要與氧自由基清除系統缺陷有關，造成紋狀體中大量的氧自由基堆積，不僅會通過氧化生物膜上的不飽和脂肪酸造成重要細胞器結構和功能損傷，而且會生成大量的過氧化物來損傷腦組織〔10〕。氧化應激主要表現為氧化物增多及氧化物酶活性降低。本研究表明PD大鼠出現了內源性的氧自由基堆積，與相關研究的結果一致〔2,7〕。另外APN治療可能需要更大的劑量或聯合其他手段才能發揮更好的效果。Fang等〔11〕發現APN可通過AMPK和cAMP來緩解血管緊張素誘導的腎小管細胞氧化應激，本研究推測APN也可能通過AMPK和cAMP途徑來發揮對PD氧化應激的改善作用。

炎癥介導的神經毒性是PD發病及進展的重要因素，而炎癥因子可通過級聯反應來誘導神經細胞死亡，故緩解炎癥反應對于PD的治療有重要意義〔12〕。前炎癥細胞因子在維持神經系統上發揮重要作用，當神經系統受到損傷性刺激或小膠質細胞活化時，會釋放大量的前炎癥細胞因子，來損害黑質DA神經元功能，最終參與了PD的病變過程〔13〕。本研究表明APN可降低PD大鼠的炎癥反應，繼而起到對黑質紋狀體DA神經元的保護作用。

神經遞質在維持神經元功能上發揮了重要作用〔14〕。本研究提示APN對PD大鼠紋狀體免疫炎癥及自由基損傷具有保護作用，可能與改善損毀側紋狀體的神經遞質水平有關，在PD防治中有較好的價值。

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〔2015-12-11修回〕

(編輯滕欣航)

孔陳蘇(1973-)，女，副主任醫師，主要從事運動障礙性疾病、神經系統變性病研究。

胡霞(1974-)，女，副主任醫師，碩士，主要從事運動障礙性疾病、神經系統變性病研究。

R749

A

1005-9202(2016)15-3662-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.15.023

1新疆鄯善縣人民醫院