子宮頸癌不同放療方式的療效及耐受機制

張　莉　張　凡

(河北省宣化縣人民醫院，河北　張家口　075000)

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子宮頸癌不同放療方式的療效及耐受機制

張莉張凡1

(河北省宣化縣人民醫院，河北張家口075000)

目的探討調強及盆野放療對晚期子宮頸癌的治療效果及耐受機制。方法選取2006年1月至2012年1月在河北省宣化縣人民醫院婦產科住院子宮頸鱗狀細胞癌晚期患者75例，婦科門診活檢病理確診，隨機分成實驗組37例(調強放療)和對照組38例(盆野照射放療)，療程結束后觀察盆腔CT、彩色B型超聲等相關指標在不同時間的變化，同時利用免疫組化對病理活檢標本進行檢測CD133、膠質瘤相關癌基因同源物-1(Gli1)的表達情況。結果①放療3個月實驗組完全緩解率(CR)與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。6個月、12個月后實驗組CR+部分緩解率(PR)明顯高于對照組(P<0.05)；早期并發癥兩組差別無統計學意義(P>0.05)；晚期并發癥實驗組明顯少于對照組。②CD133陽性表達率為66.7%(50/75)，陽性細胞主要分布在子宮頸鱗狀細胞癌的外層5～6層細胞(即腫瘤浸潤前沿)，而中央區陽性細胞較少且分散；Gli1陽性表達率為70.7%(53/75)，陽性細胞圍繞新生血管周圍較為明顯，浸潤前沿分布較為分散且呈弱表達。CD133陽性表達與子宮頸鱗狀細胞癌的組織分化程度、宮旁浸潤、放療耐受相關，在中低分化、宮旁浸潤組以及放療耐受組存在高表達，與相應組別間存在明顯差異(P<0.05)；Gli1陽性表達與腫瘤直徑、盆腔腫大淋巴結、放療耐受相關，在直徑>4 cm、存在盆腔腫大淋巴結組以及放療耐受組存在高表達，與相應組別間存在明顯差異(P<0.05)。③CD133、Gli1陽性表達的相關分析顯示兩者存在直線正相關(r=0.563 1，P<0.05)。結論①調強適形放療技術應用于晚期子宮頸癌患者近期療效明顯好于常規盆腔放療，遠期并發癥較少。②子宮頸鱗狀細胞癌中存在干細胞標記物CD133、Gli1的表達，與子宮頸鱗狀細胞癌的宮旁浸潤、淋巴結轉移等危險因素相關，且可能是其放療耐受的主要因素。

宮頸鱗狀細胞癌；放射治療；調強放療；耐受

晚期子宮頸鱗狀細胞癌主要的治療手段是放療，盆腔放療是傳統治療手段，調強放射治療提高了腫瘤區劑量，降低了正常組織的受照劑量，降低了患者不良反應，放療耐受的影響因素較多，研究顯示腫瘤干細胞是放化療耐受的根源，其自我更新、分化、耐藥等特性導致腫瘤局部復發和遠處轉移。CD133是多種腫瘤干細胞的標記物，膠質瘤相關癌基因同源物(Gli)1是Hedgehog信號通路的關鍵因子，對維持組織干細胞核膠質瘤干細胞增殖和自我更新所必需。在子宮頸癌中有無表達以及與放療耐受關系未見報道。本實驗通過檢測兩種因子的表達，探討腫瘤干細胞在子宮頸鱗狀細胞癌中的分布規律以及在放療耐受中的作用機制。

1　資料與方法

1.1臨床資料本組75例子宮頸癌病例均放療前經病理活檢診斷明確，均為鱗狀細胞癌，無肺臟、肝臟、腦等遠處器官轉移。隨機分成兩組，觀察組(調強放射治療組)37例，對照組38例(盆野放療組)，年齡39～62〔平均(51±8.4)〕歲。高分化26例，中分化32例，低分化17例。通過CT加強掃描及磁共振(MRI)獲得子宮頸癌實體瘤臨床病理資料，其中浸潤子宮頸內肌層(低于1/2肌層)45例，外肌層(大于1/2肌層)30例，宮旁浸潤陽性35例，無宮旁浸潤40例，存在盆腔腫大淋巴結32例，無淋巴結腫大43例，腫瘤最大直徑≤4 cm共42例，>4 cm共33例。Ⅱ期30例，Ⅲ期24例，Ⅳ期21例。

1.2臨床治療及實驗檢測方法

1.2.1子宮頸活檢確診及免疫組化檢測CD133、Gli1鼠抗人單克隆抗體均購于福建邁新生物技術有限公司，DAKO公司生產，進口分裝型，工作濃度1∶50～1∶200。 采用常規S-P法，各步驟間嚴格控制時間和溫度，每次染色均設置陽性及陰性對照。主要步驟：二甲苯脫蠟、梯度酒精至水，3%過氧化氫溶液滅活內源性過氧化酶，磷酸鹽緩沖液(PBS)振洗，微波爐進行抗原熱修復，正常山羊血清封閉、一抗冰箱過夜，二抗 、三抗各1 h，二氨基聯苯胺(DAB)顯色10～15 min，復染核脫水透明，中性樹膠封片。結果判斷：著色細胞<10%為陰性，≥10%為陽性。CD133陽性物質位于細胞膜、Gli1陽性物質位于細胞質。

1.2.2調強放療方法將76%的泛影葡胺20 ml稀釋于800 ml純凈水中，于CT掃描前1 h囑患者口服，并囑患者憋尿保證膀胱充盈，腸管顯影，并給予陰道填浸潤76%泛影葡胺薄紗條。掃描前制作腹腔的體位固定膜，掃描時靜脈注射碘海醇100 ml，進行影像對比增強。掃描范圍自第3腰椎上緣至坐骨結節下5 cm，掃描層厚間隔均為5 μm。掃描圖像經局域網傳輸至放療計劃設計系統Varian工作站。

靶體積及危及器官：逐層在CT層面勾畫大體腫瘤體積(GTV)包括子宮、子宮頸、陰道等原發腫瘤區域及腫大淋巴結；臨床靶體積(CTV)包括盆腔淋巴引流區域(包括髂總、髂外、髂內、閉孔、陰道上1/2及陰道旁軟組織)。CTV的上界在腹主動脈分叉處，下界在閉孔下緣或實體腫瘤下緣下3 cm；在CTV基礎上外放0.5～1.0 cm形成計劃靶區(PTV)；同時勾畫危及器官(OARS)：小腸、直腸、膀胱、股骨頭。

治療計劃設計：采用Varian加速器6 MV X線，所有計劃均在Varian工作站完成，采用7個野照射，角度分別為0°、50°、100°、150°、210°、260°、310°。要求95%等劑量曲線包繞PTV，99%等劑量曲線包繞GTV，CTV酌情給予46～50 Gy，GTV酌情給予52～58 Gy，并同時配合腔內治療。

1.2.3盆腔野放療方法經模擬機定位，上界：L5上緣水平；下界：閉孔下緣(陰道受侵下界為腫瘤下緣3 cm)；外界：髂最寬處外1.5～2.0 cm。給予全盆野DT 30 Gy后，四野照射DT20 Gy，并配合腔內治療35～509 Gy。

1.3觀察指標放療前后查血常規、肝腎功能、腫瘤標志物、心電圖、胸部X線片，盆腔CT或彩色B型超聲，放療后3、6、12個月復查盆腔CT、彩色B型超聲比較腫瘤大小變化。

1.4療效及不良反應評價標準結束后根據世界衛生組織(WHO)標準進行放療療效分析：完全緩解(CR，所見腫瘤完全消失并至少維持4 w以上)；部分緩解(PR，腫瘤病灶的最大直徑及最大垂直徑乘積減少50.0%以上，維持4 w以上)；無變化(NC，腫瘤病灶的兩徑乘積減少小于50.0%或增大25.0%以下，無新灶出現)；進展加重(PD，腫瘤病灶的兩徑乘積增大25%以上或出現新病灶)。不良反應按WHO腫瘤治療毒性反應標準評價。

1.5統計學方法采用SPSS11.0軟件行χ2及t檢驗。

2　結　果

2.1放療療效放療3個月觀察組CR 35例，PR 1例，對照組CR 32例，PR 3例，兩組CR率(97.2% vs 92.1%)比較差異無統計學意義(χ2=2.479 1,P>0.05)。6個月后復查觀察組CR 32例、PR 1例、PD 1例，對照組CR 24例、PR 2例、PD 5例、死亡1例，兩組緩解率CR+PR(89.1% vs 68.4%)，兩組比較差異(χ2=12.489 4,P<0.05)；12個月后復查觀察組CR 21例、PR 10例、PD 1例，對照組CR 13例、PR 10例、PD 6例、死亡1例，緩解率(83.8% vs 60.5%)，兩組緩解率比較差異顯著(χ2=14.670 2,P<0.05)。

2.2放射治療并發癥放射治療并發癥分為早期并發癥及晚期并發癥。早期并發癥多表現為外陰炎、胃腸道反應、直腸反應，觀察組與對照組差異無統計學意義(P>0.05)，晚期并發癥分為皮膚及皮下組織的改變、放射性腸炎及放射性膀胱炎的發生，觀察組均未出現，而對照組放療半年后皮膚變硬，色素沉著發生率為31.6%(12/38)，放射性腸炎發生率為26.3%(10/38)。

2.3CD133、Gli1表達以及與臨床病理參數的關系CD133陽性表達率為66.7%(50/75)，陽性細胞主要分布在子宮頸鱗狀細胞癌的外層5～6層細胞(即腫瘤浸潤前沿)，而中央區陽性細胞較少且分散；Gli1陽性表達率為70.7%(53/75)，陽性細胞圍繞新生血管周圍較為明顯，浸潤前沿分布較為分散且呈弱表達。CD133陽性表達與子宮頸鱗狀細胞癌的組織分化程度、宮旁浸潤、放療耐受相關，在中低分化、宮旁浸潤組以及放療耐受組存在高表達，與相應組別間存在明顯差異(P<0.05)；Gli1陽性表達與腫瘤直徑、盆腔腫大淋巴結、放療耐受相關，在直徑>4 cm、存在盆腔腫大淋巴結組以及放療耐受組存在高表達，與相應組別間存在明顯差異(P<0.05)。見表1。

表1　CD133、Gli1陽性表達與臨床病理參數的關系(n)

與其他亞組比較：1)P<0.05

2.4CD133、Gli1陽性表達的相關分析CD133、Gli1在宮頸鱗狀細胞癌中的陽性表達間存在直線正相關(r=0.563 1，P<0.05)。

3　討　論

晚期子宮頸癌由于侵犯的范圍很難手術徹底切除病變組織，放療成為晚期子宮頸癌的有效治療手段之一。常規盆腔放射治療區域常包含小腸、直腸、膀胱，為了防止這些臟器的放射劑量超標，治療技師対放射范圍和承受最大劑量進行限制，這樣腫瘤區放射劑量的也相應受到限制。調強適形放療采用逆行計劃系統，通過調整多個照射野內的強度分布，得到高度適形的靶區三維劑量分布，從而可在不增加甚至減少周圍正常組織受照劑量前提下，達到增加靶區劑量，提高治療增益比的目的〔1～3〕。調強適形放療可以有效地把腫瘤靶區與鄰近敏感器官分隔開照射不同的劑量強度，從而高效地提高腫瘤控制率而最大限度減少敏感器官的照射劑量，同時，由于調強放療的劑量分布特點是處方劑量區緊貼靶區表面，高劑最區下降迅速，因此，小腸、膀胱、直腸接收到高劑量照射的體積顯著下降，從而有效地降低了放療并發癥的發生，較常規放療減輕了患者放療并發癥的痛苦及經濟負擔，明顯提高了生存質量。本實驗結果說明調強放療在達到較好治療效果的同時，通過變換照射野角度，降低鄰近臟器的放療劑量達到避免遠期并發癥的作用。調強放療是替代常規放療治療晚期子宮頸鱗狀細胞癌的新的有效手段。

盡管如此仍有部分患者出現放療耐受，目前有關放療耐受的機制主要是腫瘤局部微環境的乏氧狀態持續存在，而具有自我更新、多項分化潛能的腫瘤干細胞的存在對放化療的耐受成為研究的熱點。CD133是較為廣泛表達的干細胞標記物，具有獨特的5個跨膜結構域和2個大的N-糖基化細胞外環的跨膜糖蛋白，被認為人類造血干細胞的特異性表面抗原。最近的研究顯示，直腸癌術前放化療增加直腸癌細胞CD133的表達〔4〕。研究證實子宮頸鱗狀細胞癌的干細胞來自CK7陽性表達的子宮頸上皮儲備細胞，感染人乳頭狀瘤病毒(HPV)后這些細胞成為腫瘤細胞，主要分布在子宮頸鱗狀細胞癌的浸潤前沿〔5，6〕。本文推測宮頸鱗狀細胞癌干細胞自我更新特性促使其逃避放射線的攻擊，同時促血管新生進一步加劇腫瘤不同區域的缺氧狀態，可能直接導致放療耐受。

Hedgehog-Pat/SMO-Gli信號轉導通路是一條十分保守的信號通路，該通路在動物的胚胎發育、組織分化等生命過程中調控著細胞分化與增殖，新近研究顯示該通路在腫瘤的發生中同樣發揮著重要的作用，且與腫瘤的侵襲轉移關系密切〔7，8〕。Gli蛋白分子在腫瘤研究中受到廣泛的關注。脊椎動物中存在3種Gli核轉錄因子Gli1、Gli2、Gli3，均可直接與靶基因啟動子的特定序列(5′-TGGGTGGTC-3′)結合，Gli1僅具有轉錄激活功能，而Gli2、Gli3具有激活與抑制的雙重活性。Gli調控的靶基因包括調節細胞增殖和分化的CyclinD1、CyclinD2、血管生成相關基因VEGF，表皮細胞-間質細胞轉化相關基因CXCR4、Snail1、Sip1、Elk1和Msx2及細胞侵襲相關基因Osteopontin等。Gli1的表達水平可以直接反映Hedgehog信號(HH)通路的活性狀態。本文發現食管鱗狀細胞癌組織中Gli1蛋白表達與腫瘤浸潤程度及淋巴結轉移相關。Rodova等〔9〕報道前列腺癌的Gli1增加異位表達可以使其轉移活性由低向高轉化，siRNA技術干擾Gli1蛋白表達可以控制前列腺癌細胞增殖，并促使其凋亡。本實驗說明子宮頸鱗狀細胞癌中Gli1的表達與血管新生密切相關，微血管密度增加導致腫瘤進展，體積增大伴隨臨床分期增加，同時新生血管的結構不成熟導致腫瘤局部乏氧，促進腫瘤放療耐受；微血管密度增加的同時也增加了宮旁浸潤、淋巴結轉移的風險，因此陽性表達組盆腔淋巴結轉移率明顯高于陰性組。

干細胞生存所需的微環境稱niche，其中Hedgehog信號途徑對干細胞的增殖生存是必需的，研究顯示Hedgehog信號調節膠質Hedgehog母細胞瘤、乳腺癌、胰腺癌、多發性骨髓瘤，慢性粒細胞白血病中腫瘤干細胞的生存，且Hedgehog-Gli信號是維持成熟神經干細胞和CD133+神經膠質瘤增殖和自我更新所必需的〔10，11〕。我們實驗結果顯示CD133、Gli1的陽性表達間存在正相關，說明Gli1通過維持子宮頸鱗狀細胞癌中干細胞的生存導致腫瘤的惡性進展和放療耐受。

1Chéreau E，Feron JG，Ballester M，etal.Contribution of pelvic and para-aortic lymphadenectomy with sentinel node biopsy in patients with ⅠB2-ⅡB cervical cancer〔J〕.Br J Cancer,2012；106(1)：39-44.

2Sanuki N，Urabe S，Matsumoto H，etal.Evaluation of microscopic tumor extension in early-stage cervical cancer：quantifying subclinical uncertainties by pathological and magnetic resonance imaging findings〔J〕.J Radiat Res,2013；54(4)：719-26.

3Patil VM，Patel FD，Chakraborty S，etal.Can point doses predict volumetric dose to rectum and bladder：a CT-based planning study in high dose rate intracavitary brachytherapy of cervical carcinoma〔J〕.Br J Radiol,2011；84(1001)：441-8.

4Johannes Fredebohm，Michael Boettcher，Christian Eisen，etal.Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival〔J〕.Cancer Res,2011；71(11)：3991-4001.

5Ebben JD，Treisman DM，Zorniak M，etal.The cancer stem cell paradigm：a new understanding of tumor development and treatment〔J〕.Exp Opin Ther Targets,2010；14(6)：621-32.

6Lin SP，Lee YT，Wang JY，etal.Survival of cancer stem cells under hypoxia and serum depletion via decrease in PP2A activity and activation of p38-MAPKAPK2-Hsp27〔J〕.PLoS One,2012；7(11)：e49605.

7Heddleston JM，Hitomi M，Venere M，etal.Glioma stem cell maintenance：the role of the Microenvironment〔J〕.Curr Pharm Des,2011；17(23)：2386-401.

8Singh A，Park H，Kangsamaksin T，etal.Keratinocyte stem cells and the targets for non-melanoma skin cancer〔J〕.Photochem Photobiol,2012；88(5)：1099-110.

9Rodova M，Fu J，Watkins DN，etal.Sonic hedgehog signaling inhibition provides opportunities for targeted therapy by sulforaphane in regulating pancreatic cancer stem cell self-renewal〔J〕.PLoS One,2012；7(9)：e46083.

10Varnat F，Duquet A，Malerba M，etal.Human colon cancer epithelial cells harbour active HEDGEHOG-GLI signalling that is essential for tumour growth，recurrence，metastasis and stem cell survival and expansion〔J〕.EMBO Mol Med,2009；1(6-7)：338-51.

11Tang SN，Fu JS，Nall D，etal.Inhibition of sonic hedgehog pathway and pluripotency maintaining factors regulate human pancreatic cancer stem cell characteristics〔J〕.Int J Cancer,2012；131(1)：30-40.

〔2014-12-03修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

張凡(1968-)，男，碩士，主任醫師，碩士生導師，主要從事腫瘤病理研究。

張莉(1982-)，女，主治醫師，主要從事婦科腫瘤研究。

R711.74

A

1005-9202(2016)15-3742-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.15.061

1河北北方學院附屬第一醫院