通心絡對同型半胱氨酸誘導大鼠心肌微血管內皮細胞損傷的干預作用及氧化應激機制研究

位庚，劉紅利，李紅蓉，馬柳一，尹玉潔，姚兵，賈振華

通心絡對同型半胱氨酸誘導大鼠心肌微血管內皮細胞損傷的干預作用及氧化應激機制研究

位庚，劉紅利，李紅蓉，馬柳一，尹玉潔，姚兵，賈振華

目的：探討通心絡對同型半胱氨酸誘導大鼠心肌微血管內皮細胞損傷的干預作用及氧化應激機制。

方法：采用植塊法原代培養大鼠心肌微血管內皮細胞，倒置顯微鏡觀察細胞形態并通過CD31免疫熒光法對培養的大鼠心肌微血管內皮細胞進行辨別、鑒定。用同型半胱氨酸（Hcy）建立細胞損傷模型，實驗分為對照組、同型半胱氨酸組、通心絡低濃度組、通心絡中濃度組、通心絡高濃度組。分別檢測各組細胞的存活率、細胞上清液中超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量、細胞內活性氧（ROS）水平、內皮素-1（ET-1）和內皮型一氧化氮合酶（eNOS）表達水平的變化。

結果：與對照組相比，同型半胱氨酸組細胞存活率降低 ［（74.61±2.88）% vs（100.00±2.07）%］，細胞上清液中MDA含量升高［（4.10±0.18）nmol/ml vs（1.92±0.10）nmol/ml］，SOD活性降低［（7.55±0.71）U/ml vs（20.77±0.68）U/ml］，細胞內ROS水平升高［（38.17±10.28）% vs（19.83±2.97）%］，ET-1 mRNA表達上調，eNOS蛋白表達下調；與同型半胱氨酸組相比，通心絡各劑量組均能不同程度的改善上述指標變化。

結論：通心絡能夠改善同型半胱氨酸誘導的大鼠心肌微血管內皮細胞的功能損傷，并通過減輕氧化應激損傷發揮細胞保護作用。

通心絡；心肌微血管內皮細胞；同型半胱氨酸；內皮功能；氧化應激

Abstract

Objective: To observe the effect of Tongxinluo （TXL） on homocysteine-induced rat’s cardiac micro vascular endothelial cell（RCMECs） injury and to study the oxidative stress mechanism.

Methods: Primary RCMECs were cultured with tissue explants process， cell morphology was observed by inverted microscope and the cell was identified by CD31 immunofluorescence method. RCMEC injury model was established by Homocysteine （Hcy）induction and the cells were divided into 5 groups: Control group， with normal cells， Hcy group， the cells were treated by Hcy at 10 mmol/L， Low-dose TXL group， Hcy treated cells were cultured with TXL at 100 mg/L， Middle-dose TXL （200 mg/L）group and high-dose TXL （400 mg/L） group. Cell survival rates were detected， supernatant levels of superoxide dismutase （SOD）activity and malondialdehyde （MDA） content were examined， intracellular protein expressions of reactive oxygen species （ROS）and endothelial nitric oxide synthase （eNOS） were detected and mRNA expression of endothelin-1 （ET-1） was measured in different groups respectively.

Results: Compared with Control group， Hcy group showed decreased cell survival rate （74.61 ± 2.88）% vs （100.00 ± 2.07）%， increased supernatant level of MDA （4.10 ± 0.18） nmol/ml vs （1.92 ± 0.10） nmol/ml， reduced SOD activity （7.55 ± 0.71） U/ml vs（20.77 ± 0.68） U/ml， elevated ROS level（38.17 ± 10.28） % vs （19.83 ± 2.97） %， up-regulated mRNA expression of ET-1 and down-regulated protein expression of eNOS. Compared with Hcy group， the above indexes were improved in each TXL group at different levels.

Conclusion: TXL could decrease Hcy induced RCMECs injury， such protection was conducted by reducing the oxidative stress mechanism in cells.

（Chinese Circulation Journal， 2016，31: 908.）

同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）是誘發動脈粥樣硬化的獨立危險因素，它可以通過誘導血管壁氧化應激反應而導致內皮細胞功能障礙［1］，這可能是Hcy導致動脈粥樣硬化的機制之一。中藥復方制劑通心絡在脈絡學說理論指導下對心血管疾病的防治具有調脂、抗氧化、抗炎，改善內皮功能、穩定易損斑塊等多種作用，臨床療效明顯［2］。我們課題組前期的動物實驗證實了通心絡可明顯改善Hcy誘發的血管內皮細胞功能障礙，可能與其抑制自由基的過量生成有關［3］。為了進一步觀察通心絡的保護機制，本研究采用Hcy誘導原代培養的大鼠心肌微血管內皮細胞（Rat cardiac microvascular endothelial cells，RCMECs）為損傷模型，觀察Hcy對心肌微血管內皮細胞的損傷機制，并探討通心絡對微血管內皮細胞的保護作用和作用機制，以期為動脈粥樣硬化的機制研究和臨床治療提供理論依據。

1　材料與方法

實驗動物：2周齡SPF級SD雄性大鼠10 只，體重（30±5）g，由北京富豪實驗動物養殖中心提供，實驗動物許可證號：SCXK（京）2011-0012。大鼠心肌微血管內皮細胞由大鼠心室肌分離提取，連續傳4代用于實驗。

藥物及試劑：通心絡藥粉由石家莊以嶺藥業股份有限公司提供；內皮細胞（ECM）培養套裝購自美國Sciencell公司；CCK-8細胞增殖-毒性檢測測試盒購自日本同仁化學研究所；丙二醛測試盒、超氧化物歧化酶測試盒和活性氧簇測試盒均購自江蘇南京建成生物工程研究所；反轉錄試劑盒、實時定量反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）試劑盒購自美國Fermentas公司；CD31抗體、內皮型一氧化氮合酶（eNOS）抗體、DyLight 488標記的羊抗小鼠IgG抗體購自美國Abcame公司；內皮素-1（ET-1）引物購自上海生工生物公司。

主要儀器：PrimoVert倒置顯微鏡購自德國Zeiss公司； Operetta高通量高內涵細胞分析系統購自美國PerkinELmer公司；FACSAriaⅢ超速流式細胞分選系統購自美國BD公司；ABI 7300實時 PCR 系統購自美國ABI公司；UVP凝膠掃描系統購自美國UVP公司；電轉膜儀、半干轉膜儀、垂直電泳儀購自美國Bio-Rad公司。

藥物配制：稱取通心絡藥粉溶于無血清ECM培養基，超聲促溶20 min，6500 g，離心10 min，收集上清液，用0.22 μm微孔濾器過濾除菌，將所得所有沉淀于60℃加熱烘干，計算實際溶于無血清ECM培養基藥物重量，制備成10 mg/ml通心絡貯存液，分裝后-20℃貯存備用［4］。

原代大鼠心肌微血管內皮細胞分離、培養：采用植塊法分離和培養原代RCMECs，參照文獻［5］的方法提取RCMECs，待細胞培養至80 %匯合狀態，以0.25%胰蛋白酶消化傳代，取第2～4代用于實驗。

原代大鼠心肌微血管內皮細胞鑒定：首先倒置顯微鏡下觀察細胞形態，其次CD31作為微血管內皮細胞的標志物，它參與了調節微血管內皮細胞間的連接穩定性和完整性［6］，故本實驗采用細胞免疫熒光法檢測RCMECs胞膜上CD31的表達對細胞進行鑒定。將原代培養的細胞消化后，接種于96孔板中，約1～2 d后細胞生長鋪滿皿底，棄上清，4%多聚甲醛固定10 min，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗3次，0.5% Trition X-100 孵育細胞5 min；磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次后用封閉液室溫封閉細胞30 min；加入1:200稀釋的CD31一抗孵育，4 ℃過夜，DyLight 488標記的熒光二抗1:200稀釋室溫避光孵育1 h，甘油封片后高通量高內涵細胞分析系統檢測CD31表達。

細胞分組及處理：（1）對照組：細胞正常培養；（2）同型半胱氨酸組：培養液含10 mmol/L Hcy；（3）通心絡低濃度組：通心絡預孵育4 h，終溶液Hcy 10 mmol/L加通心絡100 mg/L；（4）通心絡中濃度組：通心絡預孵育4 h，終溶液Hcy 10 mmol/L加通心絡200 mg/L；（5）通心絡高濃度組：通心絡預孵育4 h，終溶液Hcy 10 mmol/L加通心絡 400 mg/L。

CCK-8法檢測大鼠心肌微血管內皮細胞存活率［7］：取對數生長期的RCMECs以1.0×108/L的細胞濃度接種于96孔培養板中，每組3個復孔，每孔加入100 μl 細胞懸液培養24 h 后用于實驗。5組細胞于37℃、5%CO2培養箱中繼續孵育24 h，吸棄培養基，加入含有CCK-8的無血清培養基100 μl（CCK-8溶液：無血清培養基=1：10），37℃、5%CO2培養箱中繼續孵育1 h， 酶標儀檢測450 nm波長處光密度（OD）值。以對照組OD值作為參照，以其他各組OD值與對照組OD值比值進行統計分析。

羥胺法及TBA法檢測細胞上清中超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量［8］：藥物相應處理細胞24 h后收集細胞上清液，羥胺法檢測SOD活性，于波長550 nm處，雙蒸水調零，酶標儀檢測OD值，按說明書上給出的公式計算出SOD活性；TBA法檢測MDA含量，于532 nm處，雙蒸水調零，酶標儀檢測OD值，按說明書上給出的公式計算出MDA含量，實驗操作步驟嚴格按照說明書進行。

流式細胞儀檢測細胞中活性氧（ROS）水平：藥物相應處理細胞24 h后棄去上清，PBS清洗細胞兩次，按照1:10000濃度用無血清ECM培養基稀釋DCFH-DA，37℃、5%CO2培養箱中繼續孵育30 min，0.25%的胰酶消化2 min，加入培養基終止消化，制成細胞懸液，350 g離心5 min收集細胞，用PBS洗滌細胞2次后，流式細胞儀檢測。

RT-PCR檢測細胞內皮素-1（ET-1）mRNA的表達：各組細胞相應處理24 h后，Trizol試劑提取總RNA。用紫外分光光度計檢測總RNA完整性及純度，并用M-MLV逆轉錄酶系統和隨機引物逆轉錄。以β-肌動蛋白（β-actin）作為內參照基因，分別與各組相比，得到目的基因表達的相對定量值（RQ值），將RQ值用于統計分析，引物序列見表1。

表1　引物序列

蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測細胞eNOS蛋白的表達：各組細胞相應處理24 h后，將細胞充分裂解，超聲破碎后蛋白定量，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉膜后封閉，與eNOS一抗結合，4℃過夜，與二抗結合，化學發光法檢測，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內參，以各目的蛋白灰度值與GAPDH灰度值的比值進行分析。

統計學方法：采用SPSS19.0統計軟件進行數據分析，組間比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1大鼠心肌微血管內皮細胞的形態及鑒定結果（圖1）

植塊法分離的RCMECs培養至第2～3天時，可見未融合狀態下單個微血管內皮細胞呈梭形、星型或多角形，去除組織塊繼續培養至第5天時，可見細胞匯合成鋪路石樣。CD31免疫熒光鑒定結果顯示所提取的大鼠心肌微血管內皮細胞純度大于95%。

圖1　 大鼠心肌微血管內皮細胞的形態及鑒定結果（×200）

2.2通心絡對同型半胱氨酸損傷大鼠心肌微血管內皮細胞存活率的影響（表2）

與對照組比較，同型半胱氨酸組細胞存活率顯著降低（P＜0.01）；與同型半胱氨酸組比較，通心絡高濃度組細胞存活率顯著增高（P＜0.01）。

2.3通心絡對同型半胱氨酸損傷大鼠心肌微血管內皮細胞上清液SOD活性和MDA含量的影響（表2）

與對照組比較，同型半胱氨酸組細胞上清液SOD活性降低（P＜0.01），MDA含量升高（P＜0.01）；與同型半胱氨酸組相比，通心絡低濃度組、通心絡中濃度組及通心絡高濃度組細胞上清液SOD活性升高（P＜0.01），通心絡中濃度組及通心絡高濃度組細胞上清液MDA含量降低（P＜0.01）；與通心絡低濃度組比較，通心絡高濃度組細胞上清液SOD活性升高（P＜0.05），通心絡中濃度組及通心絡高濃度組細胞上清液MDA含量降低（P＜0.01）；與通心絡中濃度組比較，通心絡高濃度組細胞上清液MDA含量降低（P＜0.01）。

2.4通心絡對同型半胱氨酸損傷大鼠心肌微血管內皮細胞ROS水平的影響（表2、圖2）

流式細胞儀檢測細胞內活性氧探針DCFH-DA熒光強度，在以下流式結果圖中，X軸代表了相對熒光強度，Y軸代表了細胞數目，所以峰值越靠右，則表明了在相同數目（10 000個）的細胞樣本中熒光強度越大，而P2門的位置是固定的，所以P2門中樣本的比例越大，則代表熒光強度越高。與對照組比較，同型半胱氨酸組ROS熒光強度升高（P＜0.05）；與同型半胱氨酸組比較，通心絡高濃度組ROS熒光強度降低（P＜0.05）。

表2　各組大鼠心肌微血管內皮細胞存活率、細胞上清液超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量及細胞內活性氧水平比較（n=3，±s）

表2　各組大鼠心肌微血管內皮細胞存活率、細胞上清液超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量及細胞內活性氧水平比較（n=3，±s）

注：與對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與同型半胱氨酸組比較△P＜0.05，△△P＜0.01；與通心絡低濃度組比較▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與通心絡中濃度組比較#P＜0.01

活性氧（%）對照組　100.00±2.07　20.77±0.68　1.92±0.10　19.83±2.97同型半胱氨酸組　74.61±2.88**　7.55±0.71**　4.10±0.18**　38.17±10.28*通心絡低濃度組　82.11±7.84　17.31±1.29△△　3.90±0.15　33.83±9.41通心絡中濃度組　83.10±7.19　19.11±1.30△△　3.50±0.16△△▲▲　30.90±9.83通心絡高濃度組　90.03±3.59△△　19.64±0.89△△▲　2.26±0.13△△▲▲#　22.50±3.66△組別　　存活率（%）超氧化物歧化酶（U/ml）丙二醛（nmol/ml）

圖2　流式細胞儀檢測各組大鼠心肌微血管內皮細胞活性氧熒光強度

2.5通心絡對同型半胱氨酸損傷大鼠心肌微血管內皮細胞ET-1 mRNA表達的影響（表3）

與對照組比較，同型半胱氨酸組ET-1 mRNA表達升高（P＜0.01）；與同型半胱氨酸組比較，通心絡低濃度組、通心絡中濃度組及通心絡高濃度組ET-1 mRNA表達降低（P＜0.01）。

表3　各組大鼠心肌微血管內皮細胞內皮素-1 mRNA及內皮型一氧化氮合酶蛋白表達比較

表3　各組大鼠心肌微血管內皮細胞內皮素-1 mRNA及內皮型一氧化氮合酶蛋白表達比較

注：eNOS： 內皮型一氧化氮合酶；GAPDH： 甘油醛-3-磷酸脫氫酶。與對照組比*P＜0.01；與同型半胱氨酸組比較△P＜0.01；與通心絡低濃度組比較▲P＜0.01；與通心絡中濃度組比較#P＜0.05

組別　　內皮素-1 mRNA　eNOS灰度值/GAPDH灰度值對照組　1.03±0.19　0.74±0.03同型半胱氨酸組　3.33±0.62*　0.21±0.03*通心絡低濃度組　1.71±0.24△　0.35±0.03△通心絡中濃度組　1.44±0.23△　0.43±0.03△▲通心絡高濃度組　1.21±0.21△　0.48±0.02△▲#

2.6通心絡對同型半胱氨酸損傷大鼠心肌微血管內皮細胞eNOS蛋白表達的影響（表3、圖3）

與對照組比較，同型半胱氨酸組eNOS蛋白表達降低（P＜0.01）；與同型半胱氨酸組比較，通心絡低濃度組、通心絡中濃度組及通心絡高濃度組eNOS蛋白表達升高（P＜0.01）；與通心絡低濃度組比較，通心絡中濃度組及通心絡高濃度組eNOS蛋白表達升高（P＜0.01）；與通心絡中濃度組比較，通心絡高濃度組eNOS蛋白表達升高（P＜0.05）。

圖3　 各組大鼠心肌微血管內皮細胞內皮型一氧化氮合酶蛋白表達水平蛋白免疫印跡圖

3　討論

目前的研究認為內皮細胞損傷是導致動脈粥樣硬化的始動因素之一，Hcy是動脈粥樣硬化形成的獨立危險因素，它可以引起血管內皮細胞發生氧化應激，炎癥反應，使血管內脂質代謝紊亂，促進血管平滑肌細胞增殖等［9，10］。通心絡是在中醫絡病理論指導下研制而成的中藥復方制劑，主要由人參、全蝎、水蛭、土鱉蟲、蟬蛻、降香、冰片等中藥組成，具有益氣、活血、化瘀通絡等功效。通心絡已廣泛用于心腦血管疾病的治療，大量實驗證實其對于微血管具有明顯的保護作用，在保護微血管內皮細胞及其功能方面更顯示出其獨特的優勢［11，12］。我們前期的動物實驗也證實通心絡可以抑制自由基的過量生成改善Hcy誘導的內皮細胞損傷，而且通心絡能導致Hcy損傷的人臍靜脈內皮細胞的基因表達譜改變，這些基因改變可能參與了細胞凋亡和氧化應激等過程［13］。所以本研究通過Hcy誘導體外培養的RCMECs損傷，用通心絡進行藥物干預，進一步探討其保護微血管內皮細胞的作用及氧化應激機制。

一氧化氮（NO）為內皮細胞合成的主要舒血管物質，參與維持血管的正常張力、抑制血小板黏附，防止血栓的形成，發揮積極的心血管保護作用。它的前體是L-精氨酸，由一氧化氮合酶催化合成，NOS有三種類型，內皮細胞中存在的是eNOS。Hcy可抑制eNOS的合成和活性，抑制L-精氨酸的轉運，導致eNOS的脫偶聯，從而減少NO的生成。ET具有強烈的收縮血管作用，主要由內皮細胞合成和釋放，其表達的異常及伴隨的內皮功能障礙是血管病理學的一個重要早期事件。生理狀態下，內皮細胞分泌的舒血管物質和縮血管物質在局部維持一定的濃度比，互相制約，保持動態平衡。當內皮細胞受到損傷時，其分泌的舒血管因子就會減少，縮血管因子增多，可誘發高血壓、AS等疾病。本研究結果顯示，經Hcy損傷后，RCMECs的eNOS蛋白表達下調，同時ET-1 mRNA表達上調，ET/NO間的動態平衡被破壞，可引起內皮細胞的舒縮功能發生障礙。通心絡各給藥組干預后，eNOS蛋白表達上調，ET-1 mRNA表達下調，均以通心絡高濃度組改善效果最佳，且呈劑量依賴性，表明通心絡能夠從基因和蛋白水平有效改善Hcy誘導的內皮細胞功能障礙。

Hcy代謝過程中產生過氧化氫自由基、羥自由基，而誘導氧化應激反應，降低內皮細胞NO釋放，減弱內皮依賴性的血管舒張反應［14］，所以Hcy可通過其誘導的氧化應激介入AS的病理生理過程，并可以加劇內皮細胞的功能障礙。SOD是清除自由基的主要防御酶，能清除超氧陰離子自由基（O2-·）保護細胞免受損傷［15］，其活力的高低間接反應了機體清除氧自由基的能力，而MDA是細胞被自由基攻擊，經細胞壁破裂和細胞膜脂降解形成的最終裂解產物，間接反應了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度［16］，ROS是氧元素在體內氧化還原反應的產物，其表達量過多導致的氧化應激可直接導致血管內皮細胞的氧化損傷和功能障礙，ROS還作為信號分子放大和疊加損傷作用［17，18］，所以三者聯合檢測可更好的反映氧化應激程度。本研究結果顯示，Hcy組細胞上清中MDA含量及ROS水平升高，細胞上清中SOD活性降低，表明Hcy誘導的細胞損傷存在著明顯的氧化應激反應。通心絡不同濃度干預后，細胞上清中SOD活性和MDA含量及細胞中ROS水平均有不同程度的改善，其中通心絡高劑量組改善作用最為明顯。

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WEI Geng， LIU Hong-li， LI Hong-rong， MA Liu-yi， YIN Yu-jie， YAO Bing， JIA Zhen-hua.
Graduate School of Hebei Medical University， Shijiazhuang （050017）， Hebei， China
Corresponding Author: JIA Zhen-hua， Email: jiatcm@163.com

Tongxinluo； Cardiac micro vascular endothelial cells； Homocysteine； Endothelial function； Oxidative stress

2016-04-05 ）

（編輯:許菁）

國家重點基礎研究發展計劃（973計劃）（2012CB518606）

050017 河北省石家莊市，河北醫科大學 研究生學院

位庚 主治醫師 博士 主要從事心血管疾病的研究 Email：weigengtcm@163.com 通訊作者：賈振華 Email：jiatcm@163.com

R54

A

1000-3614（2016）09-0908-05 doi:10.3969/j.issn.1000-3614.2016.09.019