利用合成多肽制備兔多克隆抗體

譚鳳彪，高家林，陸曉華，章　堯

(1.皖南醫學院　生物化學教研室,安徽　蕪湖　241002；2.皖南醫學院　活性生物大分子研究安徽省重點實驗室,安徽　蕪湖　241002；3.皖南醫學院　機能學實驗中心,安徽　蕪湖　241002；4.皖南醫學院第一附屬醫院 弋磯山醫院　內分泌科,安徽　蕪湖　241001)

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·基礎醫學·

利用合成多肽制備兔多克隆抗體

譚鳳彪1，2，高家林2,4，陸曉華3，章堯1,2

(1.皖南醫學院生物化學教研室,安徽蕪湖241002；2.皖南醫學院活性生物大分子研究安徽省重點實驗室,安徽蕪湖241002；3.皖南醫學院機能學實驗中心,安徽蕪湖241002；4.皖南醫學院第一附屬醫院 弋磯山醫院內分泌科,安徽蕪湖241001)

目的：利用人工合成多肽制備載脂蛋白M(appliprotein M，ApoM)兔多克隆抗體。方法：分析并選取一段特異性的ApoM氨基酸序列用于合成多肽，并耦聯鑰孔血藍蛋白(KLH)，用來免疫雄性的新西蘭大白兔，經過多次加強免疫后用收集的兔抗血清制備多克隆抗體，并進行Western Blot檢測。結果：利用人工合成并純化的多肽，經多次免疫后獲得所需的多克隆抗體。結論：成功制備了兔ApoM多克隆抗體，為后續的實驗研究ApoM的功能提供實驗基礎。

載脂蛋白M；多肽；多克隆抗體

載脂蛋白M (apolipoprotein M,ApoM)是由徐寧等[1]人在研究富含甘油三酯脂蛋白(triglyceride-rich lipoprotein，TGRLP)時發現的一種不同于以往的脂蛋白轉運蛋白類蛋白，優勢表達于HDL中，少量表達于TGRLP 及LDL 中。人類ApoM基因定位于6號染色體短臂(6p21.3)，鄰接MHCⅢ區域，含有6個外顯子和5個內含子，系單拷貝基因。人類ApoM cDNA (734 bp) 編碼一種含188 個氨基酸殘基的蛋白質，相對分子量約26 kU，結構與Lipocalin 家族相關聯。多組織表達列陣研究顯示[2]，ApoM表達具有高度的組織特異性，人ApoM特異表達于肝臟和腎臟，在胚胎、胚腎、胃、骨骼肌細胞、小腸、心臟、大腦、脾臟和睪丸中也有低表達，在肌肉組織、十二指腸和卵巢中無表達，具有較高的組織特異性，這提示ApoM的生理功能可能與肝臟和腎臟的功能密切相關[3]。ApoM在HDL中含5%，是HDL的主要成分之一，成人血漿ApoM含量約為0.63～1.13 mmol/L。ApoM主要與HDL相互作用，促進HDL顆粒的成熟并調節其代謝[1]。目前的研究發現ApoM具有抗動脈粥樣硬化作用，與冠心病和糖尿病的發生密切相關,已成為研究的熱點[4-6]。細胞核因子-1α(HNF-1α)可提高ApoM的表達水平，對心血管具有保護作用,是通過促進膽固醇代謝關鍵酶的表達并抑制膽固醇代謝相關抑制因子的生成進而促進膽固醇的轉化來實現的。新的研究發現，ApoM通過對血管內皮細胞的1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate，S1P)受體提供S1P充當HDL的血管保護成分[7-8]。在研究蛋白質的功能和診斷檢測方面，抗體是一種重要的研究工具。為進一步探明ApoM的功能，我們設計并合成人工多肽，通過免疫新西蘭大白兔，制備ApoM兔多克隆抗體，為后續研究奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料抗原多肽由上海生工全自動合成儀合成，完全福氏佐劑(complete Freund′s adjuvant，CFA)、不完全福氏佐劑(incomplete Freund′s adjuvant，IFA)，丙烯酰胺，購自Sigma公司；放射免疫沉淀技術(radioimmunopreciptation assay，RIPA)裂解液、二辛可寧酸(bicinchonininc acid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒、loading buffer，辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG(H+L)和羊抗鼠IgG(H+L)抗體均購自碧云天公司，ApoM單克隆抗體購自CST(Cell Signaling Technology)公司，Ladder(10-170 kU)購自Pierce 公司，聚偏二氟乙烯(polycinylidene fluoride，PVDF)膜購自Bio-RAD公司，化學發光試劑盒購自賽默飛公司，其他試劑均為國產分析純。雄性健康8周齡新西蘭大白兔2只(每只2.5 kg左右)購自南京大學-模式動物研究所，動物實驗得到皖南醫學院弋磯山醫院動物倫理委員會的批準。

1.2方法

1.2.1ApoM特征性抗原肽段的合成根據ApoM基因編碼的氨基酸序列，利用在線蛋白分析軟件對ApoM蛋白信號肽、親水性和抗原性進行分析，確定抗原肽段氨基酸序列，由上海生工合成并偶聯KLH，合成后的總量為10 mg，置于4℃保存備用。

1.2.2合成多肽的溶解和分裝多肽的溶解性很大程度上取決于多肽的極性。酸性蛋白溶解于堿性溶液，而堿性蛋白可溶解于酸性溶液，含有大量不帶電荷的極性氨基酸殘基或疏水性氨基酸的疏水性多肽和中性多肽可采用少量有機溶劑如二甲基亞砜(DMSO)溶解，然后再用PBS稀釋。但是含有甲硫氨酸或半胱氨酸的多肽不能用DMSO溶解，因為DMSO可能造成側鏈氧化。耦聯了KLH的人工合成多肽顆粒，在溶解前先加入DMSO到多肽粉末中，方法是1 mg多肽溶于200～300 μL的DMSO，然后加PBS補足至1 mL，這樣所得多肽溶液的濃度是1 mg/mL，便于后續實驗取用。超聲處理有助于打碎顆粒并增加溶解度，但應注意降溫，避免超聲處理引起溶液發熱和多肽降解。溶解后的多肽分裝到凍存管中置于-20℃冰箱保存備用，避免反復凍融。

1.2.3抗原與佐劑的乳化取溶解后的多肽抗原1mL，加入等體積的佐劑，用2.5 mL注射器抽取液體后，注射器留存少量空氣，通過三通頭連接另一注射器，然后相互推動注射器的活塞，使抗原與佐劑相互混合[9]。當抗原和佐劑充分乳化后，滴一滴乳化后的液體在水面上，如果液體呈球形而不擴散，表示抗原與佐劑乳化完全。

1.2.4免疫兔子制備新西蘭大白兔(分別標記兔1、兔2)實驗前常規飼養1周，采用背部脊柱旁多點皮下注射的方法免疫。首次免疫采用CFA乳化抗原，兔1和兔2分別注射抗原乳化液800 μL(400 μg)和400 μL(200 μg)作為基礎免疫，分4～8點作皮丘注射。首次免疫前先于注射點備皮并用75%的乙醇消毒，預防感染。注射前排凈注射器內空氣后捏起兔子皮膚，按針頭與皮膚呈15°角進針，進針深度以1～2 cm為宜，不宜刺入肌肉。首次免疫后每2周加強免疫1次，加強免疫采用IFA乳化抗原，相較于首次免疫，加強免疫劑量減半。第3次免疫后通過耳緣靜脈采血1 mL，獲得抗ApoM血清，做Western Blot檢測。如果檢測到抗體后，于再次免疫1周后取血。

1.2.5免疫前后采血準備兩個5號醫用輸液針，從針頭后約2 cm處剪斷皮管備用。在助手協作下固定兔子，用手指輕彈其耳根部使血管充盈，采用乙醇消毒后，將輸液針頭插入耳部血管中，血液順著針管一滴滴流出，用離心管收集所需量血液后退出針頭，并用干棉球按壓止血。該方法操作簡單，每次取血量不超過8 mL，飼養一段時間后可反復取血。先將離心管置于37℃的恒溫箱中30 min，然后置于4℃冰箱中過夜，使其自然凝固，析出血清。以4000 r/min，4℃離心10 min，收集上清后分裝置于-80℃冰箱保存備用。

1.2.6 Western bIot檢測抗體①組織蛋白的處理。分別取野生型、雜合型和剔除型ApoM模型小鼠的肝臟組織，嚴格按RIPA試劑盒說明書操作法提取肝組織蛋白，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定提取蛋白濃度后，取適量蛋白樣品與上樣緩沖液按4∶1混勻，100℃金屬浴10 min后冷卻至室溫備用，其余樣品置于-80℃備用。②配制SDS-PAGE膠。按照制膠方案制備15%的分離膠和5%的濃縮膠。③采用SDS-PAGE方法檢測血清中ApoM的抗體。具體操作方法為每孔點樣金屬浴后的蛋白30 μg后電泳，100V恒壓轉膜70 min，標記蛋白面后將PVDF膜置于5%的脫脂奶粉中封閉1 h，以1∶500稀釋的兔抗血清作為一抗，用商業化的ApoM單克隆抗體作為對照，4℃孵育過夜。以1∶10 000稀釋的HRP標記的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG抗體作為二抗孵育1 h后洗膜，滴加發光液在多功能成像儀中檢測Western blot結果并分析。

2　結果

2.1ApoM多肽氨基酸序列分析利用在線蛋白分析軟件對ApoM蛋白氨基酸序列進行分析，并結合市場上利用多肽制備的成熟抗體所選擇的氨基酸序列，避免選擇蛋白內部重復或接近重復段的序列以及同源性太強的肽段作為抗原，以提高獲得抗體的特異性。經過對ApoM蛋白信號肽、親水性和抗原性分析，最終選擇ApoM蛋白氨基酸序的第106～120位氨基酸(ETRARLSKELQAAQA)作為合成多肽的序列，見圖1。

A為信號肽分析結果，位于19位氨基酸對應的c值最大，s值陡峭，y值最高峰，該處預測為信號肽的剪切位點。B為親水性分析結果，蛋白的親水部位與蛋白抗原表位有密切的聯系。C為抗原性分析結果，抗原肽段應選擇親水性和抗原性強的區域，并綜合參考各種參數。

圖1ApoM蛋白質性質分析結果

2．2抗原多肽的溶解和分裝取一個10 mL的離心管，加入6 mg多肽,滴加DMSO溶解后，加入PBS調至6 mL并混勻，然后分裝在6支凍存管中，每支1 mg/mL，便于后續實驗，置于-20℃冰箱保存備用，避免反復凍融，見圖2。

2．3ApoM多克隆抗體的檢測利用耦聯了KLH的ApoM多肽抗原免疫新西蘭大白兔，獲得兔抗血清。通過Western bIot檢測，ApoM剔除小鼠及野生型和雜合子小鼠肝組織中ApoM的表達，結果顯示在23 ku左右有一特異性條帶，結果與預測一致,商業化的ApoM單抗約為25 ku，如圖3所示。

A：向多肽粉末中加入DMSO，溶解多肽；B：用PBS定容至6 mL；C：將溶解后的多肽溶液分裝凍存管中，放-20℃冰箱保存備用。

圖2多肽的溶解和分類

A為免疫后兔抗血清的檢測結果，Lane1～2為野生型鼠，Lane3～4為雜合子鼠，Lane5～6為剔除鼠；B為商業化的ApoM單克隆抗抗的檢測結果，Lane1～2為野生型鼠，Lane3～4為剔除鼠。

圖3western blot檢測結果

3　討論

ApoM是一種新型的與脂蛋白相關的載脂蛋白，主要存在于高密度脂蛋白(HDL),ApoM可能影響HDL代謝和抗動脈粥樣硬化的功能，并與糖尿病等代謝性疾病關系密切。對ApoM 近啟動子側多態性位點研究發現，T-778C的單核苷酸多態性與 1 型糖尿病顯著相關；且T-778C與膽固醇水平相關，與2 型糖尿病的易感性有關，提示 ApoM 基因啟動子的 T-778C 可能參與了1型和2 型糖尿病的共同發病機制[6,10]。ApoM在冠心病發生發展扮演重要角色，促進HDL成熟，可逆轉動脈粥樣斑塊的形成，可能作為冠心病診斷與治療的新靶點。而在糖尿病的發病過程中，胰島素、血糖對ApoM調控的復雜機制以及ApoM與糖尿病的發病關聯還有待進一步實驗揭示。ApoM在腎臟組織中高表達，為腎巨蛋白配體，可阻止腎臟脂質分子的丟失，但是其在腎臟疾病中的作用尚少見報道，對于其在腎臟組織內的生理及病理作用有待進一步揭示。為進一步研究ApoM在上述疾病中的作用及其對信號通路的影響機制，我們采用人工合成并耦聯了KLH的ApoM多肽片段作為抗原，為了增強機體的免疫應答反應，采用佐劑和抗原混合免疫的方法。該方法可以刺激網狀內皮系統，通過增加免疫活性細胞來促進T細胞與B細胞的相互作用，進而增強抗體的產生。用乳化后的抗原免疫新西蘭大白兔，最終獲得兔多克隆抗體。免疫動物時，由于個體差異及不同抗原的最佳免疫劑量不同，過高或過低都無法獲得最佳的免疫效果。因此我們選擇兩只實驗兔子，分別注射采用不同劑量的抗原，以保證有一只兔子能產生最佳的免疫效果。采用人工合成多肽的方法制備抗原，與傳統原核表達目的蛋白制備的抗原相比，人工合成多肽純度高，且操作簡潔，所得抗體特異性強，靈敏度高，進一步節約制備抗體所用時間[11]。為進一步方便研究人員研究該分子在疾病中的作用提供便利的檢測基礎，同時也為探明ApoM信號傳導通路及機制提供有效的研究手段。

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Using synthetic peptide to prepare the rabbit anti-ApoM polyclonal antibody

TAN Fengbiao,GAO Jialin,LU Xiaohua,ZHANG Yao

Department of Biochemistry,Wannan Medical College,Wuhu 241002，China

Objective：To prepare rabbit anti-appliprotein M (ApoM) polyclonal antibody using synthetic peptides.Methods:Specific amino acid sequences of ApoM was initially synthesized and selected after analysis.Keyhole limpet hemocyanin (KLH) was used as carries in the conjugation of the peptides for antibody production.Then rabbit anti-ApoM polyclonal antibody was prepared using the serum obtained from male New Zealand white rabbits undergone repeatedly boosted immunization,and determined with Western blot.Results:The rabbit anti-ApoM polyclonal antibody was successfully prepared with artificially recombined and purified polypeptides.Conclusion:The rabbit anti-ApoM polyclonal antibody may lay a foundation for following experimental study of the ApoM expression.

appliprotein M;polypeptide;polyclonal antibody

1002-0217(2016)05-0422-04

蕪湖市科技局產學研項目(2013cxy04)；安徽省自然科學基金項目(1508085NH149)

2016-04-10

譚鳳彪(1984-)，男，2014級碩士研究生,(電話)13955375794，(電子信箱)253791056@qq.com；

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A

10.3969/j.issn.1002-0217.2016.05.004

章堯，男，教授，博士，碩士生導師，(電子信箱)zhangyao@ahedu.gov.cn，通信作者.