茶樹硝態氮轉運蛋白NRT1.1基因的克隆及表達分析

楊亦揚，胡雲飛，萬青，李榮林，王楓，阮建云

?

茶樹硝態氮轉運蛋白NRT1.1基因的克隆及表達分析

楊亦揚1,2，胡雲飛1，萬青1，李榮林1，王楓3，阮建云2*

1. 江蘇省農業科學院園藝研究所江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，江蘇南京 210014；2. 中國農業科學院茶葉研究所農業部茶樹生物學與資源利用重點實驗室，浙江杭州 310008；3. 南京農業大學園藝學院作物遺傳與種質創新國家重點實驗室，江蘇南京 210095

以茶樹（(L.)）品種龍井43為試材，采用PCR結合RACE技術，克隆得到硝態氮轉運蛋白基因（）的cDNA全長序列，基因序列全長1?880?bp，其中開放閱讀框（ORF）1?788?bp，編碼595個氨基酸，預測蛋白質分子量為65.9?kD，理論等電點為8.99，命名為。序列分析表明，與葡萄氨基酸序列的相似性最高。通過生物信息學分析，對的氨基酸理化性質、親/疏水性、跨膜區域及亞細胞定位進行了預測。實時定量PCR表達分析表明，茶樹根和葉片中在1?mol·L-1NO3-處理5?min內均受到抑制，葉部表達量0.5?h后即達到最大值，24?h內各個時間點均高于根部，根中表達量始終低于對照。本研究結果為研究茶樹對NO3-的吸收、轉運和調控機理提供了分子生物學基礎。

茶樹；硝態氮；基因；實時定量PCR

茶樹（(L.)）是原產中國的多年生木本植物，它以葉片為收獲目標，對氮素需求量較大。氮肥施用量與茶葉品質成分氨基酸、茶多酚含量密切相關，所以，氮肥是茶園中主要的肥料，通常占施肥總量的一半以上[1]。茶樹對不同氮源具有偏性吸收特性，對銨態氮的吸收量高于硝態氮的10倍以上，研究表明，造成這種差異的原因，主要在于吸收運載系統的差異[2-3]。故研究茶樹NO3-吸收、轉運和累積的機制，對于提高其NO3-的利用效率，從而提高茶樹氮素利用率，提高茶葉品質，具有重要的理論和現實意義。

硝態氮轉運蛋白（Nitrate transporters, NRTs）負責植物根系對NO3-的吸收和轉運，一直是植物營養領域研究的熱點之一。植物具有3個NO3-轉運系統，以適應外界不同的NO3-濃度。兩個高親和運載系統（High-affinity transport system, HATS），在低濃度NO3-的環境下發揮作用，而當外界NO3-的濃度較高時，植物通過低親和運載系統（Low-affinity transport system, LATS）進行NO3-的吸收[4-5]。目前，已證實擬南芥基因組有53個NRT1亞家族成員，7個NRT2亞家族成員[6-7]，水稻中NRT1亞家族成員有100多個，NRT2亞家族成員有6個[8]。

茶樹吸收利用氮素的生理特性已有研究，但對于氮吸收轉運蛋白特性的研究仍較為缺乏，對茶樹NRT2家族基因研究已有報道[9-10]，而茶樹NRT1家族分子水平研究還顯空白。本文對茶樹基因進行分離克隆，并對其表達特性進行研究，將為進一步研究茶樹NRTs在茶樹氮吸收轉運中的作用及是否與茶樹偏銨特性有關奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試茶樹品種為龍井43。采用兩年生龍井43扦插苗，挑選整齊一致的茶苗移栽至營養液中進行培養。無氮營養液基本組成為大量元素（mmol·L-1）：KH2PO4(0.03)，MgSO4(0.13)，CaCl2+Ca(NO3)2(0.27)，K2SO4(0.33)；微量元素（μmol·L-1）：H3BO3(3.33)，MnSO4(0.5)，ZnSO4(0.33)，CuSO4(0.07)，(NH4)6Mo7O24(0.17)，FeEDTA (2.10)。茶苗在上述營養液中培養1周后，移至光照培養箱（光照16?h/黑暗8?h、光照強度2?000?lx、溫度25℃、濕度80%），NO3-濃度為1?mmol·L-1的Ca(NO3)2溶液中進行NO3-吸收試驗，取未處理及處理5?min、0.5?h、1?h、2?h、4?h、8?h、12?h和24?h后的茶苗根和葉片作為提取總RNA的試驗材料。

1.2 RNA提取及cDNA合成

分別取0.1?g茶樹根和葉片，利用RNA simple Total RNA Kit（Tiangen，北京）提取茶樹總RNA，用1.0%變性瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，置于－80℃保存備用。用PrimeScript RT reagent Kit（TaKaRa，大連）將提取的總RNA反轉錄成cDNA。

1.3 CsNRT1.1基因的克隆

根據GenBank中擬南芥硝酸鹽轉運蛋白NRT1.1（At1g12110）基因序列，將它與茶樹轉錄組數據進行比對，獲取它在茶樹中的同源序列，并以此序列為參考，利用Primer 5.0設計RACE特異引物（表1），通過RACE技術，對茶樹的3′和5′端進行擴增，拼接出茶樹全長序列。最后，再設計特異引物，擴增出茶樹基因全長序列。以cDNA第1鏈為模板進行擴增，PCR反應條件為：94℃ 5?min，94℃ 30?s，54℃ 30?s，72℃ 60?s，30個循環；72℃ 10?min。反應產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳回收后，連接pMD18-T載體并轉化大腸桿菌DH5a，提取質粒經PCR鑒定為陽性的菌落進行測序。

表1 茶樹CsNRT1.1 cDNA克隆相關引物

1.4 序列生物信息學分析

利用NCBI進行開放閱讀框的查詢，通過BLAST進行同源性分析，用MEGA6構建系統進化樹；基因編碼蛋白的理化性質采用Protparam程序預測，疏水性/親水性預測分析通過ProtScale程序預測，跨膜結構域通過TMHMM服務器分析，亞細胞定位通過wolfpsort軟件進行預測。

1.5 表達模式分析

分別以茶苗的根、葉mRNA反轉錄成的cDNA為模板，采用定量PCR技術對不同處理時間茶樹基因的表達進行定量分析。以茶樹β-actin為內標基因，反應體系按照Power 2×SYBR Real-time PCR premixture使用說明書配制。25?μL體系：2.0?μL cDNA，12.5?μL 2×Premix，0.5?μL上、下游引物，0.5?μL ROX和9?μL ddH2O。PCR反應程序：95℃ 60?s，95℃ 10?s，60℃ 10?s，72℃ 30?s，40個循環。根據CT值分別計算出目標基因的相對表達量2–ΔΔT。

2 結果與分析

2.1 茶樹CsNRT1.1 cDNA全長序列的克隆及分析

以茶樹總cDNA為模板，以引物GSP3′RACER1、GSP3′RACER2進行3′-RACE，擴增出1條大小421?bp的片段（圖1-A）。以引物GSP5′RACER1、GSP5′RACER1，5′末端cDNA擴增方式擴增出大小350?bp序列（圖1-C）。利用引物NRT1.1F、NRT1.1R進行RT-PCR擴增，獲得了2?000?bp左右的片段（圖1-B）。測序分析表明，茶樹硝態氮轉運蛋白基因，序列全長為1?880?bp，含1?788?bp的開放閱讀框（ORF），編碼595個氨基酸，預測其蛋白質分子量為65.9?kD，理論等電點為8.99（圖2）。

注：M：DL2000；1：擴增產物；A：3′端產物；B：全長擴增產物；C：5′端產物。

注：方框內表示起始密碼子和終止密碼子，陰影部分為保守的蛋白激酶C的識別位點（S/T-X-R/K）。

將茶樹與GenBank中登錄的其他物種基因的氨基酸序列進行比對，利用Mega 6軟件，采用鄰位相近法分析繪制系統進化樹（圖3）。結果表明，茶樹與葡萄具有相對較高的同源性，氨基酸一致性分別為：芝麻80%、番茄77%、葡萄81%、野草莓80%、楊樹79%、橙80%、可可80%、桉樹80%、黃瓜76%、大豆74%。

注：XP_011081220：芝麻；XP_004245746：番茄；XP_002266951：葡萄；XP_004298652：野草莓；XP_002303512：楊樹；XP_006477230：橙；XP_007039888：可可；XP_010053448：桉樹；XP_001275529：黃瓜；XP_003517427：大豆。

2.2 茶樹CsNRT1.1編碼蛋白的生物信息學分析

2.2.1茶樹CsNRT1.1氨基酸序列的理化性質分析

利用在線分析軟件Protparam對CsNRT1.1所對應的氨基酸序列進行分析，結果表明，茶樹CsNRT1.1所對應的氨基酸數目為595個，分子量為65.9?kD，理論等電點為8.99，氨基酸組成如圖4所示。負電荷氨基酸殘基數為（Asp+Glu）40個，正電荷氨基酸殘基數為（Arg+Lys）49個。不穩定系數為32.96，為穩定蛋白，脂肪系數為101.92。總平均親水性為0.315。

2.2.2 茶樹CsNRT1.1疏水性/親水性預測分析

通過ProtScale程序繪制茶樹CsNRT1.1的親/疏水性序列譜，結果如圖5，甘氨酸（235位）分值最高，為3.511，谷氨酸（293位）分值最低，為－3.333，根據正值越大，疏水性越高；負值越小，親水性越高的規律判斷，茶樹CsNRT1.1的疏水性氨基酸較多，為疏水性蛋白。

注：橫向為氨基酸順序，由左向右；疏水和親水位點分別在零水平線的上方和下方。

2.2.3 茶樹CsNRT1.1跨膜區結構預測

利用TMHMM分析表明，該蛋白序列跨膜螺旋（TMhelix）區預測位置分別在41~63、78~100、107~129、149~171、192~214、218~240、340~362、380~402、423~442、462~484、505~527、547~569。從輸出的圖形文件中也可以明顯看到這12個跨膜螺旋區（圖6），其中，第6個和第7個跨膜結構域之間存在一個大的親水環。茶樹CsNRT1.1蛋白氨基酸N端和C端均處于細胞膜內部。

圖6 茶樹CsNTR1.1蛋白跨膜結構模式圖

2.2.4 茶樹CsNRT1.1亞細胞定位預測

采用軟件wolf psort對茶樹CsNRT1.1蛋白的亞細胞定位進行分析，結果顯示，茶樹CsNRT1.1蛋白在細胞質膜的得分最高，為10.0，液泡和細胞外得分均為2.0，推測其定位在細胞質膜上行使氮轉運的功能，為膜蛋白。

2.3茶樹CsNRT1.1基因表達模式分析

分別提取茶樹根和葉片中的mRNA進行實時熒光定量RT-PCR分析，結果如圖7所示。與對照相比，茶樹受NO3-處理5?min后根和葉的表達量均下降，尤其是根部，下降顯著。根部表達量始終低于對照，葉部表達量24?h內各個時間點均高于根部，半小時后即達到最大值。

3 討論

NRT1.1（CHL1）是植物中鑒定的第一個硝酸鹽轉運蛋白[11]，無論外界環境中NO3-濃度高低均可以發揮作用[12]，故成為研究的焦點，目前模式植物上仍在進行新的研究[13]。茶樹氮吸收轉運蛋白研究尚處于起步階段，NRT1.1的功能是否與其他作物中的一樣尚不明確。本文從龍井43茶樹中成功克隆了一個硝酸鹽轉運蛋白基因。Blast比對結果表明，基因核苷酸和氨基酸序列與其他植物的NRT1.1有較高的同源性。系統進化樹分析發現，它與葡萄等植物有較高的同源性，與黃瓜、大豆等作物關系相對較遠。

NRT1轉運蛋白一般含有450~600個氨基酸，并含有12個跨膜區，在第6和第7跨膜區之間有一個大的親水環[14]，本研究中，茶樹NRT1.1含有12個跨膜螺旋區，其中，第6個和第7個跨膜結構域之間存在一個大的親水環。且該蛋白為疏水性蛋白，可能定位在細胞質膜上，為膜蛋白，這與茶樹NRT1.2和NRT1.5的結果一致[9]，說明二者行使氮轉運功能的位置一致。

根據基因的表達是否受NO3-誘導可以將NRT基因分為誘導型和組成型兩大類[6]，實時定量結果表明，在茶樹根系和葉部開始吸收NO3-5?min內表達均受到抑制，說明茶樹為誘導型基因，且根部受抑制作用影響較大，葉片中影響較小。植物中很多基因可以在短時間內響應NO3-的處理[15-17]，并表現出一定的晝夜節律特征[18-19]。本研究吸收試驗處理從上午9：00開始，吸收12?h后，即到晚上9：00，黑暗情況下，根系和葉片中均降到了最低點，說明茶樹受光照影響。24?h動態追蹤結果表明，茶樹葉片中在0.5?h達到較高水平，而根部一直低于對照，沒有顯著增加。說明在不同組織部位中，吸收同化NO3-的機理可能存在差異，葉片對NO3-的處理響應更明顯。另外，不僅只作為硝酸鹽轉運蛋白，更可能是感受硝酸鹽的信號受體，它對茶樹其他硝酸鹽轉運蛋白、茶樹生長和發育的作用還需進一步研究和鑒定。

參考文獻

[1] Kamau D M, Spiertz J H J, Oenema O, et al. Productivity and nitrogen use of tea plantations in relation to age and genotype [J]. Field Crops Research, 2008, 108(1): 60-70.

[2] 杜旭華, 彭方仁. 無機氮素形態對茶樹氮素吸收動力學特性及個體生長的影響[J]. 作物學報, 2010, 36(2): 327-334.

[3] Yang Y Y, Li X H, Ratcliffe R G, et al. Characterization of ammonium and nitrate uptake and assimilation in roots of tea plants [J]. Russian Journal of Plant Physiology, 2013, 60(1): 91-99.

[4] Dechorgnat J, Nguyen C T, Armengaud P, et al. From the soil to the seeds: the journey of nitrate in plants [J]. Journal of Experimental Botany, 2010, 62(4): 1349-1359.

[5] Gojon A, Krouk G, Perrine-Walker F, et al. Nitrate transceptor(s) in plants [J]. Journal of Experimental Botany, 2011, 62(7): 2299-2308.

[6] Okamato M, Vidmar J J, Glass A D M. Regulation of NRT1 and NRT2 gene families of Arabidopsis thaliana: responses to nitrate provision [J]. Plant Cell Physiology, 2003, 44(3): 304-317.

[7] Orsel M, Krapp A, Daniel-Vedele F. Analysis of the NRT2 nitrate transporter family in Arabidopsis. Structure and gene expression [J]. Plant Physiology, 2002, 129(2): 886-896.

[8] Araki R, Hasegawa H. Expression of rice (L.) genes involved in high-affinity nitrate transport during the period of nitrate induction [J]. Breeding Science, 2006, 56(3): 295-302.

[9] 馮素花. 茶樹硝酸根轉運蛋白NRT1.2、NRT1.5和NRT2.5基因的克隆和表達[D]. 杭州: 中國農業科學院茶葉研究所, 2014: 24-25.

[10] 汪進, 添先鳳, 江昌俊, 等. 茶樹硝酸鹽轉運蛋白基因的克隆和表達分析[J]. 植物生理學報, 2014, 50(7): 983-988.

[11] Tsay Y F, Schroeder J I, Feldmann K A, et al. The herbicide sensitivity gene CHL1 of Arabidopsis encodes a nitrate- inducible nitrate transporter [J]. Cell, 1993, 72: 705-713.

[12] Wang R C, Liu D, Crawford N M. The Arabidopsis CHL1 protein plays a major role in high-affinity nitrate uptake [J]. Proceedings of the national academy of sciences, 1999, 95(25): 15134-15139.

[13] Anthony D M, Glass Z K. A reevaluation of the role of Arabidopsis NRT1.1 in high-affinity nitrate transport [J]. Plant physiology, 2013, 163: 1103-1106.

[14] Tsay Y F, Chiu C C, Tsai C B, et al. Nitrate transporters and peptide transporters [J]. FEBS Letters, 2007, 581: 2290-2300.

[15] Wang R C, Okamoto M, Xing X J, et al. Microarray analysis of the nitrate response in Arabidopsis roots and shoots reveals over 1000 rapidly responding genes and new linkages to glucose, trehalose-6-phosphate, iron, and sulfate metabolism [J]. Plant Physiology, 2003, 132(2): 556-567.

[16] Wang R C, Xing X J, Crawford N M. Nitrate acts as transcriptome signal at micromolar concentrations in Arabidopsis roots [J]. Plant Physiology, 2007, 145(4): 1735-1745.

[17] 孔敏, 楊學東, 侯喜林, 等. 白菜NRT2基因的克隆及表達模式分析[J]. 園藝學報, 2011, 38(12): 2309-2316.

[18] Cardenas-Navarro R, Adamowicz S, Robin P. Diurnal nitrate uptake in young tomato (Mill) plants: test of a feedback-based model [J]. Journal of Experimental Botany, 1998, 49(321): 721-730.

[19] 徐海榮, 谷俊濤, 路文靜, 等. 水稻硝酸鹽轉運蛋白基因的編碼蛋白特征和表達[J]. 作物學報, 2007, 33(5): 723-730.

Cloning and Expression Analysis of Nitrate Transporter NRT1.1 Gene in Tea Plant ((L.))

YANG Yiyang1,2, HU Yunfei1, WAN Qing1, LI Ronglin1, WANG Feng3, RUAN Jianyun2*

1. Institute of Horticulture, Jiangsu Academy of Agricultural Science, Jiangsu Key Laboratory for Horticultural Crop Genetic Improvement, Nanjing 210014, China; 2. Tea Research of Institute, Chinese of Academy of Agricultural Science, Key Laboratory of Tea Biology and Resources Utilization, Ministry of Agriculture, Hangzhou 310008, China; 3. College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing 210095, China

A full length cDNA sequence of Nitrate transport gene () was obtained from tea plant ((L.)) cultivar ‘Longjing 43’ by polymerase chain reaction (PCR) and rapid amplification of cDNA ends PCR (RACE-PCR). The length of nucleotide sequence of this gene was 1?880?bp, containing a complete open reading frame (1?788?bp) to encode 595 amino acids. The putative protein had an isoelectric point of 8.99 and a calculated molecular weight of 65.9?kD.was highly homologous to the geneby sequence alignment. Several parameters of these sequences, including sequences composition, physicochemical property, topological structure of transmembrane regions, hydrophobicity or hydrophilicity, subcellular localization were predicted by bioinformatics tools. Quantitative real-time PCR analysis showed that the expression ofin roots and leaves were inhibited after incubation in 1 mol·L-1NO3-for 5?min. The expressions oferealways lower than thatof CKwithin 24?h.Its expressions in leaves were higher than those in roots with its peak at 0.5?h.Our results provides favorably help to reveal NO3-uptake and utilization in tea plants.

, nitrate,,RT-PCR

S571.1；Q51

A

1000-369X（2016）05-505-08

2016-04-25

2016-05-27

國家自然科學基金（31400587）、江蘇省自然科學基金（BK20160590）、茶樹生物學與資源利用國家重點實驗室開放基金（SKLTOF20150114）、江蘇省農業科技自主創新資金（CX(16)1003）。

楊亦揚，女，博士，副研究員，主要從事茶樹生理與營養研究。

jruan@mail.tricaas.com