天津地區奶牛乳房炎葡萄球菌的分離鑒定及藥敏試驗

文/馬騰宇　陳麗麗　汪　志　白娜仁吐雅

天津地區奶牛乳房炎葡萄球菌的分離鑒定及藥敏試驗

文/馬騰宇1陳麗麗2汪志3白娜仁吐雅3

（1天津食品集團有限公司；2天津市奶牛發展中心；3天津嘉立荷畜牧有限公司）

通過血平板培養、革蘭氏染色、生化鑒定試驗，對天津地區由葡萄球菌引起的奶牛乳房炎進行分離鑒定，并對其進行耐藥性分析。結果顯示，采集199 份奶樣中共檢出葡萄球菌53 株，其中金黃色葡萄球菌40 株、表皮葡萄球菌13 株；檢出的葡萄球菌對頭孢噻肟、環丙沙星、恩諾沙星、丁胺卡那霉素高度敏感，可以用以上4 種抗生素對由葡萄球菌引起的奶牛乳房炎進行治療。

奶牛；乳房炎；葡萄球菌；藥敏試驗

奶牛乳房炎與子宮炎、肢蹄病被稱為奶牛三大難治愈的疾病，是奶牛的一種常見病與多發病，只要飼養奶牛的地方，就有乳房炎發生。乳房炎是奶牛乳腺組織受到病原體的侵襲及物理、化學因素刺激所發生的一種炎癥反應，該病的發生給奶牛養殖業造成了非常大的損失［1］。奶牛乳房炎可由多種病原微生物引起，包括細菌、霉形體、真菌和病毒等，一般以細菌感染為主，其中葡萄球菌是導致奶牛乳房炎的最主要病原菌，鏈球菌和大腸桿菌也比較常見［2～4］。

據統計，世界范圍內，每年因奶牛患乳房炎導致的奶產量下降可達380 萬噸［5］。因此對奶牛乳房炎采取適當治療、對癥用藥，減少產奶量損失，對國際奶業的發展具有重要意義。奶牛乳房炎一般采用抗生素治療，殺滅侵入組織的病原體，并消除炎癥反應。常用的抗菌藥物有青霉素、鏈霉素、卡那霉素、氯霉素、紅霉素、四環素、磺胺類及喹諾酮類藥物等［6］。本研究對天津地區引起奶牛乳房炎的葡萄球菌進行分離、鑒定，并進行藥敏試驗，為指導臨床科學用藥，有效降低乳房炎的發病率，促進奶牛養殖業的健康持續發展提供科學依據。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1奶樣采集

在天津周邊的大港區（位于天津的南部）、靜海區（位于天津的西部）、寶坻區（位于天津的北部）不同規模奶牛場選取患乳房炎病牛，其中在大港區3 個牛場中選取20 頭、靜海區2 個牛場中選取10 頭，寶坻區地理分布不同的4 個牛場中選取20 頭。一共采集了9 個牛場199 份奶樣，其中大港地區80 份奶樣，靜海地區38 份奶樣，寶坻地區81 份奶樣。

先用溫水清洗乳房，擦干后用浸有消毒藥液，如0.2%新潔爾滅溶液的濕毛巾擦拭乳房，待皮膚干燥后再以75%酒精棉消毒乳頭口及其周圍。清洗消毒后，每個乳頭擠出三把奶棄掉，以排除一些污染的雜菌，然后以無菌操作的方法，從奶牛的每個乳室中，現擠5～10 mL乳汁，裝入滅菌試管或無菌小瓶內，封好蓋，標上牛號、乳室、日期等，保存于放有冰塊的保溫箱中，24 h內檢驗。

1.1.2試驗用品

（1）血瓊脂平板

血瓊脂平板用于分離培養葡萄球菌。由天津嘉立荷畜牧有限公司提供的綿羊，頸部靜脈采血，用無菌方法分離血液中的纖維蛋白，再以5%的比例溶于50～60 ℃的營養瓊脂中，冷卻后置4 ℃冰箱備用。

（2）卻甫曼瓊脂培養基

卻甫曼瓊脂培養基內含7.5%NaCl，以抑制葡萄球菌以外的其它細菌生長，用于選擇分離葡萄球菌。

（3）營養肉湯

營養肉湯用于增菌培養。

（4）藥敏試紙片

丁胺卡那霉素、紅霉素、環丙沙星、青霉素、慶大霉素、氟哌酸、鏈霉素、恩諾沙星、四環素、氨芐西林、頭孢噻肟、克林霉素、復方新諾明12 種新藥敏紙片，均購自杭州微生物試劑有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1細菌分離培養

將采取的乳樣置于無菌離心管中，2 000～3 000 r/min離心10 min，棄去管中上層液體，無菌吸取底部沉淀物1 mL，加入含5 mL的營養肉湯的玻璃管中，置于搖床上，增菌培養24 h；挑菌在卻甫曼瓊脂培養基上進行劃線，于37 ℃下培養12～24 h后，挑取典型單個菌落接種到綿羊鮮血瓊脂平板上再次培養12～24 h，觀察細菌生長情況，并進行革蘭氏染色，配合顯微鏡檢查，觀察細菌形態、革蘭氏染色特點，挑選出單個菌落接種到卻甫曼瓊脂培養基上進行純培養。

1.2.2細菌生化鑒定

純化培養后的細菌進行觸酶試驗、溶血試驗、凝固酶試驗、麥芽糖發酵、甘露醇以及七葉苷水解試驗，參照《常見細菌系統鑒定手冊》［7］進行鑒定。

1.2.3藥敏試驗

（1）在良好的光線下，以有黑字的白紙為背景，將培養液（菌懸液）與硫酸鋇標準管進行比濁，調整渾濁度至硫酸鋇標準管相同濃度。如細菌濃度過高，用滅菌生理鹽水稀釋培養液。

（2）將溶化好的M-H瓊脂傾注直徑90 mm的平皿，制成厚3～4 mm的M-H瓊脂平板。

（3）用滅菌棉拭子蘸取上述濃度的菌懸液，在管內壁將多余菌液擠去，在瓊脂平板表面涂布接種3 次，每次旋轉60°，最后沿平板內緣涂抹一周，使菌液均勻涂滿整個瓊脂平板表面，蓋好平皿，在室溫下干燥5 min，待平板表面稍干即可放置藥敏片。

（4）用滅菌鑷子以無菌操作，夾住藥敏片邊緣取出，緊貼在涂有細菌的平板培養基表面。貼藥敏片時要輕輕按壓，以保證與培養基密切接觸。將平皿置于35～37 ℃溫箱中培養12～24 h，觀察結果。

圖1　葡萄球菌在血瓊脂平板上的菌落特征

圖2　葡萄球菌在卻甫曼瓊脂培養基上的菌落特征

圖3　葡萄球菌純培養物涂片革蘭氏染色陽性

2　結果

2.1葡萄球菌的分離與鑒定

葡萄球菌在普通營養肉湯中迅速生長，渾濁率高，管底部有沉淀；在血瓊脂平板上生長良好，呈圓形或橢圓形，多成簇，也有成對和單個者，菌落直徑1.5～2.0 mm，有的菌落呈米黃或金黃色，有的菌落呈乳白或灰白色，均不透明，表面光滑，邊緣整齊（圖1）；在卻甫曼瓊脂培養基上，生長初期基本和在血瓊脂平板上的狀態一樣，3 天后，葡萄球菌呈圓形、黃玉米色、邊緣整齊的小菌落（圖2）。純化后的細菌革蘭氏染色后鏡檢顯陽性，呈圓形，以單個或短鏈狀、葡萄串狀排列（圖3）。

2.2葡萄球菌的生化鑒定

表1列出了2 種葡萄球菌的生化鑒定結果，觸酶試驗呈陽性，β溶血，凝固酶陽性，麥芽糖陽性，甘露醇陽性，七葉苷水解試驗陰性，判斷為金黃色葡萄球菌；觸酶試驗呈陽性，γ溶血，凝固酶陰性，麥芽糖陰性，甘露醇陰性，七葉苷水解試驗陰性，判斷為表皮葡萄球菌。

2.3天津地區葡萄球菌檢出率

天津市3 個區縣9 個奶牛場199份奶樣中共檢出葡萄球菌53 株，其中金黃色葡萄球菌40 株，表皮葡萄球菌13 株，具體檢出結果及檢出率見表2。

2.4藥敏試驗

對分離鑒定出的2 種葡萄球菌進行藥敏試驗，結果如表3所示。從表3可以看出，頭孢噻肟、環丙沙星、恩諾沙星、丁胺卡那霉素、氟哌酸、四環素對葡萄球菌均有高抑制性；氨卞西林、慶大霉素、克林霉素和復方新諾明對葡萄球菌有抑制作用；葡萄球菌對青霉素、鏈霉素以及紅霉素基本耐藥。

表1　葡萄球菌生化鑒定結果

表2　葡萄球菌檢出數量及檢出率

表3　葡萄球菌藥敏試驗結果　　　　　　　　　　　　　單位：mm

3　討論

3.1葡萄球菌的分離鑒定

本試驗中，采集的199 份奶樣中，共檢出葡萄球菌53 株，這與馬保臣報道的泌乳期臨床型乳腺炎病原菌以凝固酶陰性葡萄球菌為主［8］，周慶國報道的佛山地區4 個奶牛場中的奶牛臨床型乳房炎主要由鏈球菌、葡萄球菌和大腸桿菌感染而引起［9］基本相符。

從引起奶牛乳房炎病原菌的檢出率分析，本試驗中金黃色葡萄球菌檢出率為20.10%，表皮葡萄球菌檢出率為6.53%，這與張中文報道的臨床型乳房炎北京部分地區葡萄球菌占23.81%［10］，殷波報道的四川某奶牛場臨床型乳房炎的病原菌檢出率金黃色葡萄球菌23.3%、表皮葡萄球菌3.3%［11］，袁永隆報道的臨床型乳房炎中葡萄球菌占17.14%［12］基本一致，但不同地區學者們檢測出引起奶牛乳房炎的葡萄球菌的檢出率存在細微差別。

3.2葡萄球菌的藥敏試驗

從上述試驗結果可知，引起天津地區奶牛乳房炎的葡萄球菌對頭孢噻肟、環丙沙星、恩諾沙星、丁胺卡那霉素高度敏感，為了有效控制此種病原菌引起的奶牛乳房炎，以上4 種抗生素為首選藥物。本試驗研究結果與王登輝報道的乳樣中分離出的金黃色葡萄球菌對頭孢和環丙沙星敏感［13］相一致，與馬曉艷等研究金黃色葡萄球菌對環丙沙星、恩諾沙星高度敏感結果［14］也相吻合，但與李飛等研究表明金黃色葡萄球菌對復方新諾明耐藥率在80%以上的結果［15］稍有差異。

4　結論

天津地區采集的199 份奶牛乳房炎樣品中共檢出葡萄球菌53株，其中金黃色葡萄球菌40 株、表皮葡萄球菌13 株；藥敏試驗表明葡萄球菌對頭孢噻肟、環丙沙星、恩諾沙星、丁胺卡那霉素高度敏感。C

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馬騰宇（1984-），男，碩士研究生，獸醫師，研究方向為基礎獸醫學。

2016-05-16）