IRS-2 siRNA對腎母細胞瘤G401細胞增殖的影響及其分子機制

楊 潔， 王寶西

(第四軍醫大學附屬唐都醫院兒科，西安 710038； *通訊作者，E-mail：ekwbx1960@163.com)

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IRS-2 siRNA對腎母細胞瘤G401細胞增殖的影響及其分子機制

楊 潔， 王寶西

(第四軍醫大學附屬唐都醫院兒科，西安 710038；*通訊作者，E-mail：ekwbx1960@163.com)

目的 觀察胰島素受體底物2(IRS-2)siRNA對腎母細胞瘤G401細胞增殖的影響，探討其分子機制。 方法 應用siRNA干擾IRS-2表達，將G401細胞分為空白對照組、陰性對照組和IRS-2 siRNA組，空白對照組不做處理，陰性對照組轉染陰性對照siRNA，IRS-2 siRNA組轉染IRS-2特異性siRNA。MTT法檢測IRS-2對腎母細胞瘤G401細胞增殖的影響，流式細胞術分析IRS-2 siRNA對細胞周期和凋亡的影響，Western blot檢測IRS-2 siRNA對p-Akt、Akt、CDK2和Cyclin A2表達的影響。 結果 與空白對照組和陰性對照組相比，IRS-2 siRNA組G401細胞的IRS-2 mRNA和蛋白的表達均顯著下調(P<0.01)，IRS-2 siRNA抑制腎母細胞瘤G401細胞增殖；與空白對照組和陰性對照組相比，IRS-2 siRNA組G401 S期細胞數量顯著增加(P<0.01)，G2/M期細胞數量顯著減少(P<0.01)，IRS-2 siRNA組G401細胞的早期凋亡和晚期凋亡顯著增加(P<0.01)；與空白對照組和陰性對照組相比，IRS-2 siRNA組p-Akt、CDK2和Cyclin A2在蛋白水平的表達均下調(P<0.01)。 結論 IRS-2通過激活Akt信號通路，調控CDK2和Cyclin A2的表達，進而促進腎母細胞瘤G401細胞增殖。

胰島素受體底物2； 腎母細胞瘤； 細胞增殖； 細胞周期； 細胞凋亡； Akt信號通路

腎母細胞瘤是兒童腎臟最常見惡性腫瘤，約占兒童腎臟腫瘤的95%[1,2]。其發生是多因素、多基因參與的生物學過程。目前尚未清楚腎母細胞瘤的發病機制，因而缺乏相應的靶向治療手段。胰島素受體底物2(insulin receptor substrate 2，IRS-2)最初在IRS1-/-小鼠被胰島素刺激的細胞中發現[3]。IRS-2是有絲分裂發生的主要介質且調控葡萄糖代謝[4]。研究表明，IRS-2與乳腺癌、胰腺癌等腫瘤的細胞生存相關，參與腫瘤的發展過程[5,6]。然而IRS-2在腎母細胞瘤中的作用尚未見報道。本研究應用siRNA沉默IRS-2基因表達，分析對人腎母細胞瘤G401細胞增殖的影響，觀察Akt信號通路，及細胞周期調節蛋白CDK2和Cyclin A2表達的變化，探討IRS-2影響腎母細胞瘤細胞增殖的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株

人腎母細胞瘤G401細胞由第四軍醫大學中心實驗室提供，用含10%新生胎牛血清的Mc-Coy5A培養基，置于5%CO2，37 ℃孵箱中培養，取對數生長期的細胞進行實驗。

1.2 主要試劑與儀器

新生胎牛血清購自美國Gibico公司；Mc-Coy5A培養基購自美國Life Technologies公司；MTT、碘化丙啶(PI)、RnaseA、胰島素受體底物2(IRS-2)購于美國Sigma公司；Trizol和Lipofectamine2000購于美國Invitogen公司；Annexin Ⅴ-FITC凋亡試劑盒購自美國BD BioScience公司；qRT-PCR試劑盒和逆轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；兔抗人IRS-2單克隆抗體、兔抗人p-Akt單克隆抗體、兔抗人Akt多克隆抗體、兔抗人Cyclin A2單克隆抗體、兔抗人CDK2單克隆抗體、小鼠抗人β-Actin單克隆抗體均購自美國Cell Signaling公司；RIPA細胞裂解液購于上海碧云天公司；ECL化學發光試劑盒購于美國Pierce公司。

二氧化碳培養箱Galaxy S(英國RS Biotech公司)；低速離心機TDL-5(上海安亭科學儀器廠)；高通量多功能微板測試系統(德國BMG Labtechnologies公司)；FASCalibar流式細胞儀(美國FALS CALIBAR BD公司)；垂直電泳系統SE260(美國Amersham公司)；濕法蛋白電轉印系統DYCZ-40D(北京六一儀器廠)；GBOX-HR全自動凝膠成像分析系統(英國SYNGENE公司)；實時定量PCR儀iQ5 Multicolor(美國Bio-Rad公司)。

1.3 siRNA合成與轉染

IRS-2 siRNA sense:5′-GAUCUGUCUGGCUUUAUCATT-3′,antisense:5′-UGAUAAAGCCAGACAGAUCTT-3′；陰性對照siRNA(negative siRNA)sense：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，antisense：5′-ACGUGACACGUUCGG AGAATT-3′；由上海吉瑪制藥技術有限公司設計與合成。將G401細胞分為空白對照組、陰性對照組與IRS-2 siRNA組，空白對照組不做干預，陰性對照組轉染陰性對照siRNA，IRS-2 siRNA組轉染IRS-2特異性siRNA。將G401細胞用無抗生素含血清的Mc-Coy5A培養液重懸，接種于96或6孔板中繼續培養24 h。按照LipofectamineTM2000轉染試劑說明書操作，將siRNA瞬時轉染G401細胞，轉染4-6 h，換新鮮的含10%血清的完全培養基，繼續培養24,48,72 h分別檢測細胞增殖、周期及凋亡。

1.4 MTT比色法檢測IRS-2 siRNA對G401細胞增殖的影響

G401細胞以5 000個/孔接種于96孔板，每孔200 μl培養基。實驗分組為空白對照組、陰性對照組(70 nmol/L)和IRS-2 siRNA(70 nmol/L)組。每組5個復孔，轉染后再分別培養24,48,72 h，再每孔加入5 mg/ml MTT 溶液20 μl，繼續培養4 h，棄上清并加入150 μl DMSO，在POLARstar+OPTIMA微板測試儀上檢測光吸收值，檢測波長為490 nm。

1.5 流式細胞儀檢測IRS-2 siRNA對G401細胞周期的影響

轉染48 h時收集細胞，PBS洗滌2次，用75%乙醇過夜固定；再加入0.3 ml濃度為100 μg/ml PI染液，避光靜置20 min；使用流式細胞儀檢測，激發波長為488 nm，PI的紅色熒光通過630 nm的濾光片進行收集，BD FACSort CellQuest軟件獲取數據，采用Modfit LT軟件分析DNA含量變化。

1.6 流式細胞儀檢測IRS-2 siRNA對G401細胞凋亡的影響

收集轉染48 h的細胞，PBS洗滌2次。用500 μl結合緩沖液懸浮細胞，再加入5 μ1 Annexin Ⅴ/FITC與5 μl 20 μg/ml的碘化丙錠，混合均勻，避光靜置20 min。用流式細胞儀檢測，FITC受激發后發綠色熒光，PI發紅色熒光，結果用隨機軟件進行分析。

1.7 Real time PCR檢測轉染IRS-2 siRNA時G401細胞中IRS-2 mRNA表達

G401細胞在轉染24 h時加入Trizol。用氯仿、異丙醇等提取總RNA。按照逆轉錄試劑盒說明書加樣，37 ℃ 90 min，70 ℃ 10 min，終止反應。Real time PCR反應，按照人IRS-2序列，設計Real time PCR 引物。IRS-2上游引物：5′-TTGACTTCTTGTCCCACCACTTG-3′，IRS-2下游引物：5′-GCTGAGCGTCTTCTTTTAATGATACT-3′；β-actin上游引物：5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，β-actin下游引物：5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。擴增條件：94 ℃變性2 min，按94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s進行30個循環，于72 ℃延伸10 min。用2-ΔΔCt法對Real time PCR的結果相對定量分析。

1.8 免疫蛋白印跡分析IRS-2 siRNA對CDK2、Cyclin A2表達和Akt信號通路的影響

收集轉染48 h的細胞，應用RIPA裂解液提取細胞總蛋白。變性后電泳，轉膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入兔抗人IRS-2單克隆抗體(1∶1 000稀釋)、兔抗人p-Akt單克隆抗體(1∶1 000稀釋)、兔抗人Akt多克隆抗體(1∶1 000稀釋)、兔抗人Cyclin A2單克隆抗體(1∶1 000稀釋)、兔抗人CDK2單克隆抗體(1∶1 000稀釋)、小鼠抗人β-actin單克隆抗體(1∶3 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，洗膜，用HRP標記的羊抗兔/羊抗鼠二抗(1∶2 000稀釋)室溫孵育2 h，洗膜。加入免疫印跡化學發光液，應用Syngene G Box凝膠成像儀拍照，GeneTools軟件分析。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 轉染IRS-2 siRNA后腎母細胞瘤G401細胞中IRS-2表達下調

在腎母細胞瘤G401細胞中穩定轉染IRS-2 siRNA后，與空白對照組相比，陰性對照組無顯著性差異，siRNA組IRS-2 mRNA表達減少[(18.7±3.1)%]，差異具有統計學意義(P<0.01)；與陰性對照組相比，siRNA組IRS-2 mRNA表達也顯著減少[(19.2±3.0)%，P<0.01，見圖1A]；同時，siRNA組IRS-2蛋白表達與空白對照組和陰性對照組相比也均明顯下調(P<0.01，見圖1B)。表明siRNA有效地沉默了G401細胞中IRS-2表達。

2.2 沉默IRS-2對G401細胞增殖的影響

與空白對照組相比，IRS-2 siRNA組48，72 h時G401細胞的增殖能力顯著降低為(64.4±4.5)%和(58.2±5.8)%(P<0.01)；IRS-2 siRNA組24 h時無顯著變化。陰性對照組與空白對照組相比無統計學差異。與陰性對照組相比，IRS-2 siRNA組48，72 h時G401細胞的增殖能力也均顯著降低為(60.3±4.2)%和(61.9±4.6)%(P<0.01，見圖2)。說明沉默IRS-2表達可抑制腎母細胞瘤G401細胞增殖。

2.3 沉默IRS-2對G401細胞周期的影響

在G401細胞中轉染IRS-2 siRNA 48 h時，將其消化分散為單細胞懸液，通過流式細胞儀檢測細胞周期。IRS-2 siRNA組與空白對照組相比，G0/G1期細胞數量有所增加，S期細胞數量顯著增加(P<0.01)，而G2/M期細胞數量顯著減少(P<0.01)；陰性對照組與空白對照組無統計學差異；與陰性對照組相比，IRS-2 siRNA組G0/G1期細胞數量也有所增加，S期細胞數量也顯著增加(P<0.01)，而G2/M期細胞數量也顯著減少(P<0.01，見圖3)。證明沉默IRS-2使腎母細胞瘤G401細胞阻滯在S期，抑制細胞進入G2/M期進行分裂。

圖1 轉染IRS-2 siRNA后G401細胞中IRS-2表達的變化Figure 1 The changes of IRS-2 expression after transcription IRS-2 siRNA in G401 cells

與空白對照組和陰性對照組比較，*P<0.01圖2 沉默IRS-2對G401細胞增殖的影響(MTT比色分析)Figure 2 Effect of IRS-2 silencing on G401 cell proliferation by MTT assay

2.4 沉默IRS-2對G401細胞凋亡的影響

在腎母細胞瘤G401中轉染IRS-2 siRNA 48 h時，收獲細胞制備為單細胞懸液，采用Annexin Ⅴ+PI試劑盒染色，運用流式細胞儀檢測?？瞻讓φ战M早期凋亡細胞為(5.61±2.33)%；晚期凋亡細胞為(3.26±1.87)%。與空白對照組相比，siRNA組早期凋亡細胞顯著增加(P<0.01)，為(13.55±2.52)%，晚期凋亡細胞也增加(P<0.01)，為(17.09±2.83)%；而陰性對照組與空白對照組相比無統計學差異。與陰性對照組相比，siRNA組早期凋亡和晚期凋亡細胞均顯著增加(P<0.01，見圖4)。

與空白對照組和陰性對照組比較，*P<0.01圖3 沉默IRS-2對G401細胞周期的影響Figure 3 Effect of IRS-2 silencing on cell cycle of G401 cells

與空白對照組和陰性對照組比較，*P<0.01圖4 沉默IRS-2對G401細胞凋亡的影響Figure 4 Effect of IRS-2 silencing on apoptosis of G401 cells

2.5 沉默IRS-2抑制G401細胞Akt信號通路的激活

為進一步分析IRS-2生物學作用的分子機制，采用Western blot分析沉默IRS-2對腎母細胞瘤G401細胞內p-Akt、Akt、CDK2和Cyclin A2表達的影響,結果發現，沉默IRS-2后與空白對照組和陰性對照組相比p-Akt、CDK2和Cyclin A2表達均下降，而Akt表達無統計學差異；陰性對照組與空白對照組相比各蛋白無統計學差異(見圖5)。

與空白對照組和陰性對照組比較，*P<0.01圖5 沉默IRS-2對p-Akt、Akt、CDK2、Cyclin A2表達的影響Figure 5 Effect of IRS-2 silencing on p-Akt, Akt, CDK2 and Cyclin A2 expression

3 討論

IRS-2屬于胰島素受體底物(IRS)家族成員，IRS是一類胞質蛋白激酶，它們是在胰島素信號傳導中首次被發現。研究表明，在人類乳腺癌、神經母細胞瘤和間皮瘤細胞中IRS-2傳導信號能夠促進細胞的遷移與侵襲能力[5,7]。IRS-2促進腫瘤惡化和侵襲能力的一個可能的機制是通過促進腫瘤細胞表面的葡萄糖轉運從而增強糖酵解引起的。IRS-2也被證實與促進腫瘤細胞生存相關，這很可能是由于其參與了腫瘤發展的進程。IRS-2在胰腺癌細胞中能夠通過調控IGF1信號通路促進腫瘤的發展過程[8]。近期的研究結果表明，IRS-2在腎癌和口腔癌中表達上調，并通過激活Akt信號通路促進腫瘤細胞增殖[9,10]。另外，IRS-2缺失型乳腺癌細胞更容易發生凋亡[11]。本研究結果顯示，應用siRNA沉默IRS-2表達后，腎母細胞瘤G401細胞的增殖能力顯著下降，凋亡增加，證明IRS-2可促進腎母細胞瘤G401細胞增殖并抑制凋亡。

細胞周期是細胞生命活動的一項重要的過程，其進展程度受很多分子的調控，其中細胞周期調節器(Cyclins)是細胞周期的主要調節因子，它們分別參與細胞周期的不同階段。細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶(CDKs)也參與細胞周期的調節。其中CDK2與Cyclin A2結合，促進細胞由S進入G2/M期進行細胞分裂[9,10]。本研究結果顯示，當IRS-2 siRNA處理腎母細胞瘤G401細胞后，S期細胞數量增加，而G2/M期細胞數量顯著減少；同時CDK2和Cyclin A2表達下調。這說明IRS-2能夠通過調控CDK2和Cyclin A2的表達，使細胞跨越S-G2/M期節點，進而促進腎母細胞瘤G401細胞進行分裂、增殖。

磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信號通路在腫瘤的發生、發展過程中發揮非常重要的作用。研究發現PI3K/Akt信號通路在卵巢癌、結直腸癌、淋巴瘤、胰腺癌、非小細胞肺癌、淋巴瘤及胃癌等多種腫瘤組織中過度表達和活化[12-16]。其中相關基因異常表達所致的功能獲得或者缺失可引起腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的異常?；罨腁kt可調節許多與細胞增殖相關的蛋白，如mTOR、c-myc和CREB等?；罨腜I3K-Akt可通過TSC1/2復合物激活其下游分子mTOR。mTOR可調控在翻譯過程中起重要作用的4E-BPl、p70S6K和eIF4GI等蛋白的表達[6]。c-myc是一種較強的細胞周期促進因子，可使細胞逃離G0期，引起細胞增殖，Akt通過增加癌基因c-myc的轉錄、上調該基因的表達而影響細胞周期。近來的研究表明，在腎癌和口腔癌中激活PI3K-Akt信號通路可上調細胞周期調控因子CDK2和Cyclin A2的表達，進而促進細胞分裂增殖。本研究結果顯示，在腎母細胞瘤G401細胞中沉默IRS-2表達，則抑制PI3K-Akt信號通路激活，下調CDK2和Cyclin A2的表達。說明IRS-2可通過激活PI3K-Akt信號通路影響腎母細胞瘤增殖。

總之，siRNA干擾IRS-2表達后，通過抑制PI3K-Akt激活，調控CDK2和Cyclin A2的表達，進而抑制了腎母細胞瘤G401細胞分裂、增殖。這將有助于進一步了解腎母細胞瘤發病機制，為開辟腎母細胞瘤治療的新途徑提供實驗依據。

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Effects of IRS-2 siRNA on proliferation of nephroblastoma G401 cells and its molecular mechanism

YANG Jie, WANG Baoxi*

(DepartmentofPediatrics,TangduHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710038,China；*Correspondingauthor,E-mail：ekwbx1960@163.com)

ObjectiveTo investigate the effects of IRS-2 on the proliferation of nephroblastoma G401 cells and its molecular mechanism.MethodsThe siRNA interference was used to knockdown IRS-2. G401 cells were divided into three groups: blank control group, negative control group and IRS-2 siRNA group. Control siRNA and IRS-2-targeted siRNA were transfected into G401 cells in negative control group and IRS-2 siRNA group, respectively. MTT assay was used to analyze the effects of IRS-2 on proliferation of nephroblastoma G401 cells. The effects of IRS-2 on the cell cycle and apoptosis of nephroblastoma G401 cells were observed by flow cytometer. The effects of IRS-2 siRNA on the expression of p-Akt, Akt, CDK2 and Cyclin A2 were analyzed by Western blot.ResultsIRS-2 mRNA and protein significantly decreased in IRS-2 siRNA group compared to blank control group and negative control group(P<0.01). IRS-2 siRNA inhibited proliferation of nephroblastoma G401 cells. The number of S phase cells significantly increased in IRS-2 siRNA group compared to blank control group and negative control group(P<0.01), meanwhile the number of G2/M phase cells remarkably decreased(P<0.01). The number of early apoptotic cells and late apoptotic cells remarkably increased in IRS-2 siRNA group compared to blank control group and negative control group(P<0.01).The levels of p-Akt, CDK2 and Cyclin A2 proteins decreased in IRS-2 siRNA group compared to blank control group and negative control group(P<0.01).ConclusionIRS-2 may promote the proliferation of nephroblastoma G401 cells through activating Akt signal pathway, regulating CDK2 and Cyclin A2 expression.

IRS-2； nephroblastoma； cell proliferation； cell cycle； apoptosis； Akt signal pathway

陜西省自然科學基金資助項目(2014JM4023)

楊潔，女，1980-06生，本科，主治醫師，E-mail：13991103197@163.com

2016-06-14

R737.11

A

1007-6611(2016)09-0813-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.09.007