Legumain在大腸癌中的表達及臨床意義

王健君， 李曉敏， 何 雷， 周芳芳， 許增祥， 鐘樹志

(1皖南醫學院組織學與胚胎學教研室，蕪湖 241002； 2皖南醫學院病理學教研室；3皖南醫學院弋磯山醫院病理科； *通訊作者，E-mail：lxm1980326@sina.com)

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Legumain在大腸癌中的表達及臨床意義

王健君， 李曉敏， 何 雷， 周芳芳， 許增祥， 鐘樹志

(1皖南醫學院組織學與胚胎學教研室，蕪湖 241002；2皖南醫學院病理學教研室；3皖南醫學院弋磯山醫院病理科；*通訊作者，E-mail：lxm1980326@sina.com)

目的 探討人大腸癌組織中天冬酰胺內肽酶(Legumain)的表達及其與臨床病理參數的關系。 方法 制備包含69例大腸腺癌手術切除標本及癌旁組織的組織芯片，采用免疫組織化學方法檢測Legumain的表達，分析Legumain表達與臨床病理參數的相關性；并應用RT-qPCR檢測16對大腸癌及癌旁正常組織Legumain mRNA的表達水平。 結果 Legumain在人大腸癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，差異具有統計學意義(P<0.05)，Legumain高表達與腫瘤的漿膜浸潤、淋巴結轉移及臨床分期相關(P<0.05)。 結論 Legumain人大腸癌組織中高表達，可能促進了大腸癌的侵襲及轉移。

大腸癌； Legumain； 轉移； 免疫組織化學

Legumain即天冬酰胺內肽酶，是溶酶體半胱氨酸蛋白酶C13家族的成員，最初在豆類植物種子中被發現并被命名為液泡加工酶[1]。在人體內，Legumain定位于14號染色體上，編碼長度為433個氨基酸的蛋白，與動脈粥樣硬化、腦退行性變、肝臟纖維化、抗原加工處理等病理生理過程密切相關。Liu等[2]最先發現Legumain在人多種惡性腫瘤組織中高表達，隨后研究發現Legumain在人乳腺癌、橫紋肌肉瘤、胃癌、前列腺癌、黑色素瘤等惡性腫瘤中也高表達，且與患者的不良預后相關[3-7]。大腸癌是消化系統最常見的惡性腫瘤之一，近年來由于生活方式和飲食習慣的改變，其發病率和死亡率逐年上升，大腸癌復發和轉移是患者死亡的主要原因[8]。然而Legumain在大腸癌中的研究少見報道，因此本研究通過在蛋白和基因水平檢測人大腸癌中Legumain的表達情況，分析Legumain表達與大腸癌臨床病理參數的相關性，初步探討Legumain是否參與了大腸癌的侵襲及轉移過程，進一步為大腸癌的治療提供新靶點。

1 材料和方法

1.1 制備大腸癌及癌旁正常組織的組織芯片

收集皖南醫學院附屬弋磯山醫院大腸癌手術切除標本共69例，所有病例均為2015-01～2016-01期間由普通外科收治的大腸癌患者，患者術前均未接受放、化療，術后病理均證實為腺癌，且無其他腫瘤性疾病。每例標本留取腫瘤組織及距腫瘤邊緣大于5 cm處癌旁組織各1塊，經常規石蠟包埋制成供體蠟塊，經HE染色觀察確定典型部位。使用北京博醫康實驗儀器有限公司組織芯片儀在45 mm×30 mm受體蠟塊上構建48個空點陣(8×6個點，直徑為1.2 mm)，起始1個點空缺作為陣列位置標志，共制成3塊受體蠟塊。然后用點樣針在供體蠟塊上取標本，HE切片比對下在癌及癌旁的典型區域各取1塊，同一標本癌及癌旁組織植入相鄰的孔內，以保證癌和癌旁組織的反應條件一致，共制備3塊8×6陣列的組織芯片。在烤箱中 60 ℃溶蠟后切片進行HE染色及免疫組織化學染色。

1.2 組織芯片免疫組織化學染色

應用SP法進行免疫組織化學染色檢測Legumain的表達，DAB顯色，用已知陽性大腸癌組織切片作為陽性對照，以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。濃縮型兔抗人Legumain多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；SP試劑盒、PBS緩沖液、枸櫞酸鹽緩沖液和DAB顯色液等均購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.3 免疫組織化學染色結果評價

組織芯片免疫組織化學染色結果由2位高年資病理醫師獨立觀察評價，分別從染色強度和染色比例兩方面進行綜合評價。染色強度分為陰性、弱染色(淡棕黃色)、中染色(棕黃色)、強染色(棕褐色)；染色比例分為<25%和≥25%。染色強度為陰性或弱染色，且染色比例<25%判定為低表達，其余為高表達。

1.4 組織總RNA提取及RT-qPCR

使用RNAisoTMPlus(Takara公司)提取大腸癌及癌旁組織總RNA，使用逆轉錄試劑盒(Takara公司)將RNA逆轉錄為cDNA，使用BestarTMRealtime PCR Master Mix(SYBR Green法)(DBI公司)進行熒光定量PCR(RT-qPCR)，以GAPDH作為內參，所用引物：Legumain上游引物5′-GCAGGTTCAAATGGCTGGTAT-3′，Legumain下游引物5′-GGAGTGGGA TTGTCTTCAGAGT-3′，GAPDH上游引物5′-AAGGTCGGAGTCAACGGATTTG-3′，下游引物5′-CCATGGGTGGAATCATATTGGAA-3′，引物由北京睿博興科生物技術有限公司合成。應用ABI公司的7500定量PCR儀進行qPCR實驗，程序如下，預變性95 ℃ 2 min，變性95 ℃ 15 s，退火60 ℃ 34 s，延伸72 ℃ 30 s，40個循環，所有實驗均重復3次，計算每個樣本的平均ΔCt，ΔCt=(CtLegumain-CtGAPDH)。

1.5 統計學分析

采用SPSS 19.0統計軟件(IBM)進行統計分析。qPCR數據以ΔCt±SD表示，組間差異用雙側T檢驗進行統計。Legumain在大腸癌及癌旁正常組織中的免疫組織化學染色差異表達用χ2檢驗統計。Legumain的表達與各個臨床病理參數間的相關性分析采用χ2檢驗或Fisher精確概率法。以P<0.05作為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 Legumain在大腸癌和癌旁正常黏膜中的表達

Legumain陽性染色位于細胞質內，呈彌漫性淡黃色至棕褐色顆粒狀。高表達Legumain的大腸癌表現為癌細胞胞質呈棕褐色顆粒狀，大部分病例的癌旁正常黏膜Legumain為陰性或弱陽性，僅少數病例癌旁正常黏膜呈強陽性，主要位于腸黏膜上皮細胞胞質內，且強陽性范圍局限(見圖1)。組織芯片上69例大腸癌組織中48例(69.6%)高表達Legumain，21 例(30.4%)低表達；69例相應癌旁正常黏膜中13例(18.8%)高表達Legumain，56例(81.2%)低表達，大腸癌與相應癌旁正常黏膜Legumain表達差異有統計學意義(P<0.05,見表1)。

A.組織芯片(HE染色)；B.大腸癌組織Legumain表達(IHC×200)；C.大腸癌組織Legumain表達(IHC×400)；D.癌旁正常腸黏膜Legumain表達(IHC×200)；E.癌旁正常腸黏膜Legumain表達(IHC×400)圖1 大腸癌及癌旁組織芯片HE染色及Legumain免疫組織化學染色Figure 1 Legumain expression in tissue microarray(TMA) containing colorectal cancer and paired normal colorectal tissue by HE and immunohistochemical staining

表1 大腸癌及癌旁正常組織Legumain的表達差異例(%)

Table 1 The difference of Legumain expression in colorectal cancer and paired normal colorectal mucosa cases(%)

組織芯片nLegumain低表達高表達χ2P大腸癌6921(30.4)48(69.6)35.99<0.001癌旁正常黏膜6956(81.2)13(18.8)

2.2 大腸癌和癌旁正常組織Legumain mRNA的表達

應用RT-qPCR技術檢測16對大腸癌及癌旁正常組織Legumain mRNA的表達，經過內參對樣本Ct值進行標準化后，獲得每一樣本的相對ΔCt值，通過統計分析表明Legumain mRNA在大腸癌中的表達明顯高于癌旁正常黏膜(P<0.000 1,見圖2)。

圖2 大腸癌及癌旁正常組織Legumain mRNA的表達(RT-qPCR)Figure 2 Legumain expression at the mRNA level in colorectal cancer and paired normal colorectal mucosa by RT-qPCR

2.3 Legumain表達與臨床病理參數的關系

大腸癌中Legumain的表達在腫瘤是否侵犯漿膜、淋巴結是否轉移及不同的TNM分期之間的差異具有統計學意義(P<0.05)，在不同患者性別、年齡、腫瘤大小及分化程度之間的差異均無統計學意義(P>0.05，見表2)。

3 討論

大腸癌日益增高的發病率和死亡率逐漸引起人們重視，其死亡原因主要為大腸癌的轉移和復發，腫瘤細胞從原發部位突破基底膜進入間質并侵入血管是腫瘤轉移的關鍵步驟，腫瘤細胞可以通過分泌組織蛋白酶和基質金屬蛋白酶來降解腫瘤基質促進腫瘤轉移，Legumain作為半胱氨酸蛋白酶C13家族的新成員，是否參與了大腸癌的侵襲和轉移過程，文獻少見報道。本實驗通過自制大腸癌及癌旁正常黏膜的組織芯片，通過免疫組織化學的方法檢測大腸癌及癌旁組織Legumain的表達，發現相比正常組織，Legumain在大腸癌高表達(P<0.05)，這與文獻報道相一致[9]。

表2 大腸癌Legumain表達與各臨床病理參數的相關性分析(例)

Table 2 Association between Legumain expression and clinicopathological parameters in colorectal cancers (cases)

變量nLegumain低表達高表達χ2P性別0.1460.702 男性411231 女性28919年齡0.0450.831 <65歲25817 ≥65歲441331腫瘤大小2.3980.121 <4cm331320 ≥4cm36828分化程度1.5340.483 高分化1046 中分化471532 低分化12210漿膜侵犯8.8680.003 有47938 無221210淋巴結轉移4.4850.034 有33627 無361521TNM分期5.1770.023 Ⅰ-Ⅱ351520 Ⅲ-Ⅳ34628

組織芯片具有高通量、經濟的優點，但由于組織芯片上的標本面積較小，具有片面性的缺點，因此在免疫組化評分判定中不適合根據陽性強度和范圍評分，我們前期用供體蠟塊進行的免疫組化染色發現大腸癌Leguamin表達普遍高于25%，結合文獻報道[10]，將小于25%且染色呈淡黃色彌漫陽性的定為低表達，其余為高表達，這種免疫組化結果判定與受體蠟塊免疫組化結果相一致。組織芯片上69例大腸癌標本中共有48例高表達Legumain，高表達Legumain的腫瘤細胞表現為腫瘤細胞質內出現棕黃色至棕褐色粗顆粒，有研究分別在乳腺癌[3]和前列腺癌[6]中通過免疫組化方法發現Legumain在胞質內陽性表達方式有兩種：彌漫性陽性著色(diffuse cytoplasmic staining)和囊泡狀陽性著色(vesicular staining pattern)，且囊泡狀陽性與患者的不良預后相關，此外，Haugen等[11]在結腸癌Legumain免疫組織化學染色切片上觀察到約30%的標本腫瘤細胞核Legumain陽性，且核陽性與患者的不良預后相關，本實驗并未觀察到腫瘤細胞核呈陽性。組織芯片上69例癌旁正常組織均取自遠離癌組織的遠端切緣，術后證實未有癌累及，69例正常黏膜僅13例表現為陽性，但陽性部位較局限，強陽性僅表達于表面黏膜上皮細胞內。為進一步明確大腸癌Legumain的表達上調是否存在轉錄水平的調控，本實驗通過RT-qPCR方法檢測16對大腸癌與癌旁正常黏膜Legumain mRNA的相對表達差異，結果表明大腸癌mRNA明顯高于癌旁組織(P<0.000 1)。

為進一步探討Legumain在大腸癌中表達上調的臨床意義，本實驗分析了大腸癌Legumain表達與各臨床病理參數的關系，結果表明大腸癌Legumain表達與漿膜是否侵犯、淋巴結是否轉移以及不同TNM分期的腫瘤之間具有差異，差異有統計學意義(P<0.05)，提示Legumain可能促進了大腸癌的侵襲和轉移。在乳腺癌[12]和胃癌[5]的免疫組化研究中也同樣發現Legumain表達在伴有或不伴有淋巴結轉移的大腸癌之間表達具有差異，差異有統計學意義(P<0.05)。

Legumain在腫瘤組織內高表達與腫瘤組織的缺氧、局部pH降低有關，另外Yamane等[13]報道p53可以與Legumain基因結合，在轉錄水平上調Legumain的表達。在乳腺癌中也發現p53與Legumain的表達呈正相關[12]。但Legumain促進惡性腫瘤細胞侵襲及轉移的機制目前仍不清楚，文獻報道較少，目前認為有如下幾種機制：①Legumain可通過水解活化組織蛋白酶和基質金屬蛋白酶，降解腫瘤基質，促進腫瘤細胞的侵襲及轉移。在對胃癌等的研究中也發現Legumain的表達與MMP-2、MMP-9的表達及活性呈正相關[10,14]，但Legumain能否直接調控MMP-2的表達及活化仍需進一步研究。②通過與整合素結合促進腫瘤細胞與細胞外基質的黏附從而促進腫瘤的轉移，有研究在遷移中的大腸癌、乳腺癌等惡性腫瘤細胞前端發現Legumain與整合素有重疊[2,12]，Legumain可能通過整合素途徑促進腫瘤細胞的遷移及轉移。③促進腫瘤細胞增殖，Andrade等[15]在肝癌細胞中發現Legumain可以通過影響細胞周期，減少處于G2/M期細胞的比例，而促進腫瘤細胞的增殖。

綜上所述，本研究證明大腸癌組織中Legumain表達在蛋白和基因水平上均明顯上調，其上調表達與大腸癌的漿膜浸潤、淋巴結轉移和TNM分期相關，Legumain參與了大腸癌的侵襲和轉移過程，可能為大腸癌的治療提供新的思路。

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Expression and clinical significance of Legumain in colorectal cancer

WANG Jianjun1，LI Xiaomin2*，HE Lei3，ZHOU Fangfang2，XU Zengxiang2， ZHONG Shuzhi1

(1DepartmentofHistologyandEmbryology，WannanMedicalCollege，Wuhu241002，China；2DepartmentofPathology，WannanMedicalCollege;3DepartmentofPathology，YijishanHospitalofWannanMedicalCollege；*Correspondingauthor，E-mail：lxm1980326@sina.com)

ObjectiveTo investigate Legumain expression and its relationship with clinicopathological parameters in colorectal cancer.MethodsExpression of Legumain was examined in tissue microarray(TMA) containing 69 samples of colorectal cancer and paired normal colorectal tissue using immunohistochemistry. The correlation between Legumain expression in colorectal tumor and clinicopathological parameters were analyzed. Additionally, the expression levels of Legumain mRNA were detected in 16 paired colorectal cancer tissues and adjacent normal counterparts by RT-qPCR.ResultsLegumain expression was significantly higher in colorectal cancer than in paired normal colorectal mucosa(P<0.05). Increased Legumain levels were significantly correlated with serosal invasion, lymph nodes metastasis and clinical stage(P<0.05).ConclusionLegumain is highly expressed in colorectal cancer, which may promote the invasion and metastasis of colorectal cancer.

colorectal cancer； Legumain； metastasis； immunohistochemistry

皖南醫學院中青年自然科學基金資助項目(WK200830,WK201412)

王健君，男，1981-03生，碩士，講師，E-mail：39001683@qq.com

2016-06-21

R735.34

A

1007-6611(2016)09-0837-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.09.013