超聲解聚對大粒車前子多糖流變性質、溶液構象及活性的影響

夏　強,黃丹菲,余　強,聶少平,謝明勇

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047)

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超聲解聚對大粒車前子多糖流變性質、溶液構象及活性的影響

夏強,黃丹菲,余強,聶少平,謝明勇*

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047)

研究超聲波對大粒車前子多糖溶液流變性質、分子量及分子量分布、溶液構象、抗氧化活性、體外免疫活性功能的影響。用流變儀檢測其靜態動態流變性質。通過光散射凝膠色譜聯用檢測多糖分子量及溶液構象。使用紅外光譜對多糖結構進行表征。通過體外抗氧化模型:DPPH自由基清除,鐵離子還原,氧自由基清除評價抗氧化能力。通過小鼠巨噬細胞RAW264.7增殖,中性紅吞噬及NO分泌評價體外免疫活性。結果表明超聲之后大粒車前子多糖表觀粘度急劇下降,流體性質從假塑性流體變成牛頓性流體;彈性模量G′與粘性模量G″均發生下降,凝膠性質減弱;分子量下降,分子量分布先變寬后變窄;結構參數ρ下降,Mark-Houwinkα值增大,溶液構象從高支化結構向無歸線團轉變;特性粘度[η]下降,多糖在溶液中的構象更緊湊;主要吸收峰沒變,多糖的主要官能團并未改變;DPPH自由基清除能力和鐵離子還原能力顯著提高,氧自由基清除能力變化不顯著;促進巨噬細胞吞噬、增殖、分泌NO的能力均顯著提高。

多糖,超聲波降解,流變性質,溶液構象,抗氧化,免疫調節

車前子為車前的干燥成熟種子,是我國傳統中醫用藥之一,根據我國藥典記載,車前子有“清熱利尿通淋,滲濕止瀉,明目,祛痰”的功效。車前子種皮含有的黏性多糖,是車前子的主要有效成分,常被稱為車前子多糖或車前子膠[1]。

活性多糖的分子量(Mw)對其生物活性有一定的影響,且存在滿足多糖活性的最佳相對分子質量范圍,通常較高分子量的多糖降解為較低分子量,能顯著提高活性[2]。最近的研究表明,超聲波處理能夠有效降低多糖溶液的粘度并提高其水溶性[3]。超聲處理可以降低多糖的分子質量,進而影響流變性和凝膠性質:隨著超聲處理時間的延長,多糖凝膠力較弱,流變學特性發生明顯的變化,流體性質逐步趨向于牛頓流體[4]。

本課題組前期從大粒車前子中提取獲得車前子多糖,主要含有木糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖等單糖。大粒車前子多糖可以促進樹突狀細胞DCs的功能及表型的成熟,從而對機體的免疫功能起到促進作用,同時還可以形成弱凝膠起到增稠作用[5-7]。胡婕倫研究發現通過微波及高壓均質對車前子多糖進行降解,均能大幅度提高車前子多糖的生理活性[8]。因此,本文擬在上述研究的基礎上,探討超聲波對大粒車前子多糖的降解作用對于車前子多糖的流變性質、凝膠性質、溶液構象、抗氧化能力、巨噬細胞的免疫調節功能的影響,并為進一步探討大粒車前子多糖及其降解后組分的結構和活性打下基礎。對全面深入研究車前子的價值有著重要意義,也可為研究我省的特產資源做出貢獻。

1　材料和方法

1.1材料與儀器

大粒車前子江西省吉安市永和鎮(經江西中醫學院范崔生教授鑒定為車前PlantagoasiaticaL.的種子)。

小鼠巨噬細胞系RAW264.7上海中科院細胞庫;LPS脂多糖、DPPH、TPTZ、熒光黃、AAPH、Trolrox美國Sigma公司;DMEM 培養液、胎牛血清美國Gibco公司;一氧化氮(NO)試劑盒南京建成生物有限公司。

ARES-2 流變儀美國TA公司;Sonic VCX-800 超聲波細胞粉碎機美國Sonic公司;Wyatt GPC/SEC-MALS多角度激光散射凝膠色譜聯用系統美國Wyatt公司;全波長掃描式多功能讀數儀美國Thermo公司;Nicolet 5700傅里葉紅外儀美國Thermo公司。

1.2實驗方法

1.2.1超聲波處理多糖大粒車前子精制多糖制備[9](PlantagoasiaticaL. crude polysaccharide,PLCP):取大粒車前子經乙醇浸泡,沸水浴提取,醇沉,經酶法,savage法脫蛋白,透析凍干后制得。

超聲處理方案在文獻的基礎上稍作修改[10],稱取大粒車前子精制多糖配成10 mg/mL水溶液取8 mL于反應容器,超聲溫度使用冰水浴控制,探頭直徑7 mm,功率300 W,探頭插入液面下1 cm。前期摸索發現超聲2 min以上的大粒車前子多糖表觀粘度均接近于0,且不隨剪切速率的變化而變化,故采用以下超聲處理方案:脈沖時間5 s,間隔時間5 s,處理次數分別為0,3,6,12,24,凍干后得超聲時間為0,15,30 s,1,2 min的大粒車前子多糖。

1.2.2靜態流變學性質測試稱取1.2.1所得的樣品,加水溶解至濃度為1%,靜置12 h,用ARES-2流變儀檢測靜態流變學性質。測定條件:直徑50 mm不銹鋼平板,測試溫度25 ℃,剪切速率1～1000 s-1,夾具及樣品臺的距離(gap)1 mm。測定超聲波處理0 s,15 s,30 s,1 min,2 min的1%的車前子多糖溶液的表觀粘度。

1.2.3動態流變學測試動態流變學性質測定:在線性粘彈區用ARES-2(50 mm不銹鋼平板,25 ℃)流變儀測定不同超聲時間下多糖的彈性模量G′、粘性模量G″及相位角正切tan δ隨頻率的變化。

1.2.4HPSEC-MALLS檢測多糖分子量、分子量分布及多糖在水溶液中的構象參數1.2.1制得到的樣品用流動相配制成0.5 mg/mL溶液,使用Wyatt GPC/SEC-MALS多角度激光散射凝膠色譜聯用系統分析多糖的分子量,分子量分布及溶液構象。HPSEC串聯的檢測器有多角度激光光散射檢測器(MALLS,DAWN HELLEOS-Ⅱ),粘度檢測器(DP,ViscoStar-Ⅱ),視差檢測器(RI,Optilab T-rEX)。Model 1500HPLC泵連接兩個分析柱:SB-806HQ,SB-804HQ(Shodex OHpak,8 mm×300 mm,Showa Denko K.K.,日本)。色譜柱檢測器溫度保持在45 ℃,流動相為過了0.45 μm膜的0.02%NaN3水溶液,流速為0.6 mL/min。ASTRA 6.1 software 采集和分析數據。

1.2.5FI-IR掃描多糖紅外光譜采用Nicolet 5700紅外光譜儀測定紅外光譜。取凍干樣品KBr混均勻,壓片,掃描的波長范圍4000～400 cm-1。

1.2.6DPPH自由基清除能力檢測使用96孔板法分析樣品的清除DPPH自由基能力[11]。將25 μL 0.5 mg/mL超聲前后的多糖樣品或Trolox標準溶液加入到96孔板中,再對應加入200 μL 350 mmol/L的DPPH乙醇溶液,混合均勻后,避光靜置6 h,檢測517 nm處吸光度值,甲醇作空白。繪制Trolox濃度對吸光度的標準曲線,多糖的自由基清除能力以每克樣品對Trolox標準的當量(μmol TE/g)表示。所有實驗三次平行,結果用平均值±標準方差表示。

1.2.7鐵離子還原能力檢測(FRAP)使用96孔板法檢測超聲前后的大粒車前子多糖的鐵離子還原能力[11]。新鮮的 FRAP(Ferric reducing antioxidant power)試劑配制:將醋酸鹽緩沖溶液(300 mmol/L,pH3.6)、TPTZ溶液(40 mmol/L HCl溶解、濃度10 mmol/L)和20 mmol/L的FeCl3按體積比10∶1∶1混合。將300 μL新鮮的 FRAP試劑與10 μL 抗壞血酸標品或多糖溶液,充分混勻,37 ℃下孵育2 h,用酶標儀測定593 nm處的吸光度。FRAP用每克樣品對每μmol抗壞血酸當量(μmol AAE/g)表示,所有實驗重復三次,結果用平均值±標準方差表示。

1.2.8氧自由基清除能力(ORAC)氧自由基清除能力的檢測方法在文獻報道的方案基礎上稍作調整[12]。將25 μL樣品、Trolox、磷酸鹽緩沖溶液(75 mmol/L,pH=7.4)加入96孔板,然后分別加入150 μL熒光黃溶液(8.68×10-8mol/L),混勻后37 ℃孵育30 min。每孔加入25 μL APPH試劑(153 mmol/L)震蕩10 s后,使用多功能酶標儀每分鐘采集一次熒光強度(激發波長/發射波長=484/528 nm),持續2 h,得熒光強度變化曲線,ORAC值使用面積大小計算。氧自由基清除能力用每克樣品對Trolox標準的當量(μmol TE/g)表示。所有實驗三次平行,結果用平均值±標準方差表示。

1.2.9細胞增殖能力取對數生長期細胞,計數稀釋至3.2×104/mL,接種于96 孔板,每孔100 μL。培養4 h后洗去未貼壁細胞,用50 μg/mL超聲0 s,15 s,30 s,1 min,2 min的多糖刺激細胞,同時設置1 μg/mL LPS和不加多糖的空白對照組,培養24 h后加入CCK-8(10 μL/孔),培養箱中孵育2 h 后,酶標儀檢測其450 nm 處吸光度值。

增殖率按下式計算:

細胞相對增殖率(%)=(實驗組吸光度-對照組吸光度)/對照組吸光度×100

1.2.10中性紅吞噬能力取細胞以8×105/mL濃度接種于96 孔板,每孔100 μL。分組和加多糖處理同1.2.8,培養24 h之后,棄去培養液并以PBS 洗滌2 次,加入10 mg/mL的中性紅生理鹽水溶液,繼續培養30 min。傾去上清液,用PBS 洗3 遍,每孔加入細胞裂解液(乙醇∶冰醋酸=1∶1)100 μL,室溫下放置2 h,待細胞溶解后,在酶標儀上測定540 nm 處吸光度。

吞噬率按下式計算:

細胞吞噬率(%)=(實驗組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100

1.2.11NO分泌取對數生長期細胞按每孔5×105個細胞加入96孔板,培養過夜,換液,加入多糖刺激24 h,吸上清,按照試劑盒說明書測NO含量。

2　結果與分析

2.1靜態流變學測試

圖1為超聲波解聚對多糖溶液表觀粘度的影響,從測定的結果可以看出,超聲波處理后濃度為1%的大粒車前子多糖表觀粘度急劇下降,超聲2 min后表觀粘度接近于0。未經超聲的大粒車前子多糖(0 s)表觀粘度值很大,并隨剪切速率的增大而急劇下降,出現剪切稀化現象,呈假塑性流體性質。隨著超聲處理的進行,表觀粘度下降的同時,剪切速率對表觀粘度影響越來越小,剪切稀化現象越來越不明顯,當超聲波處理時間達到1、2 min時,剪切速率對表觀粘度基本上沒有影響,表現牛頓性流體性質。

圖1　超聲波解聚對表觀粘度的影響Fig.1　Effect of Ultrasonic depolymerization on apparent viscosity of PLCP

2.2動態流變學測試

多糖溶液具有粘彈性,PLCP在一定濃度下具有成膠性,可以用彈性模量G′、粘性模量G″[13]來反映凝膠強度。G′反映類固體性質,G″反映類液體性質。損耗角正切tan δ是復合模量中粘性分量與彈性分量的比值。

圖2為超聲時間對PLCP彈性模量和損耗模量的影響,未處理的原樣在所測的頻率范圍內,G′大于G″,tan δ最小值約為0.1,隨著頻率的提高而迅速提高,說明PLCP為弱凝膠,這與文獻報道相吻合[14];超聲時間延長,G′與G″下降至接近0,且對于頻率的依賴性減小,說明多糖的凝膠性質發生了改變;隨著超聲時間的延長,彈性模量G′比粘性模量G″下降的更快,損耗角正切tan δ大幅度提高,多糖從開始的彈性模量G′占優勢逐漸變成粘性模量G″占優勢。

圖2　超聲時間對PLCP的彈性模量G′和粘性模量G″的影響Fig.2　Effect of ultrasonic duration on elastic modulus(G′)and viscous modulus(G″)on PLCP

2.3HESEC-MALS分析超聲波降解車前子多糖分子量分布與溶液構象的變化

HESEC-MALS是在傳統光散射基礎上發展出來的分析高分子溶液的一種技術,它不僅可以檢測高分子絕對分子量Mw和回旋半徑Rg,還可以分析分子量分布和分子的形狀。

數據見表1,超聲后多糖分子量急劇下降,超聲2 min后多糖分子量從3.870×106u下降到了0.651×106u;超聲后多糖的多分散性指數(Mw/Mn)先增大后減小說明多糖的分子量分布也是先變寬后變小。分子量下降可能是因為超聲使多糖分子鏈發生了斷裂,超聲處理剛開始時由于產生的分子量較小的斷裂片段造成分子量分布變寬,而隨著超聲的繼續進行,多糖分子斷裂的更加細碎所以分子量分布更加平均,所以多分散系數隨著超聲時間的延長先增大后減小。

結構參數ρ(ρ=Rg/Rh)是反映聚合物構象的重要參數[15]。對于均勻球狀構象,ρ<1;對于柔性的線性無規線團,ρ=2.05;對于高支化得的無規結構,ρ會超過2;ρ遠大于2時,為剛性鏈[16]。由結果可知,多糖的流體力學半徑Rh、回旋半徑Rg在超聲處理之后均有下降,說明超聲后多糖在水溶液中的聚集狀態被破壞。文獻報道了超聲、加熱、加堿、加鹽等消除多糖在溶液中聚集的方法,其中超聲、加熱、加堿可以部分降解多糖[17]。PLCP的ρ為2.400,屬于高支化結構,超聲后ρ下降,超聲2 min 多糖的ρ為2.042為線性無歸線團構象。

表1　HPSEC-MALS測得的降解前后車前子多糖溶液分子參數

HPSEC串聯RI、MALLS、DP檢測器,可對所測定的樣品建立Mw與[η]、Rg的關系并通過Mark-Houwink公式建立關系:[η]=KMα,算得的α值見表1。α在0.5～0.8之間,分子為柔性的無規線團,α<0.3時,多糖為球狀結構,而高支化結構的α一般在0.20～0.34之間[18]。多糖α值為0.354,表明車前子多糖為典型的高支化結構[19]。經過超聲,α值逐漸增大,超聲30 s、1 min、2 min的多糖α值均在0.5～0.8之間,說明超聲使多糖構象向無規線團轉變。

對于大分子的多糖分子結構,特性粘度[η]越大表明結構越伸展[20],超聲后PLCP的特性粘度下降,說明超聲使多糖分子鏈的構象更加緊湊。

結合多糖結構參數ρ、α值、特性粘度超聲前后的變化,可以知道超聲后多糖發生了降解,其在溶液中的聚集狀態被破壞,分子構象從舒展的高支化結構向無規則線團轉變。這可能是超聲過程中,多糖分子鏈斷裂和超聲時產生的劇烈擾動破壞多糖分子間的氫鍵從而破壞了分子的聚集狀態共同造成的。

2.4紅外光譜

超聲降解前后多糖主要官能團的變化通過FT-IR進行分析,分析結果見圖3。可看出,1042.1 cm-1處的強吸收為吡喃糖還的伸縮動。903.1 cm-1附近的吸收峰表示末端糖苷鍵為β型。1616.1 cm-1吸收峰,表明糖醛酸的存在。3393.0 cm-1處的吸收峰為C-H伸縮震動。2927.2 cm-1和1419.5 cm-1也是C-H伸縮振動。可以看出車前子多糖超聲前后主要紅外吸收峰保持一致,說明超聲波降解后,多糖的結構變化并沒有涉及到其主要官能團。

圖3　超聲對大粒車前子多糖紅外圖譜的影響Fig.3　Effect of ultrasonic duration on FT-IR spectra of PLCP

2.5超聲降解對大粒車前子多糖抗氧化能力的影響

結果如圖4所示,未超聲的大粒車前子多糖在DPPH自由基能力、鐵離子還原能力、氧自由基清除能力三個評價體系中均具有良好的抗氧化能力,與之前的報道一致[9]。超聲降解之后,車前子多糖的抗氧化能力均有一定的提升。

超聲30 s,1 min,2 min的多糖的DPPH與超聲前相比有顯著提高;超聲15 s,30 s,1 min,2 min樣品的FRAP值比超聲前均有顯著提高;超聲后樣品的ORAC值雖然有所提升,但是差異不顯著。

超聲能夠顯著提高大粒車前子多糖的DPPH自由基清除能力,鐵離子還原能力,對ORAC的影響并不顯著。

圖4　不同超聲時間的大粒車前子多糖的抗氧化能力Fig.4　The antioxidant activities of PLCP with different ultrasonic duration注：采用LSD法多重比較,凡無相同字母均為差異顯著(p<0.05)。

2.6超聲降解對大粒車前子多糖體外免疫活性的影響

為了研究超聲前后多糖對RAW264.7巨噬細胞的刺激作用,本實驗采用CCK-8法檢測多糖對細胞增殖的影響。從圖5A,表明超聲降解15 s,30 s,1 min,2 min均能使大粒車前子多糖促進巨噬細胞增殖的能力顯著提高。

巨噬細胞是宿主抵御外源性感染及防止癌癥發生的第一道防線,吞噬是巨噬細胞抵御外源性物質侵襲的第一步。采用中性紅吞噬實驗檢驗巨噬細胞的吞噬功能。由圖5B可知,超聲可以使多糖促進細胞吞噬中性紅的能力增強,且當超聲時間到1 min和2 min時,具有顯著性差異。

NO是巨噬細胞產生的主要效應分子,發揮非特異性免疫的細胞毒效應,由圖5C可知,超聲30 s、1 min、2 min可以顯著提高多糖促進巨噬細胞分泌NO的能力。

圖5　超聲時間對PLCP刺激RAW264.7細胞能力的影響Fig.5　Effect of ultrasonic duration on capability of stimulate RAW264.7 of PLCP注：A、B:與0 s對比,*表示差異顯著(p<0.05),**表示差異極顯著(p<0.01).C:采用LSD法多重比較,凡無相同字母均為差異顯著(p<0.05)。

3　結論與討論

超聲波降解聚合物,主要是利用了超聲波的空化效應和自由基效應。超聲波破壞液體結構平衡,產生空穴,而空穴坍塌引起周圍液體產生微射流,微射流與聚合物摩擦產生的剪切力引起降解[21]。空穴變化產生的強烈的溫度變化和局部高壓,同時為自由基的產生提供了條件。

本實驗通過對超聲前后的大粒車前子多糖溶液進行流變學測試,紅外光譜,分子量及分子量分布,溶液構象參數進行測定,發現:超聲波解聚能夠降低車前子多糖溶液表觀粘度,減弱剪切稀化現象,使流體的性質從假塑性流體性質向牛頓型流體性質轉變;超聲降解會降低大粒車前子多糖粘性模量、彈性模量,使其從彈性模量占優勢轉變成粘性模量占優勢,從而改變多糖的成膠性質;超聲使大粒車前子多糖分子量降低,分子量分布發生變化;超聲后流體力學半徑Rh、回旋半徑Rg均下降,說明多糖在溶液中的聚集狀態被破壞;超聲前后ρ(ρ=Rg/Rh)、Mark-Houwink公式得到的α值、特性粘度[η]的變化表明,超聲使大粒車前子多糖在溶液中的構象從高支化結構向柔性的無規則線團轉變。通過對多糖抗氧化活性及對巨噬細胞RAW264.7的活性評價,結果表明大粒車前子多糖具有良好的抗氧化活性,對巨噬細胞的免疫活性,且經過超聲均有顯著提高。

本研究通過對大粒車前子多糖超聲解聚的研究,為進一步研究分析大粒車前子多糖及其解聚產物各組分的活性打下了基礎,同時為高粘度多糖的解聚研究提供了參照。而對于車前子多糖解聚各組分的理化性質及其生理活性,仍需要進一步研究。

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Effects of ultrasonic depolymerization on the rheological property, solution conformation and activities of polysaccharides isolated from the seeds ofplantagoasiaticaL.

XIA Qiang,HUANG Dan-fei,YU Qiang,NIE Shao-ping,XIE Ming-yong*

(State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China)

To study the ultrasonic degradation’s effects on rheological properties,molecular weight and molecular weight distribution,conformation in solution,antioxidant activity andinvitroimmune of polysaccharide isolated from the seeds ofPlantagoasiaticaL.(PLCP),rheometer was used to detect static and dynamic rheological property of these treated samples,GPC/SEC-MALS system was used to detect molecular weight and solution conformation,infrared spectroscopy was used to characterize the structure of the polysaccharide.Invitroantioxidant activities were evaluated by DPPH radicals scavenging capacity,ferric ion reducing antioxidant capacity,and oxygen radical absorbance capacity. Theinvitroimmunoregulatory activities was detected by macrophage RAW264.7 proliferation assay,neutral red phagocytosis test and NO production test. Ultrasonic degradation’s effects on PLCP were as follow:the apparent viscosity was sharply declined,rheological property was changed from pseudoplastic fluid into Newtonian fluid. The elastic modulus G′ and the viscous modulus G″ were reduced,gel properties were decreased. Molecular weight was degraded,the molecular weight distribution was narrowed after the first widen. Structural parameters ρ was decreased,Mark-Houwinkαvalue was increased. Solution conformation changed from highly branched structure into a random coil. The intrinsic viscosity[η]was decreased.The solution had more compact conformation. The main infrared absorption peak did not changed,the main polysaccharide functional groups did not changed. DPPH radical scavenging and ferric reducing ability was increased,oxygen free radical scavenging capacity did not changed significantly,ability for promoting macrophage phagocytosis,proliferation,secrete NO were significantly increased.

polysaccharides;ultrasonic depolymerization;rheological property;solution comformation;antioxidant activity;immunoregulatory activity

2016-03-16

夏強(1992-)，男，碩士研究生，研究方向：食品化學,E-mail：huakaijianwo2009@163.com。

謝明勇(1957-)，男，博士，教授，研究方向：食品化學、食品營養與安全，E-mail：myxie@ncu.edu.cn。

國家自然科學基金重點資助項目(31130041)；國家自然科學基金資助項目(31260364)；江西省教育廳青年科學基金項目 (GJJ11050)；食品科學與技術國家重點實驗室青年骨干研究基金項目(SKLF-QN-201107)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)17-0081-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.007