新疆家蠶抗菌肽在釀酒酵母中表達的實時監測及活性分析

劉東亮,劉　軍,張富春

(新疆大學生命科學與技術學院,新疆生物資源基因工程重點實驗室,新疆烏魯木齊 830046)

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新疆家蠶抗菌肽在釀酒酵母中表達的實時監測及活性分析

劉東亮,劉軍,張富春*

(新疆大學生命科學與技術學院,新疆生物資源基因工程重點實驗室,新疆烏魯木齊 830046)

本研究對新疆家蠶抗菌肽在釀酒酵母INVSc1菌株中分泌表達過程進行了實時監測及活性測定。結果表明,選擇培養基中酵母表現為典型的S型生長曲線;誘導培養基中酵母表現為波浪式緩慢上升的曲線,上升的時間和速度與酵母的初始接菌密度有關。誘導過程補加少量20%半乳糖誘導劑可以明顯抑制酵母的生長,同時,酵母細胞平板計數結果也表明補加半乳糖使釀酒酵母出芽增殖減緩,菌落計數減少。研究發現誘導過程補加半乳糖不僅可以使發酵液中總蛋白的含量提高約50%,還可以使酵母分泌蛋白的時間提前。抗菌實驗表明,抗菌肽對大腸桿菌抑菌效果較好,發酵液上清對大腸桿菌的最大抑菌圈直徑為52 mm;對金黃色葡萄球菌的抑菌活性較弱,最大抑菌圈直徑為20 mm。

新疆家蠶抗菌肽,釀酒酵母,蛋白表達,抑菌活性

抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)是生物體內經誘導產生的一類具有生物活性的小分子多肽,作為抵御病原體入侵的第一道防線,是生物體天然免疫系統的重要組成部分[1-4]。通常所說的抗菌肽一般為陽離子抗菌肽(Cationic antimicrobial peptides,CAMPs),由12～50個氨基酸組成,帶有2個以上的正電荷以及50%左右的疏水氨基酸組分[5]。家蠶抗菌肽是世界上第一個被分離鑒定的抗菌肽,1980年由Hultmark等[6-7]從惜古比天蠶的蠶蛹中分離得到,并將其命名為cecropin。截至2016年5月,國際權威抗菌肽數據庫APD(http://aps.unmc.edu/AP/main.php)共收錄了世界范圍內2706條抗菌肽,它們大多具有抗細菌、抗真菌、抗病毒、抗腫瘤、抗寄生蟲等多種生物活性[8-9]。

新疆家蠶抗菌肽(CecropinXJ),屬于cecropin B家族,是一種典型的兩親性α-螺旋陽離子抗菌肽,其分子量約為4080 u,由37個氨基酸殘基組成[10]。新疆家蠶抗菌肽基因cecropinXJ首先由李金耀等[11]從新疆家蠶品種新蠶三號組織中經反轉錄PCR(RT-PCR)的方法獲得,并構建到原核表達載體,在大腸桿菌BL21細胞中成功表達。此外cecropinXJ基因被劉忠淵[12-13]、夏麗潔[14]等構建到真核表達載體并分別在畢赤酵母和釀酒酵母中高效表達,表達產物具有較好的抗細菌、耐高溫、耐高鹽、耐酸堿,以及低溶血等生物活性。

酵母系統表達抗菌肽的優勢在于其不僅可以使抗菌肽進行分泌表達,利于后期的分離純化,還可以在抗菌肽表達后對其進行翻譯后加工、糖鏈合成[13]以及羧基端酰胺化[15]等修飾工作,最大程度保留了抗菌肽自身的理化特性。本研究利用釀酒酵母INVSc1菌株分泌表達CecropinXJ,探討了發酵種子接種密度以及發酵過程增補誘導劑對抗菌肽發酵以及酵母自身生長的影響,為新疆家蠶抗菌肽發酵條件的優化和工業生產提供參考資料。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

pYES2/CT/αFactor-cecropinXJ家蠶抗菌肽重組表達質粒以及含有該重組質粒的釀酒酵母INVSc1株由本實驗室構建保藏[14];大腸桿菌EscherichiacoliDH5α和金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus測試菌株本實驗室保藏。SD選擇培養基(尿嘧啶缺陷型,Ura-),誘導培養基(Ura-)培養基均購自Clontech公司;BCA Protein Assay Kit購自TIANGEN公司;96微孔ELISA板購自JET BIOFIL公司;其他生化試劑均為國產分析純。

牛津杯(6 cm×8 cm×10 mm)東臺市吉泰不銹鋼制品廠;Benchmark Plus微孔板分光光度計BIO-RAD公司;SORVALL LYNX 6000高速離心機Thermo Scientific公司;ZHWY-111C恒溫培養振蕩器上海智城分析儀器制造有限公司;GNP-9050型隔水式恒溫培養箱上海精宏實驗設備有限公司;-80 ℃超低溫冰箱SANYO公司。

1.2實驗方法

1.2.1酵母培養根據invitrogen公司酵母實驗手冊進行酵母的培養及誘導[16]。取-80 ℃保存的含有pYES2/CT/αFactor-cecropinXJ重組質粒的釀酒酵母INVSc1菌種在固體選擇培養基(Ura-)上劃線,30 ℃恒溫培養箱培養48 h。挑取酵母單克隆接種于15 mL液體選擇培養基中(Ura-),30 ℃恒溫振蕩培養30 h。將酵母培養物接種于50 mL的誘導培養基中(Ura-),30 ℃恒溫振蕩過夜培養,1500×g離心10 min,棄上清。將收集的酵母細胞重懸于100 mL新鮮的誘導培養基中(Ura-),并調整酵母細胞在培養基中的光密度值(OD600)為0.4和0.8各2瓶,30 ℃恒溫培養振蕩器培養136 h。培養至36 h時，分別在1#和3#酵母培養體系中補加少量20%無菌半乳糖溶液；培養至92 h時，1#，2#，3#，4#酵母培養體系均補充加入少量的20%無菌半乳糖溶液。

1.2.2酵母生長曲線的測定采用紫外分光光度計法測定酵母懸液OD值并繪制酵母的生長曲線[17]。取酵母單克隆接種于液體選擇培養基(Ura-),30 ℃恒溫振蕩培養30 h,每隔3 h取酵母培養物測定OD600光密度值,繪制酵母生長曲線。將酵母培養物接種于誘導培養基,為了研究起始接菌密度對酵母又到表達時間的影響,調整酵母細胞在培養基中的光密度值(OD600)分別為0.4和0.8[16],30 ℃恒溫振蕩培養進行誘導表達,分別收集0,2,4,8,12,16,20,24,28,32 h酵母培養物測定OD600光密度值,繪制抗菌肽誘導階段的酵母生長曲線。

1.2.3酵母計數采用倍比稀釋法進行平板菌落計數[18-19]。取誘導時間為0,4,12,24,36,44,68 h的酵母培養物,分別用誘導培養基(Ura-)稀釋10-3,10-4和10-5不同倍數,取10 μL稀釋液滴加到固體選擇培養基(Ura-)上,置于30 ℃恒溫培養箱培養48 h后進行菌落計數,每個稀釋梯度計數3次。

1.2.4發酵液蛋白質含量的測定分別取誘導時間為0,2,4,8,12,16,20,24,28,32,36,40,44,52,68,76,84,92,100,112,124,136 h的酵母發酵液1 mL,1500×g離心10 min,收集上清。用BCA法[20]測定不同誘導時間發酵液中總蛋白在562 nm處吸光度。

1.2.5發酵液抑菌活性的測定分別取誘導時間為0,4,12,36,52,76 h的酵母發酵液1 mL,1500×g離心10 min,收集上清,用0.22 μm的無菌濾膜進行過濾。采用牛津杯抑菌圈法[21]檢測不同發酵時期發酵液中抗菌肽對E.coliDH5α和S.aureus細菌的抑制效果,每個牛津杯中加入100 μL濾出液。

1.2.6數據分析實驗數據以Mean±SD表示(n=4),采用單因素方差分析,所有統計計算均采用GraphPad Prism 6(version 6.01)統計學軟件進行分析,p<0.05認為具有統計學意義。

2　結果與分析

2.1誘導前后酵母細胞生長情況的監測

挑取4個釀酒酵母單克隆,分別在15 mL選擇培養基中振蕩培養30 h,對酵母不同生長階段的菌體密度進行分光光度計測定,并繪制了酵母的生長曲線圖,實驗結果見圖1。由圖1可知,0～6 h為延滯期,6～27 h為對數生長期,27 h時培養物在600 nm處的吸光值達到最大,OD600為1.1。盡管釀酒酵母的生殖方式屬于出芽生殖,不同于細菌的二分裂繁殖,但本研究中檢測到的釀酒酵母INVSc1菌株的生長曲線類似于細菌典型的S2型曲線。

圖1　釀酒酵母在選擇培養基中的生長情況(n=4)Fig. 1　The growth curve of Saccharomyces cerevisiae INVSc1 strain in selective medium(n=4)

將選擇培養基中生長的釀酒酵母接種于誘導培養基。酵母細胞在誘導培養基中的初始濃度OD600分別設定為0.4和0.8兩個水平,比較誘導過程初始菌體濃度對抗菌肽發酵的影響。選取0,2,4,8,12,16,20,24,28,32,36,40,44,52,68,76,84,92,100,112,124,136 h時間點,對釀酒酵母在誘導培養基中的生長情況進行了監測,結果見圖2。由圖2可知,釀酒酵母在誘導過程中菌體密度增大。當初始光密度值為0.8時,3#和4#酵母培養物24 h后菌體密度開始明顯增加;當OD600為0.4時,1#和2#酵母培養物培養52 h后菌體密度才開始緩慢增加。整體而言,酵母光密度值增加水平不如在選擇培養基中增加明顯,為了說明誘導過程是否影響了酵母的增殖,分別在1#和3#單克隆菌株培養至36 h時補充加入少量20%無菌半乳糖溶液,結果發現,與加入等量無菌水的2#和4#單克隆菌株相比,半乳糖的加入明顯降低了酵母的吸光值。當培養至92 h時,1#,2#,3#,4#酵母培養體系均補充加入少量的20%無菌半乳糖溶液,隨后4個培養體系中的酵母光密度值均發生了明顯降低。這些結果表明誘導過程影響了酵母細胞的增殖。

圖2　釀酒酵母在誘導培養基中的生長情況Fig.2　The growth curve of Saccharomyces cerevisiae INVSc1 strain in induction medium注:1#,2#,3#,4# 代表來源于不同的酵母單克隆。

2.2發酵液中酵母細胞數目的監測

為了直觀反映誘導培養基中酵母生長情況的變化,對不同誘導時間的發酵液稀釋不同倍數,在四分區的培養板上進行酵母細胞計數。選擇對1#和4#培養體系中的細胞分別進行計數,酵母在平板上的生長情況見圖3和圖4,菌落計數數據見圖5。

圖3　1#釀酒酵母在不同誘導時間的菌落計數Fig.3　The colony counting of Saccharomyces cerevisiae 1# at different induction periods注:0,4,12,24,36,44,68代表不同誘導時間(h);10-3,10-4,10-5代表稀釋倍數，圖4同。

圖4　4#釀酒酵母在不同誘導時間的菌落計數Fig.4　The colony counting of Saccharomyces cerevisiae 4# at different induction periods

如圖3和圖4所示,當稀釋度為10-3時,仍可以看到固體培養基生長了大量的酵母單克隆,不利于細胞計數;當稀釋度為10-4和10-5,可以清晰地分辨固體培養基生長的酵母單克隆,利于酵母細胞計數。分別對1#和4#培養體系稀釋度為10-4和10-5的酵母發酵液進行平板計數(表1所示),并繪制了不同誘導時間的菌落數變化曲線圖,結果見圖5。圖5顯示,當稀釋度為10-4時,誘導4 h,1#培養體系中酵母細胞的數目增多,4#培養體系中酵母細胞的數目明顯減少;4～68 h內的計數結果顯示,1#培養體系中酵母細胞的數目先減少,后維持大致一致,4#培養體系中酵母細胞的數目呈現緩慢增加的趨勢,這與圖2中相同時間段內反映的結果一致。

圖5　釀酒酵母在不同誘導時間的菌落數變化折線圖Fig.5　The counting curve of Saccharomyces cerevisiae at different induction periods注:1#,4#代表來源于不同的酵母單克隆;10-4,10-5代表稀釋倍數。

2.3發酵液中總蛋白含量的監測

與非誘導培養相比,誘導過程中酵母細胞生長受限,數目緩慢增加,表明其細胞內的代謝過程發生了微妙的變化。誘導過程中,蛋白質的表達是酵母細胞的主要生命活動。因此,本研究用BCA法分別對1#,2#,3#,4#酵母培養體系的總蛋白含量進行了連續監測繪成曲線,如圖6所示,2#培養體系中總蛋白的含量在52 h之后才出現明顯增加;4#培養體系總蛋白含量在36 h后就出現明顯增加,這可能與兩種培養體系中初始酵母光密度值不同有關。盡管1#和3#兩種培養體系的初始酵母光密度值也不同,但二者總蛋白的含量在36 h之后都發生了非常顯著增加,表明半乳糖的補充使酵母分泌蛋白的時間提前。40 h時,1#和3#兩種培養體系總蛋白在562 nm的吸光值幾乎比36 h時增加了50%,這種增加趨勢一直持續到70 h左右才出現降低,這與1#和3#培養體系在36 h補充加入少量半乳糖誘導劑有關。同時注意到,補充誘導劑的效應遠大于初始酵母光密度值差異的效應。所以盡管1#和3#培養體系初始酵母光密度值存在差異,但在同時補充半乳糖后,二者總蛋白含量被提升到了同樣高的水平。類似地,在92 h第二次補加半乳糖以后,四個培養體系中總蛋白質的含量又出現了反彈上升。

圖6　酵母誘導過程中發酵液總蛋白含量變化情況Fig.6　Evaluation of the protein content in medium during induction periods注:1#,2#,3#,4# 代表來源于不同的酵母單克隆。

2.4發酵液抗菌活性的監測

本研究對新疆家蠶抗菌肽酵母發酵液的抗細菌活性進行了測定,測試菌株為常見的革蘭氏陰性菌E.coli和革蘭氏陽性菌S.aureus。結果如圖7所示,不同誘導時間的抗菌肽發酵液對E.coli均具有明顯的抑菌活性,0,4,36,44,68、76 h的抑菌圈較大,其中0 h抑菌圈可能與抗菌肽本底表達有關;抗菌肽發酵液對S.aureus的抑菌活性沒有對E.coli的抑菌活性高,僅44,68、76 h的誘導發酵液顯示出較大的抑菌圈,這可能與發酵液中抗菌肽的有效濃度以及S.aureus對抗菌肽的敏感度有關。抑菌圈直徑大小見圖8。

圖7　酵母發酵液上清對不同細菌抑菌效果的評價Fig.7　The antimicrobial effects of fermentation liquor on E.coli and S.aureus注:0,4,12,24,36,44,68,76代表不同誘導時間發酵液(h)。

圖8　不同誘導時間酵母發酵液上清的抑菌圈柱形圖Fig.8　The inhibitory zone of fermentation liquor on E.coli and S.aureus

3　結論

微生物的生長、發酵及代謝產物的積累受到培養基類型、誘導劑、溫度、通氣量、培養時間等諸多非生物因素的影響[22]。前期研究,夏麗潔等[14]對釀酒酵母系統表達Cecropin XJ進行了優化及搖瓶培養,本研究在此基礎上進一步討論了酵母初始接種量以及誘導過程中補加誘導劑對酵母生長和抗菌肽發酵的影響,以期為酵母培養和Cecropin XJ的發酵生產提供參考。

首先對釀酒酵母生產菌株INVSc1在不同培養基中的生長情況進行了實時監測,初步掌握了酵母在不同生產階段的增殖情況;然后對發酵階段不同時期的酵母數目進行了平板菌落計數。酵母在發酵過程中,細胞機能常會出現退化、增殖力下降、自溶等現象,造成酵母數量的減少[23];另一方面抗菌肽表達并分泌到培養基中,隨著時間的延長以及抗菌肽的積累很可能對酵母細胞也產生一定的毒害作用,因此造成發酵階段酵母細胞的生長過程受到抑制[24]。另外,發酵液中總蛋白的含量并不是在誘導一開始就快速增加,而是在經過一段調整期之后才開始增加,本研究發現初期酵母接菌量的多少直接影響到調整期的長短,初始接種密度為0.8比接種密度0.4的調整期縮短近16 h(圖6)。誘導期間隨著時間的延長,誘導劑被不斷消耗,抗菌肽的發酵也會受到影響。因此,本研究討論了誘導過程補加誘導劑的作用,我們發現補加誘導劑不僅可以縮短調整期,還可以有效促進酵母細胞的蛋白表達和分泌,補加誘導劑后可以使抗菌肽的高效表達維持30 h(圖6)左右,所以誘導過程中補加一定量的半乳糖誘導劑十分必要,如果發酵時間較長,建議30 h補加一次半乳糖。

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Real-time monitoring the Cecropin XJ expression inSaccharomycescerevisiaeand evaluation of antibacterial activity

LIU Dong-liang,LIU Jun,ZHANG Fu-chun*

(Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering,College of Life Science and Technology,Xinjiang University,Urumqi 830046,China)

In the present study,the expression process of Cecropin XJ in INVSc1 strain ofSaccharomycescerevisiaewas real-timely monitored. Firstly,the growth states of yeast in SD selective medium(Ura-)and induction medium were measured,respectively. The result showed that a sigmoid growth curve and a wave-like rising curve were respectively observed in selective medium and induction medium. During the induction process,the rising rate of growth curve was related to the cell density at the beginning of induction. Furthermore,the growth of yeast was obviously suppressed after refilling some 20% galactose in induction culture. Similarly,the plate colony-counting assay indicated that galactose supplement lead to the decrease of yeast proliferation and colony numbers during the induction phase. Additionally,galactose supplement not only increased the protein content by 50% in the culture,but accelerated the protein secretion from yeast. The antibacterial assay revealed that the expression product exerted a significantly bactericidal ability againstE.coliwith the biggest inhibitory zone diameter of 52 mm,and a weak ability againstS.aureuswith a inhibitory zone diameter of 20 mm.

Cecropin XJ;Saccharomycescerevisiae;protein expression;antimicrobial activity

2016-03-01

劉東亮(1984-)，男，博士研究生，研究方向：新疆家蠶抗菌肽，E-mail：biove1986@126.com。

張富春(1962-)，男，博士，教授，研究方向：新疆生物資源的開發及利用，E-mail：zfcxju@qq.com。

新疆維吾爾族自治區高新技術研究和發展項目(201110101)；新疆生物資源基因工程重點實驗室開放基金(XJDX0201-2014-02)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)17-0129-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.016