蠶蛹蛋白源血管緊張素轉換酶抑制肽抑制機理研究

王朝陽,趙鐘興,陶萌良,王欣輝,孫華菊,魏雅男

(廣西大學化學化工學院,廣西高校資源化工應用新技術重點實驗室,廣西南寧 530004)

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蠶蛹蛋白源血管緊張素轉換酶抑制肽抑制機理研究

王朝陽,趙鐘興*,陶萌良,王欣輝,孫華菊,魏雅男

(廣西大學化學化工學院,廣西高校資源化工應用新技術重點實驗室,廣西南寧 530004)

以純化得到的兩條具有ACE抑制活性的肽(P1和P2)為基礎,通過基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI TOF MS)確定P1、P2的氨基酸序列,并采用固相合成法合成,隨后對它們的抑制動力學進行研究,最后用Sybyl軟件分別將其與ACE進行分子對接。結果表明:P1的氨基酸序列為Gly-Asn-Pro-Trp-Met(IC50值為12.61 μg/mL),為非競爭性抑制肽,抑制常數Ki,1=0.037 mmol/L;P2的氨基酸序列為Asn-Arg-Tyr-Leu-Arg(IC50值為14.68 μg/mL),為競爭性抑制肽,其抑制常數Ki,2=0.020 mmol/L;P1、P2都能與ACE活性位點氨基酸殘基形成氫鍵。P1、P2可以作為預防高血壓的功能性食品,為蠶蛹蛋白的進一步開發利用提供理論基礎。

蠶蛹蛋白,血管緊張素轉換酶,抑制肽,分子對接,抑制動力學

血管緊張素轉化酶(Angiotensin I-Converting enzyme,ACE,EC3.4.15.1)是一種在人體內廣泛存在的二羧肽酶,能夠催化血管緊張素Ⅰ生成血管緊張素Ⅱ,同時使舒緩激肽降解引起機體血壓升高[1]。目前,市場上常用藥物如卡托普利、賴諾普利等ACE抑制劑類藥物易引起干咳、味覺障礙、皮疹等副作用[2],越來越多的學者開始從自然界中尋找安全高效的ACE抑制劑類藥物。

蠶蛹是蠶蛾科昆蟲家蠶蛾的蛹,是桑蠶產業的主要副產物。研究表明,蠶蛹富含蛋白質,且氨基酸比例適當,是一種優質的蛋白質來源,其水解產物具有抗氧化、抗疲勞、降血壓等功能[3-6]。本課題組在前期實驗中已從蠶蛹蛋白酶解液中得到具有ACE抑制活性的肽P1和P2[7-8],本實驗通過基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI TOF MS)確定氨基酸序列,并對其抑制動力學進行研究,最后運用Sybyl軟件分別模擬所得肽與ACE活性位點結合情況,為蠶蛹源ACE抑制肽的工業化和應用提供理論和技術支持。

1　材料與方法

1.1材料與設備

肽P1(Gly-Asn-Pro-Trp-Met)和P2(Asn-Arg-Tyr-Leu-Arg)從蠶蛹蛋白酶解產物中分離純化得到[8],確定其氨基酸序列后由上海吉爾生化有限公司合成(經高效液相色譜法鑒定其純度98%以上)。

馬尿酰組氨酰亮氨酸(HHL)、血管緊張素轉換酶(ACE)美國Sigma公司;甲醇(色譜純)天津市科密歐化學試劑有限公司;賴諾普利(標準品)中國食品藥品檢定研究院;其他試劑均為分析純。

1260高效液相色譜儀美國安捷倫科技有限公司;SHZ-88水浴恒溫振蕩器金壇市醫療器械廠;4800基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀美國應用生物系統公司。

1.2實驗方法

1.2.1肽序列結構鑒定將純化得到的肽P1和P2樣品配成超純水溶液用于鑒定其氨基酸序列。取1 μL樣品在MALDI靶板上點樣晾干后加入1 μLα-氰基-4-羥基肉桂酸溶液,并以不加樣品的α-氰基-4-羥基肉桂酸溶液為空白對照。儀器工作模式為:一級質譜采用Refletor Positive,分子量為500～1500 u;二級質譜采用1KV positive。采用正離子模式和自動獲取數據的模式采集數據[9]。

1.2.2肽的固相合成按照鑒定出的肽的一級序列,采用固相合成法合成肽P1(Gly-Asn-Pro-Trp-Met)和P2(Asn-Arg-Tyr-Leu-Arg),該工作由上海吉爾生化有限公司完成,采用高效液相和電噴霧電離質譜檢測合成肽的純度及分子量,經高效液相色譜法鑒定其純度大于98%。

1.2.3抑制活性的測定根據呂汶駿等[7]檢驗ACE抑制活性的方法并加以改進,將ACE、HHL用硼酸緩沖液(濃度為0.1 mol/L、pH8.3,含NaCl 0.3 mol/L)分別配制0.1 U/mL ACE溶液和5.8 mmol/L HHL溶液。取適量樣品、硼酸緩沖液和ACE溶液共460 μL于離心管中,在37 ℃條件下保溫10 min;再加入40 μL HHL溶液反應,1 h后加入1.0 mol/L HCl溶液100 μL中止反應,同時以不加樣品為空白樣。反應液濾膜過濾后色譜分析。

使用Agilent 1260色譜系統,色譜柱為ZORBAX SB C18色譜柱(4.0 mm×150 mm,5 μm);流動相為甲醇∶水=15∶85(v/v)(含0.1%三氟乙酸);流速為1.0 mL/min;檢測波長為228 nm。根據空白和樣品反應液中馬尿酸峰面積計算抑制率。

式中,A為空白反應液中馬尿酸的峰面積,mAU;B為樣品反應液中馬尿酸的峰面積,mAU。

1.2.4抑制肽與ACE可逆反應類型判別根據1.2.3所述實驗方法,在加樣和空白的反應體系中,分別利用不同濃度ACE進行反應初速度檢測,并以賴諾普利為陽性對照。以ACE濃度[E]為橫坐標,反應初速度(V0)為縱坐標作圖,結合動力學曲線特征推斷P1和P2對ACE的抑制類型。

1.2.5抑制肽對ACE抑制類型判別根據1.2.3所述實驗方法,在HHL濃度分別為0.696、1.044、1.392、1.740、2.088 mmol/L的條件下,測定空白樣和樣品(P1、P2)濃度分別為20、40 μg/mL時ACE酶促反應速度,以賴諾普利為陽性對照(濃度分別為0.0001 μg/mL和0.0002 μg/mL)。繪制底物濃度[S]和反應初速度(V0)的Lineweaver-Burk雙倒數圖判斷P1和P2對ACE的抑制類型。不同類型抑制劑具有不同的動力學方程式,其中,非競爭性抑制劑的動力學方程如式(1)所示,競爭性抑制劑的動力學方程如式(2)所示[10],計算ACE米氏常數Km與P1和P2抑制常數Ki。

式(1)

式(2)

式中,V0-反應初速度,mmol/(L·min);vmax-最大反應速度,mmol/(L·min);[S]-底物HHL的濃度,mmol/L;[I]-ACE抑制肽的濃度,mmol/L;Km-米氏常數。

1.2.6抑制肽與ACE活性中心的模擬對接利用Sybyl X-2.1.1軟件構建多肽分子,使用Powell方法在Tripos力場下進行優化,采用Gasteiger-Huckel算法對各原子賦予電荷,完成后對多肽進行模擬退火計算搜索低能構象,初始溫度為1000 K,冷卻溫度為100 K,高溫平衡時間為1000 fs,降溫時間為1000 fs,進行10個循環,對搜索到的低能構象再進行能量優化,將得到的構象進行對接計算。

從PDB數據庫中下載ACE-賴諾普利復合物三維模型(代碼:1086)[11],使用Sybyl X-2.1.1的默認流程進行蛋白準備,用MMFF99力場進行分子優化后加氫、加電荷,同樣采用Gasteiger-Huckel算法賦予電荷,為處理方便,刪除復合物中的所有水分子,使用Surflex-dock模式進行對接,分子對接的原型分子是采用automatic模式產生的,其余參數為默認,每個對接分子保留20個構象,選用Total_Score 打分最高的構象進行分析。

2　結果與分析

2.1氨基酸序列的結構鑒定

對蠶蛹蛋白中性蛋白酶水解產物分離得到的兩條肽進行MALDI TOF MS解析。由圖1可知,它們的分子離子峰分別為604.31 u和721.34 u,通過解析得到P1氨基酸序列為Gly-Asn-Pro-Trp-Met(圖1a所示,b1～b5為肽P1的分子識別峰)、P2氨基酸序列為Asn-Arg-Tyr-Leu-Arg(圖1b所示,y1～y5為肽P2的分子識別峰),并對其ACE抑制活性進行測定,得到IC50值分別為12.61 μg/mL(P1)和14.68 μg/mL(P2)。對目前有關蠶蛹蛋白源ACE抑制多肽的文獻進行整理發現IC50值在5.01～47.00 μg/mL范圍內[12-15],與這些多肽相比本實驗中得到的蠶蛹蛋白源ACE抑制多肽具有較高的抑制活性。

圖1　抑制肽的MALDI TOF MS圖譜Fig.1　MALDI TOF MS spectrum of inhibitory peptide

2.2抑制肽對ACE可逆反應類型判別

根據抑制劑與酶結合的特點和作用方式,可以將抑制劑分為可逆性抑制劑和不可逆性抑制劑。根據1.2.3的實驗方法,以酶濃度[E]為橫坐標,反應初速度(V0)為縱坐標作圖,如圖2所示。當反應體系中不存在抑制劑時,反應速率曲線通過坐標系原點;當反應體系中分別加入P1、P2、賴諾普利后,反應速率曲線通過原點,但斜率比無抑制劑時減小,由此可以判斷P1、P2、賴諾普利對ACE均為可逆性抑制[16]。

圖2　抑制劑對ACE的抑制動力學曲線Fig.2　Inhibition kinetic curves of inhibitor on ACE

2.3抑制肽對ACE的抑制類型判別

根據抑制劑、底物和酶三者的相互關系,可逆抑制又可分為競爭性抑制、非競爭性抑制和反競爭性抑制三種類型。根據1.2.4所述實驗方法,繪制Lineweaver-Burk雙倒數圖,見圖3。加入P1的兩條速率曲線與沒有抑制劑的速率曲線相交于橫坐標說明P1為非競爭性抑制劑(圖3a),加入P2、賴諾普利的兩條速率曲線與沒有抑制劑的速率曲線相交于縱坐標,說明P2、賴諾普利為競爭性抑制劑(圖3b和圖3c)。

圖3　抑制劑對ACE的Lineweaver-Burk圖Fig.3　Lineweaver-Burk plots of inhibitors against ACE

將圖3a～圖3c中的數值分別帶入到式(1)、式(2)中,得到ACE的米氏常數Km=2.45 mmol/L,與文獻值相差不大(2.6 mmol/L)[17]。同時得到P1的抑制常數Ki,1=0.037 mmol/L,P2的抑制常數Ki,2=0.020 mmol/L,賴諾普利的抑制常數Ki,3=0.99×10-7mmol/L。抑制劑的抑制常數越小,其對酶的抑制作用越強。和賴諾普利相比,肽P1和P2對ACE的抑制作用較弱,與IC50值趨勢相同。

2.4抑制肽與ACE活性中心的模擬對接

2.4.1對接結果分析分子對接方法是從已知結構的受體(靶蛋白或活性位點)和配體出發,通過化學計量學方法模擬分子的幾何結構和分子間相互作用力來進行分子間相互作用識別并預測受體—配體復合物結構的方法[18]。為了研究抑制肽與ACE的相互作用,使用Sybyl軟件中的Surflex-dock模塊將常用藥物賴諾普利、底物HHL及P1、P2與ACE進行了分子對接,分子對接結果如圖4所示。

圖4　復合物的相互作用模型Fig.4　The interaction models of complex

在圖4a中賴諾普利與ACE的Glu162、Gln281、His353、Ala354、Lys511、Tyr520形成氫鍵,圖4b中HHL與ACE的Gln281、His353、Ala354、Lys511、His513、Tyr520形成氫鍵(圖4b),與文獻中的記錄吻合[19-20]。在圖4c中P1與ACE的Thr166、Gln281、Thr372、Asp377、Lys511、His513、Tyr520形成氫鍵,圖4d中P2與ACE的Gln281、Ala356、Glu403、Asp415、Lys511、Tyr520形成氫鍵。

據文獻報道,ACE活性中心主要由三部分構成(S1,S2和S1’),其中S1由Ala354,Glu384和Tyr523等氨基酸殘基組成,S2由Gln281、His353、Lys511、His513和Tyr520等氨基酸殘基組成,而S1’僅由氨基酸殘基Glu62組成[21]。P1能夠與活性中心的Gln281、Lys511、His513和Tyr520形成氫鍵,P2能夠與活性中心的Gln281、Lys511和Tyr520形成氫鍵,與已報道的蠶蛹蛋白源ACE抑制肽Ala-Ser-Leu[12](與活性中心Gln281、His353和Ala354形成氫鍵)和Ala-Pro-Pro-Pro-Lys-Lys[15](與活性中心的Glu162和His353形成氫鍵)相比,P1和P2能夠占據較多活性中心的氨基酸殘基。

2.4.2分子疊加分析將對接后的分子結構進行疊加,如圖5所示,賴諾普利分子和HHL分子能夠重疊,說明與賴諾普利結合后的ACE不能與底物HHL繼續結合,從分子結構上支持了賴諾普利屬于競爭性抑制劑[11]。同時,P2也可以和HHL分子進行疊合,而P1不能與HHL疊合,從分子結構上證明P2為競爭性抑制劑,P1為非競爭性抑制劑,與2.3的實驗結果一致。

圖5　HHL、賴諾普利、P1、P2與1086結構疊加Fig.5　Overlap of HHL,lisinopril,P1,P2 with 1086

3　結論

通過MALDI TOF MS對多肽序列進行分析,得到P1氨基酸序列為Gly-Asn-Pro-Trp-Met,P2氨基酸序列為Asn-Arg-Tyr-Leu-Arg,其IC50分別為12.61 μg/mL和14.68 μg/mL。通過抑制動力學曲線可知,P1、P2均為可逆性抑制;P1為非競爭性抑制劑,其抑制常數為Ki,1=0.037 mmol/L;P2為競爭性抑制劑,其抑制常數為Ki,2=0.020 mmol/L。分子對接結果表明,P1與ACE的Thr166、Gln281、Thr372、Asp377、Lys511、His513、Tyr520形成氫鍵;P2與ACE的Gln281、Ala356、Glu403、Asp415、Lys511、Tyr520形成氫鍵;與已報道的蠶蛹蛋白源ACE抑制多肽相比,可以占據更多ACE活性口袋中的氨基酸殘基。將對接后的分子進行疊加,P1不能和HHL分子重合,P2可以和HHL分子重合,從分子水平上證明了P1為非競爭性抑制肽,P2為競爭性抑制肽。

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Inhibition mechanism of angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptide from silkworm pupa protein

WANG Chao-yang,ZHAO Zhong-xing*,TAO Meng-liang,WANG Xin-hui,SUN Hua-ju,WEI Ya-nan

(School of Chemistry and Chemical Engineering,Guangxi University,Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of New Technology and Application in Resource Chemical Engineering,Nanning 530004,China)

Basing on two angiotensin I-converting enzyme(ACE)inhibitory peptides(P1 and P2)which were purified before,the amino acid sequences of P1 and P2 were determined by MALDI TOF MS,and then they were synthesized by solid phase peptide synthesis. Subsequently,their inhibition kinetics was studied. Finally,their molecular dockings to ACE were studied by Sybyl,respectively. Results showed that P1 was Gly-Asn-Pro-Trp-Met with an IC50value of 12.61 μg/mL,which was a non-competitive inhibition peptide with a Ki,1value of 0.037 mmol/L,and P2 was Asn-Arg-Tyr-Leu-Arg with an IC50value of 14.68 μg/mL,which was a competitive inhibition peptide with a Ki,2value of 0.020 mmol/L,and both of them could form hydrogen bond with the residue amino acid in the active site of ACE. P1 and P2 could be used as functional food against hypertension,which provide a theoretical basis for further development and utilization of silkworm pupa protein.

silkworm pupa protein;angiotensin I-converting enzyme;inhibitory peptides;molecular docking;inhibition kinetics

2016-03-03

王朝陽(1990-)，男，碩士研究生，研究方向：生物化工，E-mail：wcyang14@163.com。

趙鐘興(1979-)，男，博士，副教授，研究方向：生物化工，E-mail：zzxx@gxu.edu.cn。

國家自然科學基金(31401629)；廣西自然科學基金(2013GXNSFBA019031)；廣西研究生教育創新計劃(YCSZ2015026)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)17-0148-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.020