混菌固態(tài)發(fā)酵棉粕工藝參數(shù)的優(yōu)化

劉惠琴,田永強(qiáng),*,徐　力,張阿強(qiáng),陳錫明

(1.蘭州交通大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院,甘肅蘭州 730070;2.中國科學(xué)院寒區(qū)旱區(qū)環(huán)境與工程研究所,甘肅蘭州 730000)

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混菌固態(tài)發(fā)酵棉粕工藝參數(shù)的優(yōu)化

劉惠琴1,田永強(qiáng)1,*,徐力1,張阿強(qiáng)1,陳錫明2

(1.蘭州交通大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院,甘肅蘭州 730070;2.中國科學(xué)院寒區(qū)旱區(qū)環(huán)境與工程研究所,甘肅蘭州 730000)

利用產(chǎn)朊假絲酵母和從棉籽殼上分離得到的細(xì)菌M2對(duì)棉粕進(jìn)行混合固態(tài)發(fā)酵。通過分子生物學(xué)鑒定M2為產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca),在NCBI中獲得登錄號(hào)為KT962208。通過采用DPS v7.05統(tǒng)計(jì)軟件中的二因子有重復(fù)觀察值實(shí)驗(yàn)和均勻優(yōu)化實(shí)驗(yàn)分別對(duì)固態(tài)發(fā)酵的接種量和接種及發(fā)酵溫度、時(shí)間和初始含水量進(jìn)行優(yōu)化,并對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)論:得出混菌固態(tài)發(fā)酵棉粕的最佳接種量為4 mL/100 g,產(chǎn)朊假絲酵母與M2的接種比為7∶3,發(fā)酵溫度32.5 ℃,發(fā)酵時(shí)間54 h,底物初始含水量75%。此條件下游離棉酚的降解率為53.021%,粗蛋白含量為45.889%,且蛋白分子量有所減小。

混菌,固態(tài)發(fā)酵,棉粕,游離棉酚

棉粕是棉花加工業(yè)的主要副產(chǎn)品,其粗蛋白含量在36%～45%之間,含有維生素和礦物質(zhì)元素等多種營養(yǎng)物質(zhì),是一種較好的植物源蛋白飼料資源[1-4]。棉粕中的游離酚對(duì)動(dòng)物機(jī)體有毒害作用,還有抗?fàn)I養(yǎng)因子植酸、單寧、環(huán)丙烯脂肪酸等,限制了它在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用[5]。因此,對(duì)棉粕進(jìn)行脫毒處理,成為開發(fā)其利用價(jià)值的一項(xiàng)重要研究。微生物發(fā)酵是降低棉酚含量的有效方法之一[6]。

利用微生物發(fā)酵棉粕脫毒的方法可以不同程度消除游離棉酚對(duì)動(dòng)物體的毒害作用,若用能降解游離棉酚的益生菌發(fā)酵,還可以改善動(dòng)物體的腸道微生態(tài)環(huán)境,促進(jìn)動(dòng)物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收等。武漢工業(yè)學(xué)院的王小磊[7]等人對(duì)黑曲霉、米曲霉與釀酒酵母混合固態(tài)發(fā)酵對(duì)棉粕脫毒的發(fā)酵條件的研究,發(fā)酵后棉粕中游離棉酚的降解率達(dá)到96.2%;Xiao-Yan Weng[8]等人通過利用熱帶假絲酵母ZAU-1(Candida tropicalis ZAU-1)發(fā)酵棉粕,游離棉酚的降解率達(dá)到94.12%。研究表明還可以利用棉粕作輔料來生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白,如Anupama[9]等人利用玉米粉等來研究黑曲霉(Aspergillus niger)單細(xì)胞蛋白的生成條件。本研究采用馮莉[10]對(duì)接種量和接種比及發(fā)酵參數(shù)優(yōu)化所采用的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法,對(duì)產(chǎn)朊假絲酵母和M2混合發(fā)酵棉粕的工藝參數(shù)進(jìn)行了研究。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

棉粕、麩皮、玉米粉市場。

產(chǎn)朊假絲酵母(31272)中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC);M2從實(shí)驗(yàn)室提供的棉籽殼中分離獲得。

正己烷利安隆博華(天津)醫(yī)藥化學(xué)有限公司;異丙醇天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司;3-氨基-1-丙醇上海麥克林生化科技有限公司;冰乙酸利安隆博華(天津)醫(yī)藥化學(xué)有限公司;苯胺上海中泰化學(xué)試劑有限公司;實(shí)驗(yàn)室所用試劑均為分析純。

SW-CJ-1B型雙人單面凈化工作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備有限公司;LDZX-50FA型高壓蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠;HNY-1102C恒溫培養(yǎng)振蕩器天津市歐諾儀器儀表有限公司;722s型可見分光光度計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司;JSP-100型多功能高速粉碎機(jī)浙江省永康市金穗機(jī)械制造廠;KDN-08A凱氏定氮儀上海昕瑞儀器儀表有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1培養(yǎng)基的制備初篩培養(yǎng)基:醋酸棉酚無糖查氏培養(yǎng)基,硫酸銨0.5%、磷酸二氫鉀0.1%、氯化鈉0.01%、硫酸鎂0.05%、氯化鈣0.1%、酵母膏0.02%、醋酸棉酚0.2%(用丙酮溶解),自然pH,固體培養(yǎng)基加瓊脂1.8%～2%,在121 ℃下,滅菌20 min。

復(fù)篩及固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基:棉粕+玉米粉+麩皮=6∶2∶2,按比例稱取共30 g,置于480 mL組培瓶中,自然pH,在121 ℃下,滅菌20 min,然后按70%初始含水量將定量的無菌水加入組培瓶中,攪拌均勻,備用。

LB培養(yǎng)基:蛋白胨1%、牛肉膏0.5%、氯化鈉1%,自然pH,固體培養(yǎng)基加瓊脂1.8%～2%,在121 ℃下,滅菌20 min。

YPD培養(yǎng)基:葡萄糖2%、蛋白胨2%、酵母浸粉1%,自然pH,固體培養(yǎng)基加瓊脂1.8%～2%,在121 ℃下,滅菌20 min。

1.2.2菌種篩選稱取1 g棉籽殼,加入裝有50 mL液體醋酸棉酚無糖查氏培養(yǎng)基的三角瓶中,30 ℃下,150 r/min培養(yǎng)24 h后,梯度稀釋,然后分別吸取200 μL稀釋液,均勻涂布在醋酸棉酚無糖查氏培養(yǎng)基平板上,28 ℃下培養(yǎng),待長出單菌落后,挑去單菌落純化。將純化后的菌株接于種子液中,待生長至對(duì)數(shù)期,以干物質(zhì)質(zhì)量的8%接種于固態(tài)發(fā)酵進(jìn)行復(fù)篩。

1.2.3菌株鑒定對(duì)復(fù)篩得到的菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定,即提取復(fù)篩所得菌株的16S rDNA,送至測序公司進(jìn)行測序。

1.2.4復(fù)合固態(tài)發(fā)酵將酵母菌活化在YPD固體培養(yǎng)基上,28 ℃下培養(yǎng)48 h后,用接種環(huán)挑去3環(huán)接種于50 mL YPD液體培養(yǎng)基中,30 ℃、150 r/min培養(yǎng)20 h,備用。

將復(fù)篩所得菌株(M2)活化,接種于種子液培養(yǎng)基,生長至對(duì)數(shù)期,備用。

復(fù)合發(fā)酵接種量和接種比的優(yōu)化采用DPS v7.05統(tǒng)計(jì)軟件中的二因子有重復(fù)觀察值的設(shè)計(jì)方法,如表1所示,接種量和接種比分別以4水平和5水平設(shè)計(jì),實(shí)驗(yàn)共設(shè)20個(gè)處理組,每個(gè)處理組3個(gè)重復(fù)。測定指標(biāo)為發(fā)酵產(chǎn)物中游離棉酚的降解率。

表1　產(chǎn)朊假絲酵母和M2接種量和接種比優(yōu)化的因子與水平

復(fù)合發(fā)酵工藝參數(shù)包括發(fā)酵溫度、時(shí)間、初始含水量3個(gè)因素,實(shí)驗(yàn)采用DPS v7.05統(tǒng)計(jì)軟件設(shè)計(jì)3因素4水平的均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化發(fā)酵參數(shù),如表2所示。復(fù)合固體發(fā)酵條件參數(shù)的優(yōu)化設(shè)計(jì)方案如表3所示,實(shí)驗(yàn)共設(shè)4個(gè)處理組,每個(gè)處理組3個(gè)重復(fù)。測定指標(biāo)為發(fā)酵產(chǎn)物中游離棉酚的降解率。

表2　復(fù)合固態(tài)發(fā)酵工藝參數(shù)的因子水平

表3　復(fù)合固態(tài)發(fā)酵工藝參數(shù)的優(yōu)化均勻設(shè)計(jì)方案

1.2.5指標(biāo)測定方法游離棉酚的降解率:

游離棉酚的測定:采用國標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)GB13086-91,飼料中游離棉酚的測定方法。

粗蛋白含量的測定:參照GB/T 6432-94,飼料中粗蛋白測定方法。

蛋白質(zhì)分子量的測定:SDS-PAGE[11]。

2　結(jié)果與分析

2.1菌株篩選

實(shí)驗(yàn)初篩得到3株能在醋酸棉酚無糖查氏培養(yǎng)基上生長的菌,兩株細(xì)菌M1和M2,一株絲狀真菌M3,然后以8%的接種量接入固態(tài)發(fā)酵底物中,細(xì)菌發(fā)酵48 h,真菌發(fā)酵60 h后,經(jīng)測定所得結(jié)果如圖1所示。

圖1　初篩菌株固態(tài)發(fā)酵對(duì)游離棉酚的降解率 Fig.1　The degradation rate of free gossypol by screening strains solid state fermentation

由圖1可以得出,初篩所得的3株菌對(duì)游離棉酚的降解能力不同,由強(qiáng)到弱依次是:M2>M1>M3,對(duì)游離棉酚的降解率分別是36.599%、33.132%、14.297%。3株菌中M2對(duì)游離棉酚的降解率最大,因此,對(duì)M2進(jìn)行分子鑒定,并與產(chǎn)朊假絲酵母對(duì)棉粕復(fù)合固態(tài)發(fā)酵。

表4　二因子有重復(fù)觀察值實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注:同行同項(xiàng)數(shù)據(jù)肩標(biāo)大寫字母不同表示差異極顯著(p<0.01),小寫字母完全不同表示差異顯著(p<0.05),含有相同字母表示差異不顯著(p>0.05)。2.2菌株鑒定

對(duì)復(fù)篩所得對(duì)游離棉酚降解能力較強(qiáng)的菌株M2進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定,提取M2的DNA,并用通用引物擴(kuò)增:上游引物為5′-GAGCGGATAACAA TTTCACACAGG-3′,下游引物為5′-CGCCAGGGTTTT CCCAGTCACGAC-3′,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖2所示,擴(kuò)增后送至測序公司進(jìn)行測序。通過BLAST將M2的擴(kuò)增序列進(jìn)行比對(duì),得出菌株M2與產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)相似性為99%。將M2的擴(kuò)增序列提交至GenBank,獲得登錄號(hào)為KT962208。

圖2　PCR電泳圖Fig.2　Electrophoresis map of PCR 注:M為Mark;1為空白對(duì)照;M2為目的片段。

2.3復(fù)合發(fā)酵接種量和接種比的優(yōu)化

適宜的接種量對(duì)固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中菌體的生長影響較大,適宜的接種量不僅可以縮短菌株生長的延滯期,以減少發(fā)酵時(shí)間,而且還可使菌體迅速生長、繁殖,占據(jù)整個(gè)培養(yǎng)的環(huán)境,以減少雜菌的污染。通過DPS v7.05對(duì)表4中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,得到表5所示的不同接種量與接種比對(duì)棉粕發(fā)酵底物中游離棉酚降解率的影響。

表5　不同接種量與接種比例對(duì)棉粕發(fā)酵底物中游離棉酚降解率的影響

注:同行同項(xiàng)數(shù)據(jù)肩標(biāo)大寫字母不同表示差異極顯著(p<0.01),小寫字母完全不同表示差異顯著(p<0.05),含有相同字母表示差異不顯著。由表5可得,當(dāng)接種量為4、6、8 mL/100 g時(shí),隨著接種量的增加,降解率逐漸降低,接種量為4 mL/100 g時(shí),降解率最大,為42.628%,且差異極顯著(p<0.01);當(dāng)接種量為10 mL/100 g時(shí),降解率為41.385%,且差異不顯著,其原因可能是發(fā)酵底物沒有攪拌均勻。隨著接種比的變化,降解率先升高后降低,產(chǎn)朊假絲酵母與M2的比例為7∶3時(shí),降解率最大,為43.355%,差異極顯著(p<0.01)。因此,兩種菌的最佳組合為A1B4,即接種量為4 mL/100 g,接種比為7∶3。

通過表5還可得出,接種量、接種比及其互作對(duì)游離棉酚降解率的影響都極顯著(p<0.01),其主次效應(yīng)順序?yàn)榻臃N量(A)、互作效應(yīng)(A×B)、接種比(B)。

2.4復(fù)合發(fā)酵工藝參數(shù)的優(yōu)化

采用DPS v7.05統(tǒng)計(jì)軟件,以游離棉酚的降解率作為目標(biāo)函數(shù)Y,對(duì)表6的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行逐步回歸分析,得到線性回歸方程:Y=26.50-0.76X1+0.48X3,X2與游離棉酚的降解率回歸關(guān)系非常小,因而在回歸方程中被剔除。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析,該方程的決定系數(shù)R2=0.9964,表明該回歸方程與實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合度極好。溫度(X1/ ℃)、初始含水量(X3/%)與Y的偏相關(guān)系數(shù)分別為-0.9904、0.9978,經(jīng)檢驗(yàn),X3對(duì)游離棉酚的降解率有極顯著的影響(p<0.01),而X1對(duì)游離棉酚的降解率有顯著的影響(p<0.05)。由回歸方程可得,游離棉酚的降解率與X1呈負(fù)相關(guān),與X3呈正相關(guān),因此最佳的發(fā)酵條件為溫度32.5 ℃,發(fā)酵時(shí)間為54 h,底物初始含水量為75%。

表6　固態(tài)發(fā)酵工藝參數(shù)的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5發(fā)酵物中粗蛋白含量及蛋白分子量的變化

由表7可知,當(dāng)接種量為4 mL/100 g,產(chǎn)朊假絲酵母與M2的接種比為7∶3,發(fā)酵溫度32.5 ℃,發(fā)酵時(shí)間54 h,底物初始含水量75%時(shí),游離棉酚的降解率為53.021%,與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。發(fā)酵后底物中粗蛋白含量為45.889%,與發(fā)酵前相比,升高了2.037%,其原因可能是產(chǎn)朊假絲酵母的菌體蛋白。由圖3可知,發(fā)酵后的蛋白分子量與發(fā)酵前相比相對(duì)較小,大分子蛋白在一定程度上有所減少。

表7　驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖3　SDS-PAGE分析Fig.3　SDS-PAGE analysis注:1.Mark;2.對(duì)照組;3,4,5.實(shí)驗(yàn)組。

3　結(jié)論

首先,從棉籽殼中分離出一株能降解游離棉酚的細(xì)菌M2,并鑒定為為產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca),讓其與產(chǎn)朊假絲酵母復(fù)合固態(tài)發(fā)酵棉粕,得出這兩株菌復(fù)合發(fā)酵對(duì)游離棉酚的降解率與它們分別發(fā)酵時(shí)的降解率高,這說明這兩株菌之間沒有拮抗作用,可能存在互利共生的作用。通過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化,得到其最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為接種量為4 mL/100 g,產(chǎn)朊假絲酵母與M2的接種比為7∶3,發(fā)酵溫度32.5 ℃,發(fā)酵時(shí)間54 h,底物初始含水量75%,pH自然。在此條件下游離棉酚的降解率最高,達(dá)到53.021%。

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Optimization of the process parameters of cottonseed cake by solid-state fermentation with mixed culture

LIU Hui-qin1,TIAN Yong-qiang1,*,XU Li1,ZHANG A-qiang1,CHEN Xi-ming2

(1.Lan Zhou Jiao Tong University,Chemical and Biological Engineering College,Lanzhou 730070,China; 2.Cold and Arid Regions Environmental and Engineering Research Institute, Chinese Academy of Sciences,Lanzhou 730000,China)

By using Candida utilis and bacteria M2 that was isolated from cottonseed shell to be solid-state fermentated cottonseed meal. Molecular identification showed that M2 was Klebsiella oxytoca and the login number was KT962208 in the NCBI. By using the two factors have repeated observation value test and uniform design test of DPS v7.05 statistical software to respectively optimize inoculum and inoculation ratio,and the fermentation temperature,time and initial containing water of solid state fermentation.And analyzed these experimental data. Finally,come to the conclusion that the best inoculation amount was 4 mL/100 g and the inoculation ratio of Candida utilis yeast and M2 was 7∶3,the fermentation temperature was 32.5 ℃,time was 54 h,initial containing water was 75%. Under this kind of condition,the degradation rate of gossypol was 53.021%,the crude protein content was 45.889%,and the molecular weight of the protein has slightly decreased.

mixed bacteria;solid state fermentation;cottonseed meal;free gossypol

2016-01-14

劉惠琴(1989-)，女，碩士研究生，研究方向：工業(yè)微生物發(fā)酵，E-mail：huiqin4625@163.com。

田永強(qiáng)(1972-)，男，博士，教授，從事微生物分離、鑒定和應(yīng)用研究，E-mail：357181873 @qq.com。

甘肅省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(613035)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)17-0211-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.033