漆酶在食品領域的應用研究進展

張　昱,趙　倩,李冠華

(內(nèi)蒙古大學生命科學學院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010021)

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漆酶在食品領域的應用研究進展

張昱,趙倩,李冠華*

(內(nèi)蒙古大學生命科學學院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010021)

漆酶在食品領域的應用日漸深入而廣泛。論文介紹漆酶催化特征及優(yōu)點;綜述漆酶在果汁加工、葡萄酒釀造、面粉改良、食用菌栽培、食品檢測、食品廢水處理、牛奶凝膠化方面的研究概況;展望漆酶食品工業(yè)的發(fā)展前景。

漆酶,食品領域,應用,催化

1883年日本學者Yoshida在紫膠漆樹(Rhusverniciflua)汁液中發(fā)現(xiàn)一種能夠催化酚類物質(zhì)的蛋白質(zhì),1884年Bertrand將這種蛋白質(zhì)命名為漆酶(laccase)[1]。漆酶在高等植物、真菌、昆蟲和細菌中均有發(fā)現(xiàn),真菌是漆酶的重要生產(chǎn)者,特別是大型擔子菌和子囊菌,已報道數(shù)量達120多種[2]。工業(yè)用漆酶通過發(fā)酵獲得,包括固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵,液態(tài)發(fā)酵是漆酶的主要生產(chǎn)方式,菌種涉及細菌和真菌。細菌發(fā)酵周期短,表達量高,但漆酶氧化還原電勢較低故應用范圍有限。真菌漆酶氧化還原電勢高,但生長緩慢,表達量低。構(gòu)建工程菌株,實現(xiàn)真菌漆酶基因在米曲霉、里氏木霉、釀酒酵母等生物中異源表達是解決上述問題的重要途徑。漆酶已有一百多年的研究應用歷史,由于其獨特的催化特性,被稱為綠色化學中的藍色酶,在生物、食品、環(huán)境、能源、材料等領域[3-4]具有潛在應用價值。1996年Novozymes推出第一個商品化漆酶DeniLite?I應用于紡織和造紙行業(yè),隨后推出Suberase?應用于食品行業(yè)[5]。本文將就漆酶的催化特征及在食品領域的應用進展進行綜述。

1　漆酶的催化特征

1.1漆酶的結(jié)構(gòu)

漆酶是一種糖蛋白,由肽鏈、糖配基和Cu2+組成,屬藍色多銅氧化酶家族(blue multi-copper oxidase),在氧氣參與下可催化多酚、多氨基苯等物質(zhì),使之生成相應的苯醌和水。Cu2+是漆酶催化活性中心,根據(jù)磁學和光譜性質(zhì)差異,漆酶的Cu2+分為三類:Ⅰ型Cu2+呈順磁性,是單電子受體,與半胱氨酸的S結(jié)合形成共價鍵,在600 nm處有較強吸收峰,呈藍色;Ⅱ型Cu2+各一個,呈順磁性,是單電子受體,可與兩個組氨酸(His)和一個水分子配位形成松散的T型結(jié)構(gòu),在600 nm處無較強吸收峰,不顯藍色;Ⅲ型Cu2+,是雙電子受體,以耦合離子對(Cu2+Cu2+)的形式存在,與3個組氨酸(His)和一個氫氧橋配位形成四面扭曲的四方立體結(jié)構(gòu)。典型的漆酶中三種類型的Cu2+都存在,漆酶呈藍色,常被稱為“藍色漆酶”。隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)部分漆酶中缺少Ⅰ型Cu2+,這類漆酶呈白色,被稱為“白色漆酶”,有些漆酶中Cu2+在600 nm處無顯著吸收峰,而在300 nm處有顯著吸收峰,呈黃色,被稱為“黃色漆酶”[6]。藍色漆酶需要有小分子介體物質(zhì)協(xié)助參與催化氧化非酚型化合物,而黃色漆酶則能夠在無外源介體的情況下催化氧化非酚型化合物。

1.2漆酶的催化過程

圖1　漆酶催化電子轉(zhuǎn)移示意圖Fig.1　Map of electron transport during laccase catalyzed process

漆酶催化屬于雙底物的酶促反應,在氧分子參與的條件下,利用Cu2+的氧化能力對還原性底物進行氧化[7],即漆酶催化底物將單電子傳遞給分子氧,氧氣得電子被還原生成水,底物失去一個電子,形成自由基,自由基不穩(wěn)定,進一步發(fā)生聚合或解聚等非酶催化反應,機制為乒乓反應,基本過程如圖1所示。漆酶催化過程比較復雜,可分為3種方式:漆酶將底物分子直接氧化形成帶自由基的化合物;通過介體參與完成對具有高氧化還原電勢底物的催化;漆酶氧化介體,進一步氧化黃素酶,由氧化的黃素酶完成對底物催化,而氧化的黃素酶通過脫氫酶系以實現(xiàn)再生。介體的參與可以擴展漆酶的應用范圍,漆酶介體的催化反應途徑受到漆酶氧化還原電勢、介體與底物分子結(jié)構(gòu)的影響[8],不同介體可以參與漆酶多種氧化途徑,生成不同的產(chǎn)物。已報道介體達100多種,如紫脲酸、1-羥基苯并三唑等,上述介體價格昂貴且具有潛在的毒性,尋找天然、廉價、無毒介體是當前漆酶研究的重要方面。

1.3漆酶催化的優(yōu)越性

漆酶多為糖基化酶,不易結(jié)晶,穩(wěn)定性好;氧化還原電位高(780 mV),作用底物范圍廣,可氧化多酚、二元胺、芳香胺、對苯二酚、氨基酚、芳香硫醇等,通過介體參與還可氧化非酚類物質(zhì)[9];在氧分子參與下可直接氧化底物,不需要H2O2和其他次級代謝產(chǎn)物參與,反應條件簡單[10];副產(chǎn)物只有水,對環(huán)境無污染;此外漆酶還具有分布范圍廣,屬胞外酶易于提取,作用條件溫和,安全無毒性等特性。由于上述優(yōu)越性,漆酶在食品領域具有重要的應用前景。

2　漆酶在食品領域的應用

漆酶在果汁澄清、面粉烘焙、食品在線檢測、葡萄酒釀造、食品感官改善、高附加值食品添加物生產(chǎn)等方面具有重要作用。表1列舉了近幾年漆酶在食品應用的相關文獻報道,由表1可知漆酶來源廣,在食品領域發(fā)揮重要作用。

表1　漆酶在食品工業(yè)的應用進展

2.1漆酶在果汁加工的應用

果汁中含有單寧、花青素等酚類物質(zhì),使果汁渾濁度增加、顏色加深、出現(xiàn)沉淀,高濃度單寧具有苦味,影響果汁品質(zhì)。果汁澄清可利用物理化學吸附劑,過濾技術(shù)及添加抗氧化劑等方法。明膠和膨潤土是兩種最常見的吸附劑,使用過程中破壞果汁品質(zhì);膜過濾技術(shù)在滲透過程中發(fā)生膜污染以及過濾速度的降低,影響效率[33];抗壞血酸和亞硝酸鹽作用效率低,且具有潛在危害。漆酶能夠?qū)Ｒ弧⒏咝У厝コ写蠖鄶?shù)酚類物質(zhì),一方面可使酚類物質(zhì)形成自由基,自由基形成醌類化合物,進一步反應形成多聚物而沉淀;另一方面漆酶并不會氧化破壞人體必需酪氨酸,避免果汁營養(yǎng)受到影響[34]。Lettera研究表明固定化的漆酶可以選擇性除去桔子、石榴、杏仁、桃子、櫻桃和蘋果汁中多酚物質(zhì),去除率在45%以上,而對人體有益的黃酮物質(zhì)得以保存,去除乙烯基愈創(chuàng)木酚的果汁具有更好口感[13]。新型高分子材料具有使結(jié)構(gòu)設計靈活、高效等優(yōu)點,作為漆酶固定化載體的研究越來越多。Gassara-Chatti將Phanerochaetechrysosporium固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物漆酶、錳過氧化物酶和木質(zhì)素過氧化物酶,利用丙烯酰胺-果膠固定化,考查上述酶對石榴汁和番茄汁中多酚物質(zhì)的作用效果,結(jié)果表明三種酶協(xié)同作用能顯著去除果汁的多酚物質(zhì),提高澄清度[11],但高分子材料價格昂貴,規(guī)模應用受到限制。de Souza Bezerra等采用熱降壓、酸、堿協(xié)同處理后的椰皮纖維素為載體,以乙醛酰或戊二醛為支持物固定漆酶用于蘋果汁澄清,結(jié)果表明漆酶可以脫去果汁61%±1%的顏色,降低29%±1%的渾濁度,重復利用10次后,漆酶還保留全部初始活性,實現(xiàn)了利用廉價支持物固定漆酶用于果汁澄清[12]。實驗并未對經(jīng)過兩步預處理的纖維進行更好的物理化學特征描述,也未對在蘋果汁澄清中實現(xiàn)溫和氧化、保持氧化活性的最適參數(shù)進行研究。

2.2漆酶在葡萄酒釀造的應用

葡萄酒中含有多種酚類物質(zhì),如單寧、苯乙烯酸、兒茶酚、花色素及香豆酸衍生物等影響葡萄酒穩(wěn)定性和感官性質(zhì)。葡萄酒中的多酚物質(zhì)主要來源于葡萄皮和葡萄籽,特別是葡萄籽中的單寧會直接影響感官品質(zhì)。Czyzowska等發(fā)現(xiàn)多酚物質(zhì)的含量隨著葡萄酒釀造或儲存時間的延長而減少,從而改變葡萄酒的色澤[35]。傳統(tǒng)葡萄酒酚類物質(zhì)去除的工藝有添加聚乙烯吡咯烷酮、二氧化硫、氧化劑、蛋白質(zhì)等,但上述方法不能很好地保護酒的感官特性,而且有些添加劑不易分解,會造成廢水處理困難和環(huán)境污染。漆酶可以實現(xiàn)溫和條件下去除葡萄酒中的酚類物質(zhì),同時保持葡萄酒的感官特性不變[36]。漆酶直接氧化葡萄酒中酚類物質(zhì),后者聚合后,可通過澄清工藝除去。Chawla等將漆酶通過共價鍵固定在銀/氧化鋅納米材料上,除去葡萄酒中的多酚物質(zhì),同時在線測定多酚含量變化,其具有工作電勢低、反應速度快、靈敏性高、可利用時間長且穩(wěn)定性好的優(yōu)點[25]。Juan等構(gòu)建了Lac/SNGC漆酶傳感器在線測定葡萄酒中多酚物質(zhì)含量變化,提出葡萄酒中酚類與二氧化硫的比率可作為判斷葡萄酒營養(yǎng)價值的新的參數(shù)指標[22]。Conrad等人還發(fā)現(xiàn)漆酶處理葡萄酒瓶木塞,產(chǎn)生酚類物質(zhì)具有抗菌作用,可以有效減少木塞污染[17]。由于漆酶不屬于食品添加劑,固定化漆酶必須從葡萄汁中除去并回收利用,提高固定化漆酶活性與穩(wěn)定性,實現(xiàn)無殘留催化是漆酶葡萄酒釀造應用的重要研究方向。

2.3漆酶在面粉改良的應用

提高面粉制品品質(zhì)是當前研究的重要方面,面粉蛋白改性還處于起步階段。傳統(tǒng)改性方法是加入過氧化苯甲酰、過氧化鈣、溴酸鉀等化學改良劑,但其安全性一直備受關注,如研究發(fā)現(xiàn)溴酸鉀具有潛在致癌性。漆酶能提高面團機械強度和穩(wěn)定性,降低粘性,改善機械加工性能。Labat等首次報道漆酶通過酯化阿魏酸的二聚作用交聯(lián)阿糖基木聚糖,可以增強面團的強度和穩(wěn)定性,降低粘性,改善機械加工性能[37],進而可以有效增大面包蛋糕的體積,提高均一性,防止烘焙面包塌陷。Selinheimo研究了漆酶,木聚糖酶以及二者協(xié)同聯(lián)合對面團伸展性和抗拉伸性的影響,結(jié)果表明漆酶可以使面團變硬,抗拉伸性增強,延展性減弱[38]。Cura研究認為面粉中阿魏酸可以被漆酶氧化成小分子酚類化合物,漆酶和阿魏酸組合有助于增強蛋白質(zhì)分子間交聯(lián)[39]。Flander研究了酪氨酸酶、漆酶和木聚糖酶對面筋蛋白的改性作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)酪氨酸酶催化小分子蛋白發(fā)生交聯(lián),形成大分子蛋白質(zhì),面團硬度增大,漆酶改變面團體積,但不影響硬度[18]。Brinch等曾對食品用漆酶進行毒理學研究,結(jié)果表明漆酶不會引起基因突變,沒有皮膚毒性和吸入毒性,以一定比例飼喂小鼠13周,小鼠未表現(xiàn)出不適癥狀[40]。作為添加劑用于食品工業(yè),還需對漆酶進行更全面的毒理學實驗,特別是漆酶遺傳毒性,催化產(chǎn)物的潛在毒性等方面。

2.4漆酶在食用菌栽培的應用

漆酶是食用菌生活史中必不可少的一個酶分子,對子實體的生長、發(fā)育、分化、防御,縮短食用菌生產(chǎn)周期,降低生產(chǎn)成本,提高抗菌能力等方面具有重要的意義。De Souza研究表明Pleurotuspulmonarius在其菌絲生長時向胞外分泌漆酶參與菌絲體發(fā)育[41],Sun對15種食用菌不同生長階段漆酶活性檢測發(fā)現(xiàn)食用菌的漆酶分泌與生長密切相關[20]。Montoya研究發(fā)現(xiàn)Grifolafrondosa在菌絲體增殖階段漆酶等活性迅速增加,達到最高,隨著子實體形成開始下降[42]。上述研究表明食用菌漆酶活性的增加與菌絲的快速生長以及原基的形成密切相關,菌絲在漆酶參與下扭結(jié)形成原基,并進一步發(fā)育形成。Munk研究了真菌中漆酶氧化過程的電子受體、作用底物、反應的環(huán)境,以及氧化還原電位差,通過建立木質(zhì)素模型,討論了真菌木質(zhì)化與漆酶的相關性,證明了漆酶參與木質(zhì)素降解,為食用菌生長提供營養(yǎng)[43]。因此食用菌栽培過程中添加漆酶制劑可促進菌絲生長、原基形成,縮短生產(chǎn)周期、提高產(chǎn)量。漆酶能氧化催化低分子量酚類化合物,參與細胞壁形成,在食用菌子實體防御中發(fā)揮作用,如可以降解植物中的鞣質(zhì)等化合物,在含單寧和有毒植物抗毒素的環(huán)境下保護食用菌自身,避免植物自身化合物對菌體的毒害[44],食用菌栽培時添加漆酶制劑,能夠有效抑制雜菌污染。漆酶還與真菌的色素形成有關,通過催化反應參與分生孢子色素的合成。雖然漆酶與食用菌生長正相關,通過篩選食用菌漆酶高產(chǎn)菌株、基因工程技術(shù)構(gòu)建表達載體等可達到縮短食用菌生產(chǎn)周期、提高產(chǎn)量等效果,但目前食用菌生理功能及遺傳特性對其分泌漆酶水平的影響尚不明確。

2.5漆酶在食品檢測傳感器的應用

漆酶作用底物廣泛、專一性強,是制備生物傳感器的良好原料,根據(jù)漆酶對酚類物質(zhì)的催化作用可制備出靈敏且穩(wěn)定的傳感器用于食品在線檢測。Vianello用碳二胺化學共價固定漆酶,建立了漆酶和玻碳電極的在線檢測系統(tǒng),用于檢測橄欖油磨坊廢水中的多酚物質(zhì)含量[45]。Leite通過化學修飾,利用漆酶和過氧化物酶構(gòu)建了具有協(xié)同效應的雙酶生物傳感器,可在線檢測兒茶酚胺[46]。Godoy-Navajas研究了一種利用漆酶與氧化鋱納米顆粒(Tb4O7NPs)結(jié)合的傳感器,能夠有效自動測定葡萄酒中多酚的含量[21]。Gomes等人將漆酶固定在聚醚砜膜上構(gòu)建生物傳感器,通過測定漆酶對底物的氧化催化速率實現(xiàn)對多酚類化合物的檢測[47]。Dulce建立了以咖啡酸、沒食子酸為標準物的漆酶生物傳感器對紅葡萄酒、桃紅葡萄酒、白葡萄酒中的多酚物質(zhì)含量進行在線測定,發(fā)現(xiàn)三種葡萄酒中的多酚物質(zhì)含量由紅葡萄酒到白葡萄酒的順序依次減少,且咖啡酸比沒食子酸表現(xiàn)出更高的靈敏度[48]。Ribeiro等以金作為電極,電沉積納米金修飾的漆酶作為生物傳感器,對水果中的伐蟲脒進行測量,現(xiàn)已成功應用于芒果和葡萄中伐蟲脒的測定[26]。Tortolini等人發(fā)現(xiàn)改良漆酶多壁碳納米管電極傳感器測定葡萄酒多酚物質(zhì)具有最高性能的親和力和敏感點,用沒食子酸為標準物可以檢測商業(yè)白葡萄酒和紅葡萄酒[49]。漆酶生物傳感器受到穩(wěn)定性和重現(xiàn)性較差、使用壽命短等因素制約,高效漆酶固定方法的使用、高催化性能材料的開發(fā)以及與微電子技術(shù)的聯(lián)用將會使漆酶生物傳感器在食品檢測方面發(fā)揮更重要的作用。

2.6漆酶在食品工業(yè)廢水處理的應用

漆酶能去除廢水中的酚類、非酚類物質(zhì),降解有毒性的污染物,作用條件溫和,對環(huán)境不造成二次污染。食品廢水常含有高濃度有機酚類、小分子有機酸和鹽,是工農(nóng)業(yè)污染物的重要來源之一,危害植物生長,影響土壤微生物。Mann研究發(fā)現(xiàn)橄欖壓榨廢水中小分子有機物可以作為漆酶底物,或漆酶介體,通過漆酶氧化作用為微生物生長提供營養(yǎng)的同時被除去[50]。Garcia-Zamora以殼聚糖為吸附劑,漆酶為催化劑組成廢水催化體系處理玉米粉工廠廢水,結(jié)果表明上述體系可以去除70%以上的阿魏酸及其衍生物,廢水COD降低78%以上[28]。Daassi等從腐爛的皂莢木中分離純化得到一種堿穩(wěn)定漆酶,以HBT為介體,用于處理橄欖油廠的廢水,酚類去除率和脫色率分別提高了39%和35.1%[30]。Ntougias等人從39種白腐真菌中篩選出Ganodermaaustral、G.carnosum、Pleurotuseryngii、P.ostreatus,4種對橄欖廢水中酚類物質(zhì)有很強降解能力的菌株,進一步研究發(fā)現(xiàn)漆酶和過氧化酶協(xié)同作用可以顯著去除橄欖廢水的酚類物質(zhì),脫除顏色,降低廢水毒性。不同菌種對食品廢水脫色作用機理不完全相同,Ganoderma通過去除酚類物質(zhì)實現(xiàn)對橄欖廢水的脫色作用,而P.eryngii是在漆酶參與下完成廢水褪色[32]。目前漆酶應用于食品工業(yè)廢水處理的瓶頸包括合成介體(如HBT、硅膠、氧化鋁)價格昂貴,漆酶工業(yè)產(chǎn)量低,漆酶-介體催化活性易受廢水極端pH、高離子強度、表面活性劑影響等。生物反應器的研制是漆酶應用于食品廢水處理的必要步驟,包括固定床反應器,流化床反應器,攪拌式反應器和膜反應器。流化床漆酶反應器操作簡單,但運行成本高且易造成固定化酶破碎;膜反應器易堵塞、影響處理效率。此外,上述生物反應器仍處于實驗室研制或中式階段,規(guī)模化應用報道較少。

2.7漆酶在牛奶凝膠化的應用

漆酶能使牛奶中的蛋白質(zhì)發(fā)生氧化交聯(lián),使牛奶凝膠化,改變牛奶品質(zhì),形成新的風味。Mokoonlall研究了漆酶對酸奶和奶酪蛋白質(zhì)的氧化作用,結(jié)果表明漆酶可使酸奶凝膠化,孔隙增多,黏度和保質(zhì)期不受影響[31]。Qu認為劑量是影響漆酶對牛奶氧化作用的重要因素,低劑量條件下漆酶可使蛋白發(fā)生有效交聯(lián),轉(zhuǎn)化為更高分子量的蛋白質(zhì)聚合物,蛋白質(zhì)流變學特性增強;但高劑量漆酶會使蛋白質(zhì)發(fā)生降解,破壞牛奶品質(zhì)[32]。Struch研究認為以咖啡酸為介體,漆酶使酸奶蛋白凝膠化,能有效避免加工過程中機械攪拌對酸奶質(zhì)地的破壞[51]。但目前漆酶對牛奶蛋白的氧化機理及過程尚不明確,氧化代謝產(chǎn)物及其安全性也有待于深入研究。

3　展望

漆酶以其反應條件溫和,無毒副產(chǎn)物,作用范圍廣等優(yōu)越性引起越來越多的研究,隨著“綠色工業(yè),食品安全”等理念深入人心,漆酶將在食品領域發(fā)揮越來越重要的作用。但部分漆酶為生物次級代謝產(chǎn)物,受菌株遺傳背景等因素限制,酶活力較低;產(chǎn)漆酶生物常含有多種氧化酶,分離純化步驟繁瑣;工業(yè)產(chǎn)量低,發(fā)酵周期長,生產(chǎn)成本高;催化機理及產(chǎn)物不明確;水溶性高,回收利用難;催化體系效率有待提高;介體或催化產(chǎn)物可能具有潛在毒性,作為食品添加劑使用受到限制。針對上述問題,未來應進一步篩選漆酶高產(chǎn)菌株,利用基因工程技術(shù)構(gòu)建工程菌,優(yōu)化發(fā)酵條件,開發(fā)漆酶反應器強化發(fā)酵過程,提高酶產(chǎn)量,降低生產(chǎn)成本;借鑒現(xiàn)代物理、化學分析手段,研究漆酶結(jié)構(gòu),闡明催化機理,解析催化過程;深入認知自然界漆酶催化過程,篩選天然、綠色、無毒性介體;挖掘新型天然材料,開發(fā)固定化技術(shù),利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)提高酶的活力和穩(wěn)定性,提高利用率,降低催化成本;研究漆酶催化與光化學、電化學等的耦合技術(shù),探究協(xié)同作用機理,構(gòu)建新型、綠色、高效的催化體系;進行漆酶毒理學評價及其作為食品添加劑的安全性研究,實現(xiàn)無殘留催化。

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Research progress in applications of laccase in food

ZHANG Yu,ZHAO Qian,LI Guan-hua*

(School of life science,Inner Mongolia University,Hohhot 010021,China)

Application of laccase in food is drawing more and more attention.In this paper,catalytic characteristic,the findings of laccase used in beverage procession,wine making,flour modification,edible fungi production,food online detecting,food wastewater treatment and milk gelation were reviewed in detailed.At last the prospects of laccase in food were also put forward.

laccase;food;application;catalyze

2016-03-23

張昱(1994-)，男，在讀本科生，研究方向：食品科學與工程，E-mail：18848119746@163.com。

李冠華(1984-)，男，博士，講師，研究方向：漆酶發(fā)酵，漆酶催化體系構(gòu)建，E-mail：liguamhua1984@126.com。

內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學基金項目(2015BS0201)；內(nèi)蒙古大學2014年博士引進科研啟動經(jīng)費(21400-5145138)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)17-0385-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.068